Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
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Gli autori vorrei ringraziare borse di studio di Università della Danimarca meridionale accesso aperto politica.

1. selezione vettoriale
<ol><li>Scegliere un vettore per eseguire esperimenti a valle con. Ogni vettore è applicabile per questo metodo PCR 2 - e 3-step.</li>
	<li>Sulla scelta del vettore di base, scegliere enzimi di restrizione appropriati per la clonazione.</li>
</ol>2. primer design per sito diretto mutagenesi
<ol><li>Decidere tra la strategia PCR 2-passaggio o 3 (2-step è solo per le mutazioni < 200 bp da entrambe le estremità del DNA di interesse). Per la PCR 2-step, andare al passagg...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. 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Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

Mutagenesi sito-diretta ha una vasta gamma di applicazioni diverse, e qui, risultati rappresentativi da un esperimento in vitro ed una in vivo sono stati inclusi come esempi di come fare conclusioni biologici usando la tecnica. Mutagenesi sito-diretta ha per lungo tempo lo standard d'oro per gli studi di interazione di RNA. La forza della tecnica risiede nella combinazione di introdurre rilevanti mutazioni con dosaggi a valle ed esperimenti (ad es., macchia occidentale o EMSA) per trarre conclusioni sui siti specifici de...

DNA è spesso definito come il progetto di una cellula vivente, poiché tutte le strutture della cellula sono codificate nella sequenza del suo DNA. Replica esatta e meccanismi di riparazione del DNA garantiscono che solo molto bassi tassi di mutazioni si verificano, che è essenziale per sostenere le funzioni corrette dei geni codificati. Modifiche della sequenza del DNA possono influire sulle successive funzioni a diversi livelli a partire con il DNA (riconoscimento di fattori di trascrizione e gli enzimi di limitazione), poi RNA (base-accoppiamenti complementarità e alterazioni di struttura secondaria) e/o proteine (aminoacidi acide sostituzioni, omissioni, aggiunte o telaio-turni). Mentre molte mutazioni non influiscano significativamente funzione del gene, alcune mutazioni nel DNA possono avere implicazioni enormi. Così, la mutagenesi sito-diretta è uno strumento prezioso per studiare l'importanza dei siti specifici di DNA a tutti i livelli.
Questo protocollo descrive un approccio di mutagenesi mirata utilizzato per introdurre mutazioni specifiche. Il protocollo si basa su due diverse strategie di PCR: un passaggio 2 o un 3-passo PCR. La PCR 2-step è applicabile se la mutazione desiderata è vicino l'estremità 5' o estremità 3' del DNA di interesse (< 200 paia di basi (bp) dalla fine) e la PCR-step 3 è applicabile in tutti i casi.
L'approccio di PCR 2-step, 3 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 3, avanti e indietro, rispettivamente) e un singolo primer è progettato per incorporare la mutazione. La mutazione introducendo primer (primer 2) dovrebbe avere un orientamento inverso se la mutazione è vicino l'estremità 5' e un orientamento anteriore se la mutazione è vicino all'estremità 3'. Nel primo passaggio PCR, primer 1 + 2 o 2 + 3 amplifica un piccolo frammento vicino l'estremità 5' o 3' estremità, rispettivamente. Il prodotto PCR risultante viene quindi utilizzato come primer nel passaggio due con primer 1 o 3, con il risultato di un prodotto PCR con una mutazione nel DNA di interesse (Figura 1A).
Nella PCR 3 fasi, 4 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 4, avanti e indietro, rispettivamente) e un set di primer è progettato per incorporare specifiche mutazioni con sovrapposizione di complementarità (primer, 2 e 3, invertire e inoltrare, rispettivamente). Al passo uno e due, primer 1 + 2 e 3 + 4 amplificare l'estremità 5' e 3'. Nel passaggio 3, i prodotti PCR ottenuti da passo uno e due sono utilizzati come modelli e amplificati con i primer 1 + 4. Così, il prodotto PCR risultante è il DNA di interesse con la mutazione desiderata (Figura 1B).
Mentre il DNA mutato può essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle, questo protocollo viene descritto come combinare nuovamente il DNA in un vettore di clonazione. L'uso di vettori di clonazione ha diversi vantaggi come la facilità di clonazione e applicazioni sperimentali specifiche a seconda delle caratteristiche del vettore. Questa caratteristica viene spesso utilizzata per studi di interazione di RNA. Un'altra tecnica per studi di interazione di RNA è strutturale di sondaggio del RNA in complesso con un altro RNA1,2 o proteina3,4. Tuttavia, sondando strutturale viene eseguita solo in vitro mentre mutagenesi sito-diretta e successiva clonazione permettono per studi di interazione in vivo.
Mutagenesi sito-diretta è stato ampiamente utilizzata per studi di interazione di RNA come presentato qui. Tuttavia, il metodo chiave per quanto riguarda 2 - o 3-step PCR è applicabile a qualsiasi pezzo di DNA e così non solo limitato agli studi di RNA-interazione.
Per esemplificare la tecnica e i suoi possibili usi, caratterizzazione delle regioni importanti per la regolazione post-trascrizionale del mRNA, csgD, di Escherichia coli (Escherichia coli) è usato. In e. coli, csgD è mirato di piccolo RNA non codificanti, McaS, in collaborazione con una proteina, Hfq, di reprimere l'espressione della proteina di CsgD2,4,5. La tecnica è utilizzata per introdurre le mutazioni nella regione di appaiamento tra csgD e McaS e per il sito di legame Hfq di CDLS. Il DNA ottenuto è quindi clonato in un vettore adatto per esperimenti successivi. Applicazioni a valle della tecnica includono gli esperimenti sia in vitro che in vivo. Per l'illustrazione, esempio 1 è caratterizzata in vivo usando un'analisi di western blot ed esempio 2 è caratterizzato in vitro utilizzando un'analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA). In entrambi i casi, è illustrata come mutagenesi sito-può essere utilizzata in combinazione con altre tecniche per rendere biologici conclusioni circa un gene di interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni nel DNA per studiare l'interazione tra piccole molecole di acido ribonucleico (sRNA) di non-codificazione e destinazione RNA messaggeri (mRNA). Inoltre, mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per mappare i siti di legame della proteina specifica a RNA. Una 2-step e step 3 Introduzione PCR basata delle mutazioni è descritto. L'approccio è rilevante per tutte le proteine-RNA e studi di interazione di RNA-RNA. In breve, la tecnica si basa sulla progettazione degli iniettori con la mutazione desiderata e attraverso 2 o 3 passaggi di PCR sintetizzando un prodotto PCR con la mutazione. Il prodotto PCR viene quindi utilizzato per la clonazione. Qui, descriviamo come eseguire mutagenesi sito-diretta con entrambi l'approccio 2 - e 3-step per introdurre mutazioni il sRNA, McaS e il mRNA, csgD, per studiare le interazioni RNA-proteine e RNA-RNA. Applichiamo questa tecnica per studiare le interazioni RNA; Tuttavia, la tecnica è applicabile a tutti gli studi di mutagenesi (ad es., interazioni della DNA-proteina, amminoacido sostituzione/eliminazione/aggiunta). È possibile introdurre qualsiasi tipo di mutazione tranne per basi non naturali, ma la tecnica è applicabile solo se un prodotto PCR può essere usato per applicazione a valle (ad es., clonazione e modello per ulteriore PCR).

