Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

De auteurs bedank Universiteit van Zuid-Denemarken open access beleid subsidies.

1. vector selectie
<ol><li>Kies een vector naar stroomafwaartse expermenteren uitvoeren. Elke vector is van toepassing voor deze 2 - en 3-staps PCR methode.</li>
	<li>Op basis van de keuze van vector, kies passende enzymen van de beperking voor het klonen.</li>
</ol>2. primer ontwerp voor site gericht mutagenese
<ol><li>Kiezen tussen ofwel de 2-step of 3-step PCR-strategie (2-step is alleen voor mutaties < 200 bp uiteinden van DNA van belang). Voor de 2-staps-PCR, gaat u naar stap 2.2 en ga na...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli:+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA.">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li><li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli.">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

Plaats-geleide mutagenese heeft een breed scala van verschillende toepassingen, en hier, representatieve resultaten van een in vivo en in vitro experiment werden opgenomen als voorbeelden van hoe te maken van biologische conclusies met behulp van de techniek. Plaats-geleide mutagenese geweest voor lang de gouden standaard voor RNA interactie studies. De sterkte van de techniek ligt in de combinatie van de invoering van de relevante mutaties met stroomafwaartse tests en experimenten (bijv. westelijke vlek of EMSA) conclus...

DNA wordt vaak genoemd de blauwdruk van een levende cel omdat alle structuren van de cel zijn gecodeerd in de opeenvolging van haar DNA. Nauwkeurige replicatie en DNA herstelmechanismes voorkomen dat slechts zeer lage tarieven van mutaties, die is van essentieel belang voor de instandhouding van de juiste functies van gecodeerde genen. Wijzigingen van de opeenvolging van DNA kunnen opeenvolgende functies op verschillende niveaus, beginnend met DNA (erkenning door de transcriptiefactoren en restrictie-enzymen), vervolgens RNA (base-paar complementariteit en secundaire structuur verbouwingen) en/of eiwit (amino zure vervangingen, weglatingen, toevoegingen of frame-verschuivingen). Terwijl vele mutaties genfunctie niet aanzienlijk beïnvloeden, kunnen sommige mutaties in het DNA grote gevolgen hebben. Plaats-geleide mutagenese is dus een waardevol instrument voor het bestuderen van het belang van specifieke DNA sites op alle niveaus.
Dit protocol beschrijft een gerichte mutagenese aanpak gebruikt om specifieke mutaties. Het protocol is gebaseerd op twee verschillende strategieën van de PCR: een 2-step of een 3-stap-PCR. De 2-staps-PCR is van toepassing als de gewenste mutatie dicht bij de 5' eindigt of het einde 3' van het DNA van belang ligt (< 200 basenparen (bp) vanaf het einde) en de 3-staps PCR geldt in alle gevallen.
In de benadering van de PCR 2-step 3 primers zijn ontworpen, waarin een reeks inleidingen is ontworpen om de DNA van belang (inleidingen 1 en 3, vooruit en achteruit, respectievelijk) te vergroten en een enkele primer is ontworpen om op te nemen van de mutatie. De invoering van de primer (primer 2) mutatie moet een omgekeerde oriëntatie als de mutatie dicht bij het 5'-eind en een voorwaartse richting ligt als de mutatie dicht bij de 3'-eind ligt. In de eerste stap van de PCR versterkt primer 1 + 2 of 2 + 3 een klein fragment dicht bij de 5' end of 3' end, respectievelijk. Het resulterende PCR product wordt dan gebruikt als een primer in stap twee met primer 1 of 3, dus wat resulteert in een PCR-product met een mutatie in het DNA van belang (figuur 1A).
