Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
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Die Autoren möchten University of Southern Denmark open-Access-Politik Zuschüsse zu danken.

(1) Vektorauswahl
<ol><li>Wählen Sie einen Vektor mit nachgeschalteten Experimente durchführen. Jeder Vektor ist für diese 2 - und 3-stufige PCR Methode anwendbar.</li>
	<li>Je nach Auswahl des Vektors, wählen Sie geeignete Restriktionsenzyme zum Klonen.</li>
</ol>2. besser gekleideteres Design für Website gerichtet Mutagenese
<ol><li>Entscheiden Sie sich zwischen entweder 2 oder 3-Schritt PCR-Strategie (2-Schritt gilt nur für Mutationen < 200 bp von beiden Enden der DNA des Interesses)....

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli:+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA.">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li><li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli.">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Lorenz, T. 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Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

Site-verwiesene Mutagenese hat eine breite Palette von Anwendungsmöglichkeiten, und hier, repräsentative Ergebnisse aus in-vivo und in vitro-Experiment wurden als Beispiele für biologische Schlüsse mit Hilfe der Technik aufgenommen. Site-verwiesene Mutagenese ist seit lange der goldene Standard für RNA-Wechselwirkungsstudien. Die Stärke des Verfahrens liegt in der Kombination der relevanten Mutationen mit nachgeschalteten Tests und Experimenten (z. B. western-Blot oder EMSA) Rückschlüsse auf bestimmte DNA-Website...

