Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

लेखक दक्षिणी डेनमार्क ओपन एक्सेस पॉलिसी अनुदान के विश्वविद्यालय को धंयवाद देना चाहूंगा ।

1. वेक्टर चयन
<ol><li>के साथ बहाव प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक सदिश चुनें । किसी भी वेक्टर इस 2-और 3-कदम पीसीआर विधि के लिए लागू है ।</li>
	<li>सदिश की पसंद के आधार पर, क्लोनिंग के लिए उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइमों का ?...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli:+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA.">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li><li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli.">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

साइट निर्देशित mutagenesis विभिंन अनुप्रयोगों की एक व्यापक सरणी है, और यहां, एक vivo में और एक विट्रो प्रयोग में से प्रतिनिधि परिणाम कैसे जैविक तकनीक का उपयोग कर निष्कर्ष बनाने के लिए के उदाहरण के रूप में शामिल थ?...

डीएनए अक्सर सेल के सभी संरचनाओं इसके डीएनए के अनुक्रम में इनकोडिंग रहे हैं के बाद से एक जीवित कोशिका के खाका के रूप में जाना जाता है । सटीक प्रतिकृति और डीएनए मरंमत तंत्र सुनिश्चित करें कि उत्परिवर्तनों के केवल बहुत कम दर हो, जो कोडित जीन के सही कार्यों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । डीएनए अनुक्रम के परिवर्तन डीएनए (प्रतिलेखन कारकों और प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा मांयता) के साथ शुरू विभिन्न स्तरों पर क्रमिक कार्यों को प्रभावित कर सकते हैं, तो आरएनए (आधार जोड़ी complementarity और माध्यमिक संरचना परिवर्तन) और/या प्रोटीन (अमीनो एसिड प्रतिस्थापन, विलोपन, परिवर्धन या फ्रेम-पाली) । जबकि कई उत्परिवर्तनों जीन समारोह काफी प्रभावित नहीं है, डीएनए में कुछ उत्परिवर्तनों भारी निहितार्थ हो सकते हैं । इस प्रकार, साइट निर्देशित mutagenesis सभी स्तरों पर विशिष्ट डीएनए साइटों के महत्व का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक लक्षित mutagenesis विशिष्ट उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण । प्रोटोकॉल दो अलग पीसीआर रणनीतियों पर निर्भर करता है: एक 2 कदम या एक 3-कदम पीसीआर । 2-कदम पीसीआर अगर वांछित उत्परिवर्तन के करीब है या तो 5 ' अंत या ब्याज के डीएनए के 3 ' अंत (< 200 आधार जोड़े (बीपी) के अंत से) और 3 कदम पीसीआर सभी मामलों में लागू है ।
2-कदम पीसीआर दृष्टिकोण में, 3 प्राइमरों डिजाइन किए हैं, जिसमें प्राइमरों के एक सेट के लिए ब्याज (प्राइमरों 1 और 3, आगे और रिवर्स, क्रमशः) के डीएनए बढ़ाना डिज़ाइन किया गया है, और एक ही किताब उत्परिवर्तन शामिल बनाया गया है । इस उत्परिवर्तन शुरू प्राइमर (प्राइमर 2) एक रिवर्स अभिविंयास अगर उत्परिवर्तन है 5 ' अंत और एक आगे अभिविंयास के करीब है अगर उत्परिवर्तन ' 3 अंत के करीब है चाहिए । पहली पीसीआर चरण में, प्राइमर 1 + 2 या 2 + 3 क्रमशः 5 ' अंत या 3 ' अंत करने के लिए करीब एक छोटा सा टुकड़ा को परिलक्षित करता है । परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पाद तो प्राइमर 1 या 3 के साथ कदम दो में एक किताब के रूप में प्रयोग किया जाता है, इस प्रकार ब्याज के डीएनए में उत्परिवर्तन के साथ एक पीसीआर उत्पाद में जिसके परिणामस्वरूप (आंकड़ा 1a) ।