In de 3-staps PCR, 4 primers zijn ontworpen, waarin een reeks inleidingen is ontworpen om de DNA van belang (inleidingen 1 en 4, vooruit en achteruit, respectievelijk) te vergroten en een reeks inleidingen is ontworpen voor het opnemen van specifieke mutaties met overlappende complementariteit (inleidingen 2 en 3, reverse en doorstuurt, respectievelijk). In stap één en twee, inleidingen 1 + 2- en 3 + 4 versterken het einde 5' en 3'. In stap drie, de resulterende PCR producten uit stap 1 en 2 worden gebruikt als sjablonen en versterkt met inleidingen 1 + 4. Het resulterende PCR product is dus het DNA van belang met de gewenste Mutatie (figuur 1B).
Terwijl de gemuteerde DNA kan worden gebruikt voor elke stroomafwaartse toepassing, wordt dit protocol beschreven hoe opnieuw het combineren van het DNA in een klonen vector. Het gebruik van klonen van vectoren heeft verschillende voordelen zoals gebruiksgemak klonen en specifieke experimentele toepassingen afhankelijk van de eigenschappen van de vector. Deze functie wordt vaak gebruikt voor RNA interactie studies. Een andere techniek voor RNA interactie studies is structurele sonderen van het RNA in complex met een andere RNA1,2 of eiwit3,4. Echter, structurele indringende wordt alleen uitgevoerd in vitro overwegende dat plaats-geleide mutagenese en latere klonen toestaan voor interactie studies in vivo.
Plaats-geleide mutagenese is uitgebreid gebruikt voor RNA interactie studies zoals hier gepresenteerd. Echter de belangrijkste met betrekking tot 2 - of 3-staps PCR-methode is van toepassing op elk stuk van DNA, en dus niet alleen beperkt tot RNA-interactie studies.
Om te illustreren de techniek en het mogelijke gebruik ervan, wordt karakterisering van regio's belangrijk voor verordening van de post-transcriptional van het mRNA, csgD, van Escherichia coli (E. coli) gebruikt. In E. coli, csgD wordt gericht door de kleine niet-coderende RNA, McaS, in samenwerking met een eiwit, Hfq, te onderdrukken van eiwit-expressie van CsgD2,4,5. De techniek wordt gebruikt voor het invoeren van mutaties voor de regio van base-paring tussen csgD en McaS, en op de site van de bindende Hfq van csgD. Het verkregen DNA wordt vervolgens gekloond in een vector geschikt voor latere experimenten. Downstream toepassingen van de techniek omvatten zowel in vivo en in vitro experimenten. Ter illustratie, voorbeeld 1 is gekenmerkt in vivo met behulp van een westelijke vlek assay en voorbeeld 2 in vitro met behulp van een kwantitatieve analyse van elektroforetische mobiliteit, shift (EMSA) wordt gekenmerkt. In beide gevallen is geïllustreerd hoe plaats-geleide mutagenese kan worden gebruikt in combinatie met andere technieken voor het maken van biologische conclusies over een gen van belang.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in het DNA te onderzoeken van de wisselwerking tussen kleine niet-coderende RNA acid (sRNA) moleculen en doel messenger RNAs (mRNAs). Daarnaast wordt plaats-geleide mutagenese gebruikt voor het toewijzen van specifieke proteïne bandplaatsen aan RNA. Een 2-stap en 3 introductie van de PCR op basis van mutaties wordt beschreven. De aanpak is relevant voor alle eiwit-RNA en RNA-RNA interactie studies. Kortom, de techniek is gebaseerd op het ontwerpen van inleidingen met de gewenste mutation(s), en door middel van 2 of 3 stappen van PCR synthese van een PCR-product met de mutatie. Het PCR-product wordt vervolgens gebruikt voor het klonen. Hier beschrijven we hoe u kunt plaats-geleide mutagenese met zowel de 2 - en 3-stap-benadering om mutaties op de sRNA, McaS en de mRNA, csgD, RNA-RNA en de RNA-eiwit interacties te onderzoeken uitvoeren. We passen deze techniek om te onderzoeken van RNA interacties; de techniek is echter die van toepassing zijn op alle mutagenese studies (bijv. DNA-eiwit interactie, aminozuur vervanging/verwijderen/toevoeging). Het is mogelijk om elke vorm van mutatie met uitzondering van niet-natuurlijke grondslagen, maar de techniek is alleen van toepassing als een PCR-product kan worden gebruikt voor downstream toepassing (bijvoorbeeld klonen en sjabloon voor verdere PCR).