DNA wird oft bezeichnet als die Blaupause einer lebenden Zelle da alle Strukturen der Zelle in der Reihenfolge ihrer DNA kodiert werden. Exakte Replikation und DNA-Reparaturmechanismen sicherstellen, dass nur eine sehr geringe Raten von Mutationen auftreten, das ist wichtig für die Erhaltung der richtigen Funktionen kodiert Gene. Veränderungen der DNA-Sequenz können aufeinander folgende Funktionen auf verschiedenen Ebenen, beginnend mit DNA (Anerkennung von Transkriptionsfaktoren und Restriktionsenzyme), dann RNA (Basenpaar Komplementarität und Sekundärstruktur Veränderungen) und/oder Protein (Aminosäuren beeinflussen. saure Substitutionen, Streichungen, Ergänzungen oder Frame-Schichten). Während viele Mutationen Genfunktion nicht erheblich beeinträchtigen, können einige Mutationen in der DNA enorme Auswirkungen haben. Site-verwiesene Mutagenese ist damit ein wertvolles Instrument für die Untersuchung der Bedeutung spezifischer DNA-Standorte auf allen Ebenen.
Dieses Protokoll beschreibt einen gezielte Mutagenese-Ansatz verwendet, um bestimmte Mutationen einzuführen. Das Protokoll stützt sich auf zwei verschiedenen PCR-Strategien: eine 2-stufige oder ein 3-Stufen-PCR. Die 2-stufige PCR ist anwendbar, wenn die gewünschte Mutation in der Nähe von 5'-Ende oder der 3'-Ende der DNA von Interesse ist (< 200 Basenpaaren (bp) vom Ende) und die 3-Stufen-PCR ist in allen Fällen anwendbar.
In der 2-Schritt-PCR-Ansatz 3 Grundierungen sind so konzipiert, in denen ein Set der Zündkapseln ist konzipiert, um die DNA des Interesses (Primer 1 und 3, weiterleiten und rückgängig zu machen, beziehungsweise) verstärken und eine einheitliche Grundierung wurde entwickelt, um die Mutation zu integrieren. Die Mutation, die Einführung der Grundierung (Primer 2) sollte eine umgekehrter Orientierung haben, wenn die Mutation in der Nähe von 5'-Ende und eine nach vorne Ausrichtung, ist wenn die Mutation in der Nähe der 3'-Ende ist. Im ersten Schritt PCR verstärkt Primer 1 + 2 oder 2 + 3 ein kleines Fragment in der Nähe der 5'-Ende oder 3' Ende, beziehungsweise. Das daraus resultierende PCR-Produkt dient dann als Grundierung in Schritt 2 mit Primer 1 oder 3, wodurch sich ein PCR-Produkt mit einer Mutation in der DNA des Interesses (Abbildung 1A).
In der 3-Stufen-PCR 4 Primer dienen, in denen ein Satz von Primern ausgelegt ist, verstärken die DNA des Interesses (Primer 1 und 4, weiterleiten und rückgängig zu machen, beziehungsweise) und einen Satz von Primern wurde entwickelt, um spezifische Mutationen mit überlappenden Komplementarität zu integrieren (Primer 2 und 3, rückwärts und vorwärts, bzw.). In Schritt eins und zwei, Primer 1 + 2 und 3 + 4 der 5' und 3'-Ende zu verstärken. In Schritt drei die daraus resultierende PCR-Produkte von Schritt eins und zwei sind als Vorlage verwendet und mit Primer 1 + 4 verstärkt. So ist die resultierende PCR-Produkt die DNA des Interesses mit der gewünschten Mutation (Abbildung 1 b).
Während die mutierte DNA für alle nachgelagerten Anwendungen verwendet werden kann, beschreibt dieses Protokoll die DNA in ein Klonen Vektor neu zu kombinieren. Die Nutzung des Klonens Vektoren hat mehrere Vorteile wie einfache Klonierung und spezifische experimentelle Anwendungen abhängig von den Funktionen des Vektors. Diese Funktion wird oft für RNA-Wechselwirkungsstudien verwendet. Eine andere Technik für RNA-Wechselwirkungsstudien ist strukturelle sondieren der RNA im Komplex mit einem anderen RNA1,2 oder Protein3,4. Jedoch strukturelle sondieren in-vitro-erfolgt erst während Site-verwiesene Mutagenese und anschließende Klonen für Studien zu Wechselwirkungen in vivo ermöglichen.
Site-verwiesene Mutagenese ist beträchtlich für RNA-Wechselwirkungsstudien benutzt worden, wie hier dargestellt. Jedoch die Schlüsselmethode über 2 oder 3-Stufen-PCR gilt für jedes Stück der DNA und somit nicht nur auf RNA-Wechselwirkungsstudien beschränkt.
Um die Technik und ihre Einsatzmöglichkeiten veranschaulichen, dient der Charakterisierung der Regionen wichtig für posttranskriptionale Verordnung der mRNA, CsgD, von Escherichia coli (E. Coli). In E. Coli, CsgD zielt durch die kleine nicht-kodierende RNA, McaS, in Zusammenarbeit mit einem Protein, Hfq, Proteinexpression von CsgD2,4,5zu unterdrücken. Die Technik wird verwendet, um Mutationen der Basis-Paarung Region zwischen CsgD und McaS und der Hfq-Bindungsstelle des CsgDeinzuführen. Die erhaltenen DNA wird dann in einen Vektor geeignet für spätere Experimente geklont. Downstream-Anwendungen der Technik sind in vivo und in-vitro-Experimente. Zur Veranschaulichung Beispiel 1 zeichnet in-vivo mit einem western-Blot-Test und Beispiel 2 in-vitro-mit einem elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay (EMSA) gekennzeichnet ist. In beiden Fällen ist es illustrierte wie Site-verwiesene Mutagenese in Kombination mit anderen Techniken verwendet werden kann, zu biologischen Rückschlüsse auf ein Gen von Interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

Site-verwiesene Mutagenese ist eine Technik verwendet, um bestimmte Mutationen in der DNA zu untersuchen, die Interaktion zwischen kleine nicht-kodierende Ribonukleinsäure (sRNA) Moleküle und Ziel-Messenger-RNAs (mRNAs) einzuführen. Darüber hinaus dient die Site-verwiesene Mutagenese spezifischen Proteins Bindestellen RNA zuordnen. Eine 2- und 3-Schritt PCR-basierte Einführung von Mutationen wird beschrieben. Der Ansatz ist für alle Protein-RNA und RNA-RNA Wechselwirkungsstudien relevanten. Kurz gesagt, setzt die Technik auf Primer mit der gewünschten Auge und durch 2 oder 3 Schritte der PCR Synthese ein PCR-Produkt mit der Mutation zu entwerfen. Das PCR-Produkt wird dann zum Klonen verwendet. Hier beschreiben wir, wie auszuführenden Site-verwiesene Mutagenese mit dem 2 - und 3-Schritt-Ansatz einzuführen Mutationen die sRNA, McaS und die mRNA, CsgD, RNA-RNA und RNA-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Wir wenden diese Technik um RNA Interaktionen zu untersuchen; Allerdings ist die Technik für alle Mutagenese Studien (z. B. DNA-Protein Interaktionen, Aminosäure Substitution/löschen/hinzufügen). Es ist möglich, jede Art von Mutation mit Ausnahme von nicht natürlichen Basen einzuführen, aber die Technik ist nur anwendbar, wenn ein PCR-Produkt für nachgeschaltete Anwendung (z. B. Klonen und Vorlage für weitere PCR) verwendet werden kann.