3-चरण पीसीआर में 4 प्राइमरों डिजाइन किए हैं, जिसमें प्राइमरों के एक सेट के लिए ब्याज (प्राइमरों 1 और 4, आगे और रिवर्स, क्रमशः) के डीएनए बढ़ाना डिज़ाइन किया गया है और प्राइमरों का एक सेट अतिव्यापी complementarity के साथ विशिष्ट उत्परिवर्तनों को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है (प्राइमरों 2 और 3, रिवर्स और आगे, क्रमशः) । चरण में एक और दो, प्राइमरों 1 + 2 और 3 + 4 बढ़ाना 5 ' और 3 ' अंत । चरण तीन में, परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पादों से कदम एक और दो के रूप में उपयोग किया जाता है टेंपलेट्स और प्राइमरों के साथ प्रवर्धित 1 + 4 । इस प्रकार, परिणामी पीसीआर उत्पाद वांछित उत्परिवर्तन (आंकड़ा 1b) के साथ ब्याज की डीएनए है ।
जबकि रूपांतरित डीएनए किसी भी बहाव आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे फिर से एक क्लोनिंग वेक्टर में डीएनए गठबंधन । क्लोनिंग वैक्टर के उपयोग के कई फायदे है जैसे क्लोनिंग और विशिष्ट प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की सुविधाओं के आधार पर सदिश की आसानी के रूप में । इस सुविधा को अक्सर आरएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए प्रयोग किया जाता है । आरएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए एक और तकनीक एक और आरएनए1,2 या प्रोटीन3,4के साथ परिसर में आरएनए की संरचनात्मक जांच है । हालांकि, संरचनात्मक जांच केवल इन विट्रो में किया जाता है, जबकि साइट-निर्देशित mutagenesis और बाद में क्लोनिंग vivo में बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं ।
साइट निर्देशित mutagenesis बड़े पैमाने पर यहां प्रस्तुत के रूप में आरएनए संपर्क अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, 2-या 3-चरणीय पीसीआर के संबंध में प्रमुख विधि डीएनए के किसी भी टुकड़े पर लागू होती है, और इस प्रकार केवल आरएनए-इंटरैक्शन अध्ययनों तक ही सीमित नहीं है ।
उदाहरण देना करने के लिए तकनीक और इसके संभव का उपयोग करता है, के लिए महत्वपूर्ण क्षेत्रों के लक्षण वर्णन के बाद transcriptional विनियमन के mRNA, csgD, के ई कोलाई (ई. कोलाई) किया जाता है । ई. कोलाई में, csgD एक प्रोटीन के साथ सहयोग में छोटे गैर कोडिंग आरएनए, McaS, द्वारा लक्षित है, Hfq, csgD2,4,5के प्रोटीन दमन करने के लिए । तकनीक csgD और McaS के बीच आधार बाँधना क्षेत्र के लिए उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और csgDके Hfq बंधन साइट के लिए । प्राप्त डीएनए तो एक वेक्टर में बाद में प्रयोगों के लिए उपयुक्त क्लोन है । तकनीक के बहाव अनुप्रयोगों में vivo और इन विट्रो प्रयोगों में दोनों शामिल हैं । उदाहरण के लिए, एक पश्चिमी दाग परख और 2 उदाहरण का उपयोग कर vivo में विशेषता है एक electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA) का उपयोग कर इन विट्रो में विशेषता है । दोनों ही मामलों में, यह कैसे साइट निर्देशित mutagenesis अंय तकनीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए ब्याज की एक जीन के बारे में जैविक निष्कर्ष सचित्र है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