Te onderzoeken van RNA interacties met betrekking tot post-transcriptional regulering van csgD, een dubbele vector setup werd gekozen: één aan de csgD express mRNA en andere kleine niet-coderende RNA, McaS uitspreken. csgD in pBAD33, oftewel een arabinose afleidbare-medium-kopie plasmide met chlooramfenicol weerstand werd gekloond en McaS werd gekloond in mini R1 pNDM220, oftewel een plasmide isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) afleidbare laag kopie ...

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in deoxyribonucleic acid (DNA). Dit protocol beschrijft hoe het te doen plaats-geleide mutagenese met een 2-step en 3-staps polymerase-kettingreactie (PCR) gebaseerde benadering, die is van toepassing op elk fragment van DNA van belang.

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Site-gerichte mutagenesis is nuttig om moleculaire interacties te bestuderen, zoals RNA-RNA, en RNA eiwit interacties. Dit protocol beschrijft hoe u op locatie gerichte mutagenesis uitvoert met een twee- of driestaps PCR-benadering. De belangrijkste voordelen van de methode zijn de diversiteit van verschillende mutaties die kunnen worden opgenomen, evenals een relatief gemak en kosten om dit te doen.Om te beginnen, gebruik maken van de wild-type DNA-sjabloon en primer paren twee, een, en twee, drie, specifiek voor 2-staps, of primer paren drie, een, en drie, vier, specifiek voor 3-staps PCR te verkrijgen PCR product een. Om PCR-producten te valideren door agarose gel elektroforese, maak een 2%agarose gel door het oplossen van twee gram agarose in 100 milliliter 1X TAE buffer, met behulp van een magnetron. Voeg ethidiumbromide toe bij een uiteindelijke concentratie van 0,5 microgram per milliliter.Gooi dan de agarose gel. Wanneer gestold, plaats het in een elektroforese eenheid. Laad een DNA-ladder van bekende grootte, en de PCR monsters gemengd met DNA laden kleurstof in putten.Voer monsters uit op 75 volt gedurende 45 minuten. En visualiseer banden op een UV-transilluminator of met een gelbeeldvormingssysteem. Zuiver vervolgens het PCR-product met een gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant en meet de concentratie van het gezuiverde DNA met een spectrofotometer.Bewaar vervolgens het gezuiverde DNA op min 20 graden Celsius in DE buffer. Om te beginnen site-directed mutagenesis met een 2-staps PCR, eerst gebruik maken van de wild-type DNA-sjabloon, dan is de primer paren twee, een en twee, twee, voor vijf primer mutaties, of primer paren twee, twee en twee, drie voor drie priment mutaties te verkrijgen PCR product twee. Valideer het PCR-product door gelelektroforese, zuiver het PCR-product en meet de concentratie zoals eerder beschreven.Gebruik dan de wild-type DNA-sjabloon en de PCR product twee als de primer, samen met primer, drie voor vijf priment mutatie, of primer twee, een voor drie priment mutatie, om PCR product drie te verkrijgen. Valideer het PCR-product door gelelektroforese, zuiver het PCR-product en meet de concentratie zoals eerder beschreven. Bewaar vervolgens het gezuiverde DNA bij min 20 graden Celsius in DE buffer.Om te beginnen site-direct mutagenesis met een 3-staps PCR, eerst gebruik maken van de wild-type DNA-sjabloon en primer paren drie, een en drie, twee om PCR product twee te verkrijgen. Gebruik de wild-type DNA-sjabloon en primerparen drie, drie en drie, vier, om PCR-product drie te verkrijgen. Gebruik de wild-type DNA-sjabloon en primer paren drie, drie en drie, vier, om PCR product drie te verkrijgen.Valideer het PCR-product door gelelektroforese, zuiver het PCR-product en meet de concentratie zoals eerder beschreven. Ten slotte gebruik maken van twee tot vijf nanogram pcr-producten twee en drie als de sjabloon samen met primer paren drie, een en drie, vier, om PCR product vier te verkrijgen. Valideer het PCR-product door gelelektroforese, zuiver het PCR-product en meet de concentratie zoals eerder beschreven.Bewaar het gezuiverde DNA bij min 20 graden Celsius in TE-buffer. In deze studie werden 2-staps en 3-stappen site-gerichte mutagenese gebruikt om RNA-interacties met betrekking tot posttrantieregatie van CsgD te onderzoeken. De wild-type CsgD werd PCR versterkt om PCR-product IA opleveren, en de wild-type mcaS werd PCR versterkt om PCR product IB opbrengst. Met behulp van een 3-staps PCR-strategie werden PCR-producten IIA en IIIA gesynthetiseerd in de eerste twee stappen, en IVA in de derde stap om mutaties in CsgD te introduceren.Ook werden in mcaS gratis site-gerichte mutaties geïntroduceerd om PCR-producten IIB, IIIB, in de eerste twee stappen en IVB in de derde stap op te leveren. Westerse vlekanalyse toonde aan dat, hoewel expressie van wild-type mcaS vertaling van wild-type CsgD voorkomt, mutaties in ofwel mcaS of CsgD de waargenomen repressie verlicht. Mutaties in zowel CsgD als mcaS verhinderen echter vertaling van CsgD.Met behulp van een 2-staps PCR-strategie werden PCR-producten IIC, IID, IIE, IIF en IIG in de eerste stap gesynthetiseerd, en PCR-producten IIIC, IIID, IIIE, IIIF en IIIG, in de tweede stap om mutaties in het gehele CsgD-DNA te introduceren. EMSA-resultaten van de HFQ-binding aan in vitro transcribed CsgD wild-type en mutant RNAs, gesynthetiseerd met behulp van PCR-producten IIIC, IIID, IIIE, IIIF en IIIG, toonden de verhoogde KD-waarden van de mutante allelen. Dit bewees dat HFQ minder efficiënt aan de mutanten kon binden.Verder heeft HFQ verschillende bindingsplaatsen op CsgD, wat blijkt uit de drie verschuivingen die worden waargenomen voor het wild-type RNA. Er worden echter slechts twee bindingsplaatsen waargenomen voor verschillende mutant-RNAs.However, only two binding sites are observed for different mutant RNAs. Zo identificeert de site-gerichte mutatiebenadering primaire en of secundaire structuren van het CsgD mRNA die belangrijk zijn voor volledige binding van HFQ.De methode voor site-directed mutagenesis hier beschreven is gebaseerd op PCR. Goede PCR-praktijken zijn daarom cruciaal voor de methode en kunnen optimalisatie vereisen om succesvol te zijn. Site-gerichte mutagenesis is alleen krachtig met alle drie de methoden zoals EMSA en Western Blotting.Andere methoden, bijvoorbeeld, omvatten verschillende structurele tests en sommige activiteit testen, en post vertaling wijziging studies.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Zeer snelle en specifieke metabolische etikettering van RNA in vivo met 4-thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snelle en kosteneffectieve RNA-extractie van rattenlelfum

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...