RNA-Interaktionen bezüglich posttranskriptionale Regulierung des CsgD, untersucht eine doppelte Vektor-Setup wurde gewählt: eine CsgD zum Ausdruck bringen mRNA und eine weitere kleine nicht-kodierende RNA, McaS zum Ausdruck bringen. CsgD wurde in pBAD33, die eine Arabinose induzierbaren Medium-Kopie Plasmid mit Chloramphenicol Widerstand ist geklont und McaS in Mini R1 pNDM220, die eine Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) induzierbaren niedrigen Kopi...

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Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli

Site-verwiesene Mutagenese ist eine Technik verwendet, um bestimmte Mutationen in Desoxyribonukleinsäure (DNA) einzuführen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie die Site-verwiesene Mutagenese mit einem 2-Schritt tun und 3-Stufen-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierenden Ansatz, die auf DNA-Fragment von Interesse anwendbar ist.

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Die standortgesteuerte Mutagenese ist nützlich, um molekulare Wechselwirkungen wie RNA-RNA und RNA-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt, wie standortgesteuerte Mutagenese mit einem zwei- oder dreistufigen PCR-Ansatz durchgeführt werden. Die Hauptvorteile der Methode sind die Vielfalt der verschiedenen Mutationen, die integriert werden können, sowie eine relative Leichtigkeit und Kosten dafür.Verwenden Sie zunächst die Wildtyp-DNA-Vorlage und die Primerpaare zwei, eins und zwei, drei, spezifisch für 2-Schritte- oder Primerpaare drei, eins und drei, vier, spezifisch für 3-Stufige PCR, um PCR-Produkt eins zu erhalten. Um PCR-Produkte durch Agarose-Gel-Elektrophorese zu validieren, machen Sie ein 2%Agarose-Gel, indem Sie zwei Gramm Agarose in 100 Milliliter 1x TAE-Puffer mit einem Mikrowellenherd auflösen. Fügen Sie Ethidiumbromid bei einer Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.Dann das Agarose-Gel gießen. Wenn Sie erstarrt sind, legen Sie es in eine Elektrophoreseeinheit. Laden Sie eine DNA-Leiter von bekannter Größe, und die PCR-Proben gemischt mit DNA-Ladefarbstoff in Brunnen.Führen Sie Proben bei 75 Volt für 45 Minuten. Und visualisieren Sie Bänder auf einem UV-Transilluminator oder mit einem Gel-Bildgebungssystem. Als nächstes reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Gel-Extraktionskit nach dem Herstellerprotokoll und messen Sie die Konzentration der gereinigten DNA mit einem Spektralphotometer.Dann lagern Sie die gereinigte DNA bei minus 20 Grad Celsius im TE-Puffer. Um mit einer 2-stufigen PCR-Datei zu beginnen, verwenden Sie zunächst die Wildtyp-DNA-Vorlage, dann paart die Grundierung zwei, eins und zwei, zwei, für fünf Primermutationen oder Primerpaare zwei, zwei und zwei, drei für drei Primentmutationen, um PCR-Produkt zwei zu erhalten. Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben.Verwenden Sie dann die Wild-Typ-DNA-Vorlage und das PCR-Produkt zwei als Primer, zusammen mit Primer zwei, drei für fünf Priment-Mutation, oder Primer zwei, eine für drei Priment-Mutation, um PCR-Produkt drei zu erhalten. Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben. Dann speichern Sie die gereinigte DNA bei minus 20 Grad Celsius im TE-Puffer.Um die standortdirekte Mutagenese mit einer 3-stufigen PCR zu beginnen, verwenden Sie zunächst die Wildtyp-DNA-Vorlage und die Primerpaare drei, eins und drei, zwei, um PCR-Produkt zwei zu erhalten. Verwenden Sie die Wild-Typ-DNA-Vorlage und Primer-Paare drei, drei und drei, vier, um PCR-Produkt drei zu erhalten. Verwenden Sie die Wild-Typ-DNA-Vorlage und Primer-Paare drei, drei und drei, vier, um PCR-Produkt drei zu erhalten.Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben. Schließlich verwenden Sie zwei bis fünf Nanogramm pcR-Produkte zwei und drei als Vorlage zusammen mit Primer-Paare drei, eins und drei, vier, um PCR-Produkt vier zu erhalten. Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben.Bewahren Sie die gereinigte DNA bei minus 20 Grad Celsius im TE-Puffer auf. In dieser Studie wurden 2-stufige und 3-stufige standortgesteuerte Mutagenese verwendet, um RNA-Wechselwirkungen in Bezug auf die posttranskriptionelle Regulation von CsgD zu untersuchen. Die Wild-Typ CsgD wurde PCR verstärkt, um PCR-Produkt IA zu erhalten, und der Wild-Typ mcaS wurde PCR verstärkt, um PCR-Produkt IB zu erhalten. Mit einer 3-stufigen PCR-Strategie wurden die PCR-Produkte IIA und IIIA in den ersten beiden Schritten und IVA im dritten Schritt zur Einführung von Mutationen in CsgD synthetisiert.In ähnlicher Weise wurden in mcaS kostenlose standortgesteuerte Mutationen eingeführt, um pcR-Produkte IIB, IIIB in den ersten beiden Schritten und IVB im dritten Schritt zu erhalten. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expression von Wildtyp mcaS zwar die Übersetzung von Wildtyp CsgD verhindert, Mutationen in mcaS oder CsgD jedoch die beobachtete Unterdrückung lindern. Mutationen in CsgD und mcaS verhindern jedoch die Übersetzung von CsgD.Mit Einer zweistufigen PCR-Strategie wurden die PCR-Produkte IIC, IID, IIE, IIF und IIG im ersten Schritt synthetisiert, und die PCR-Produkte IIIC, IIID, IIIE, IIIF und IIIG wurden im zweiten Schritt zur Einführung von Mutationen in die gesamte CsgD-DNA synthetisiert. DIE EMSA-Ergebnisse der HFQ-Bindung an in vitro transkribierte CsgD-Wildtyp- und mutierte RNAs, die mit PCR-Produkten IIIC, IIID, IIIE, IIIF und IIIG synthetisiert wurden, zeigten die erhöhten KD-Werte der mutierten Allele. Dies bewies, dass HFQ weniger effizient an die Mutanten binden konnte.Darüber hinaus hat HFQ mehrere Bindungsstellen auf CsgD, was durch die drei für die Wildtyp-RNA beobachteten Schichten gezeigt wird. Für unterschiedliche mutierte RNAs werden jedoch nur zwei Bindungsstellen beobachtet. Somit identifiziert der standortgesteuerte Mutationsansatz primäre und oder sekundäre Strukturen der CsgD mRNA, die für die vollständige Bindung von HFQ wichtig sind.Die hier beschriebene Methode für die standortgesteuerte Mutagenese beruht auf PCR. Gute PCR-Praktiken sind daher entscheidend für die Methode und erfordern möglicherweise eine Optimierung, um erfolgreich zu sein. Die standortgesteuerte Mutagenese ist nur mit allen drei Methoden wie EMSA und Western Blotting leistungsfähig.Andere Methoden umfassen z. B. verschiedene strukturelle Assays und einige Aktivitätstests sowie Studien zur Änderung von Übersetzungen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Nachweis des pH-abhängige Aktivität von<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; und<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Extrem schnelle und spezifische metabolische Kennzeichnung von RNA In Vivo mit 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Schnelle und kostengünstige RNA-Extraktion von Ratten-Pankreasgewebe

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Ortsspezifische Lysin-Acetylierung von Histonen zur Nukleosomen-Rekonstitution mit genetischer Codeerweiterung bei Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...