साइट निर्देशित mutagenesis एक तकनीक के डीएनए में विशिष्ट उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए छोटे गैर कोडिंग ribonucleic एसिड (sRNA) अणुओं और लक्ष्य दूत RNAs (mRNAs) के बीच बातचीत की जांच का इस्तेमाल किया है । इसके अलावा, साइट निर्देशित mutagenesis आरएनए के लिए विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी साइटों को मैप करने के लिए प्रयोग किया जाता है । उत्परिवर्तनों के एक 2 कदम और 3 कदम पीसीआर आधारित परिचय वर्णित है । यह दृष्टिकोण सभी प्रोटीन-आरएनए और आरएनए-आरएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए प्रासंगिक है । संक्षेप में, तकनीक वांछित उत्परिवर्तन (ओं) के साथ प्राइमर डिजाइनिंग पर निर्भर करता है, और पीसीआर के 2 या 3 कदम के माध्यम से उत्परिवर्तन के साथ एक पीसीआर उत्पाद synthesizing । इसके बाद क्लोनिंग के लिए पीसीआर प्रोडक्ट का इस्तेमाल किया जाता है । यहां, हम वर्णन कैसे साइट प्रदर्शन करने के लिए दोनों 2 और 3 कदम दृष्टिकोण को sRNA, McaS, और mRNA, csgD, आरएनए-आरएनए और आरएनए-प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए उत्परिवर्तनों परिचय के साथ mutagenesis का निर्देशन किया । हम आरएनए बातचीत की जांच करने के लिए इस तकनीक लागू; हालांकि, तकनीक सभी mutagenesis अध्ययन करने के लिए लागू है (जैसे, डीएनए प्रोटीन बातचीत, एमिनो एसिड प्रतिस्थापन// यह गैर प्राकृतिक ठिकानों के अलावा उत्परिवर्तन के किसी भी प्रकार का परिचय संभव है, लेकिन तकनीक केवल लागू है अगर एक पीसीआर उत्पाद बहाव आवेदन (जैसे, क्लोनिंग और आगे पीसीआर के लिए टेंपलेट) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

csgD के बाद transcriptional विनियमन के बारे में आरएनए बातचीत की जांच करने के लिए , एक डबल वेक्टर सेटअप चुना गया था: एक csgD mRNA और एक और छोटे गैर कोडिंग आरएनए, McaS व्यक्त करने के लिए व्यक्त करने के लिए । csgD</e...

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Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

साइट-निर्देशित Mutagenesis इन विट्रो में और Vivo प्रयोगों उदाहरण में आरएनए बातचीत के साथ ई कोलाई

साइट निर्देशित mutagenesis एक तकनीक को deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) में विशिष्ट उत्परिवर्तनों परिचय प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे साइट करने के लिए-एक 2 कदम और 3 कदम पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) आधारित दृष्टिकोण है, जो ब्याज की किसी भी डीएनए टुकड़ा करने के लिए लागू है के साथ mutagenesis का निर्देशन किया ।

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

साइट निर्देशित म्यूटेनेसिस आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, जैसे आरएनए-आरएनए, और आरएनए प्रोटीन इंटरैक्शन। यह प्रोटोकॉल दो या 3-चरण पीसीआर दृष्टिकोण के साथ साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस का प्रदर्शन करने का तरीका बताता है। विधि के मुख्य फायदे विभिन्न उत्परिवर्तनों की विविधता है जिसे शामिल किया जा सकता है, साथ ही ऐसा करने के लिए एक सापेक्ष आसानी और लागत भी है।शुरू करने के लिए, पीसीआर उत्पाद एक प्राप्त करने के लिए 3-चरण पीसीआर के लिए जंगली प्रकार के डीएनए टेम्पलेट और प्राइमर जोड़े दो, एक, और दो, तीन, 2-चरण के लिए विशिष्ट, या प्राइमर जोड़े तीन, एक और तीन, चार, विशिष्ट का उपयोग करें। एगर उठे हुए जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पीसीआर उत्पादों को मान्य करने के लिए, माइक्रोवेव ओवन का उपयोग करके, 1X TAE बफर के 100 मिलीलीटर में दो ग्राम एग्राडॉइंग को भंग करके 2% एगरल्ड जेल बनाएं। 0.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर एथिडियम ब्रोमाइड जोड़ें।फिर एगर उठे जेल डाली। जम जाने पर इसे इलेक्ट्रोफोरेसिस यूनिट में रखें। ज्ञात आकार की एक डीएनए सीढ़ी लोड, और पीसीआर नमूनों कुओं में डीएनए लोडिंग डाई के साथ मिश्रित ।45 मिनट तक 75 वोल्ट पर नमूने चलाएं। और एक यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर पर या जेल इमेजिंग सिस्टम के साथ बैंड की कल्पना करें। इसके बाद, निर्माताओं प्रोटोकॉल के अनुसार एक जेल निष्कर्षण किट के साथ पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ शुद्ध डीएनए की एकाग्रता को मापें।फिर शुद्ध डीएनए को ते बफर में माइनस 20 सेल्सियस पर स्टोर करें । एक 2 कदम पीसीआर के साथ साइट निर्देशित mutagenesis शुरू करने के लिए, पहले जंगली प्रकार डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करें, तो प्राइमर जोड़े दो, एक और दो, दो, पांच प्राइमर म्यूटेशन के लिए, या प्राइमर जोड़े दो, दो, और दो, तीन प्राइमेंट म्यूटेशन के लिए तीन पीसीआर उत्पाद दो प्राप्त करने के लिए । पीसीआर उत्पाद को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा मान्य करें, पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें, और पहले वर्णित अपनी एकाग्रता को मापें।फिर वाइल्ड-टाइप डीएनए टेम्पलेट और पीसीआर उत्पाद दो को प्राइमर के रूप में, एक साथ प्राइमर दो, तीन पांच प्राइमरी म्यूटेशन के लिए, या प्राइमर दो, तीन प्राइमेंट म्यूटेशन के लिए एक, पीसीआर उत्पाद तीन प्राप्त करने के लिए उपयोग करें । पीसीआर उत्पाद को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा मान्य करें, पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें, और पहले वर्णित अपनी एकाग्रता को मापें। फिर शुद्ध डीएनए को ते बफर में शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।3-स्टेप पीसीआर के साथ साइट-डायरेक्ट म्यूटेनेसिस शुरू करने के लिए, पहले पीसीआर उत्पाद दो प्राप्त करने के लिए जंगली प्रकार के डीएनए टेम्पलेट और प्राइमर जोड़े तीन, एक और तीन, दो का उपयोग करें। पीसीआर उत्पाद तीन प्राप्त करने के लिए जंगली प्रकार के डीएनए टेम्पलेट और प्राइमर जोड़े तीन, तीन और तीन, चार का उपयोग करें। पीसीआर उत्पाद तीन प्राप्त करने के लिए जंगली प्रकार के डीएनए टेम्पलेट और प्राइमर जोड़े तीन, तीन और तीन, चार का उपयोग करें।पीसीआर उत्पाद को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा मान्य करें, पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें, और पहले वर्णित अपनी एकाग्रता को मापें। अंत में पीसीआर उत्पाद चार प्राप्त करने के लिए दो से पांच नैनोग्राम पीसीआर उत्पादों का उपयोग दो और तीन के साथ-साथ प्राइमर जोड़े तीन, एक और तीन, चार के साथ टेम्पलेट के रूप में करें । पीसीआर उत्पाद को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा मान्य करें, पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें, और पहले वर्णित अपनी एकाग्रता को मापें।शुद्ध डीएनए को ते बफर में माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें । इस अध्ययन में, सीएसजीडी के पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल नियमन के बारे में आरएनए इंटरैक्शन की जांच करने के लिए 2-स्टेप साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस का उपयोग किया गया था। वाइल्ड-टाइप सीएसजीडी पीसीआर उत्पाद आईए को उपज देने के लिए पीसीआर परिलक्षित किया गया था, और जंगली प्रकार के एमसीएएस पीसीआर उत्पाद आईबी को उपज देने के लिए पीसीआर परिलक्षित किया गया था। 3-स्टेप पीसीआर रणनीति का उपयोग करके, पीसीआर उत्पादों आईआईए और आईआईए को पहले दो चरणों में संश्लेषित किया गया था, और सीएसजीडी में म्यूटेशन शुरू करने के लिए तीसरे चरण में IVA।इसी तरह एमसीएएस में मानार्थ साइट निर्देशित म्यूटेशन शुरू किए गए थे ताकि पहले दो चरणों में पीसीआर उत्पाद आईआईबी, आईआईबी और तीसरे चरण में आईवीबी को पेश किया जा सके । पश्चिमी दाग विश्लेषण से पता चला है कि जबकि जंगली प्रकार mcaS की अभिव्यक्ति जंगली प्रकार CsgD के अनुवाद को रोकता है, या तो mcaS या CsgD में उत्परिवर्तन मनाया दमन को कम करता है । हालांकि सीएसजीडी और एमसीएस दोनों में म्यूटेशन सीएसजीडी के अनुवाद को रोकते हैं।2-स्टेप पीसीआर रणनीति का उपयोग करते हुए, पीसीआर उत्पाद आईआईसी, आईआईडी, आईईआईई, आईआईएफ और आईआईजी, पहले चरण में संश्लेषित किए गए थे, और पीसीआर उत्पाद आईआईआईसी, आईआईआईडी, आईआईएफ और आईआईजी, दूसरे चरण में पूरे सीएसजीडी डीएनए में म्यूटेशन पेश करने के लिए। एचएफक्यू के ईएमएसए परिणाम इन विट्रो लिखित CsgD जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती RNAs के लिए बाध्यकारी, पीसीआर उत्पादों IIIC, IIID, IIIE, IIIF, और IIIG का उपयोग कर संश्लेषित, उत्परिवर्ती alleles के बढ़े हुए केडी मूल्यों को दिखाया । इससे यह साबित हो गया कि एचएफक्यू म्यूटेंट को कम कुशलता से बांध सकता है।इसके अलावा एचएफक्यू में सीएसजीडी पर कई बाध्यकारी साइटें हैं, जो जंगली प्रकार के आरएनए के लिए देखी गई तीन पारियों द्वारा दिखाई जाती हैं। हालांकि, विभिन्न उत्परिवर्ती आरएनए के लिए केवल दो बाध्यकारी साइटें देखी जाती हैं। इस प्रकार साइट निर्देशित उत्परिवर्तनीय दृष्टिकोण सीएसजीडी एमआरएनए की प्राथमिक और या माध्यमिक संरचनाओं की पहचान करता है जो एचएफक्यू के पूर्ण बाध्यकारी के लिए महत्वपूर्ण हैं।साइट निर्देशित mutagenesis के लिए विधि यहां वर्णित पीसीआर पर निर्भर करता है । अच्छी पीसीआर प्रथाएं विधि के लिए महत्वपूर्ण हैं और सफल होने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। साइट निर्देशित म्यूटेनेसिस केवल तीनों तरीकों जैसे ईएमएसए और पश्चिमी ब्लॉटिंग के साथ शक्तिशाली है।उदाहरण के लिए, अन्य तरीकों में विभिन्न संरचनात्मक परख और कुछ गतिविधि परख, और अनुवाद संशोधन अध्ययन के बाद शामिल हैं।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

के पीएच निर्भर गतिविधि का पता लगाने<em&gt; कोलाई</em&gt; निगरानी HdeB<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

ठहराव की बहुतायत और चार्ज करने के स्तर के हस्तांतरण RNAs में ई कोलाई

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

एक्स-रे क्रि और भौतिक तकनीकों द्वारा Immunoglobulin गुना के साथ नच का लक्षण वर्णन

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

ट्रांसक्रिप्शन में प्रोटीन-प्रोटिन इंटरेक्शन के अध्ययन के लिए बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीआईएलआई) का अनुप्रयोग

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

एमीलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा मस्तिष्क माइटोकोंड्रिया के साथ और झिल्ली permeabilization के साथ बातचीत

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

4-Thiouracil (Ers4tU) के साथ Vivo में आरएनए की अत्यंत तेजी से और विशिष्ट मेटाबोलिक लेबलिंग

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

चूहा अग्नाशय के ऊतकों की तेजी से और लागत प्रभावी आरएनए निष्कर्षण

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

एस्चेरिचिया कोलाई में जेनेटिक कोड विस्तार का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम पुनर्गठन के लिए हिस्टोन्स की साइट विशिष्ट लाइसिन एसिटिलेशन

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...