Per indagare le interazioni RNA per quanto riguarda la regolazione post-trascrizionale di CDLS, è stata scelta una configurazione doppia vettoriale: uno per esprimere la csgD mRNA e un altro per esprimere il piccolo RNA non codificante, McaS. CDLS è stato clonato in pBAD33, che è un plasmide di medio-copia inducibile di arabinosio con resistenza al cloramfenicolo e McaS è stato clonato in mini pNDM220 R1, che è un plasmide di viscoelastica copia basso isopr...

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Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli

Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni in acido deossiribonucleico (DNA). Questo protocollo viene descritto come eseguire la mutagenesi sito-diretta con un passaggio 2 e 3-passo catena della polimerasi (PCR) base di approccio, che è applicabile a qualsiasi frammento di DNA di interesse.

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

La mutagenesi site-directed è utile per studiare le interazioni molecolari, come l'RNA-RNA e le interazioni con le proteine dell'RNA. Questo protocollo descrive come eseguire la mutagenesi diretta dal sito con un approccio PCR in due o 3 step. I principali vantaggi del metodo sono la diversità delle diverse mutazioni che possono essere incorporate, nonché una relativa facilità e costo per farlo.Per iniziare, usa il modello di DNA di tipo selvatico e le coppie primer due, una e due, tre, specifiche per coppie di 2 step o primer tre, una e tre, quattro, specifiche per PCR in 3 step per ottenere il prodotto PCR uno. Per convalidare i prodotti PCR mediante elettroforesi in gel di agarosio, creare un gel di agarosio al 2% sciogliendo due grammi di agarosio in 100 millilitri di tampone TAE 1X, utilizzando un forno a microonde. Aggiungere bromuro di etidio ad una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro.Quindi gettare il gel di agarosio. Una volta solidificato, posizionarlo in un'unità di elettroforesi. Caricare una scala del DNA di dimensioni note e i campioni di PCR mescolati con colorante per il caricamento del DNA in pozzi.Eseguire campioni a 75 volt per 45 minuti. E visualizzare le bande su un transilluminatore UV o con un sistema di imaging in gel. Successivamente, purificare il prodotto PCR con un kit di estrazione del gel secondo il protocollo dei produttori e misurare la concentrazione del DNA purificato con uno spettrofotometro.Quindi conservare il DNA purificato a meno 20 celsius nel tampone TE. Per iniziare la mutagenesi diretta dal sito con una PCR in 2 passi, utilizzare prima il modello di DNA di tipo selvaggio, quindi il primer accoppia due, uno e due, due, per cinque mutazioni primer, o primer coppie due, due e due, tre per tre mutazioni primenti per ottenere il prodotto PCR due. Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza.Quindi usa il modello di DNA di tipo selvaggio e il prodotto PCR due come primer, insieme a primer due, tre per cinque mutazioni primenti, o primer due, uno per tre mutazioni primenti, per ottenere il prodotto PCR tre. Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza. Quindi conservare il DNA purificato a meno 20 gradi Celsius nel tampone TE.Per iniziare la mutagenesi diretta del sito con una PCR in 3 step, utilizzare prima il modello di DNA di tipo selvaggio e primer coppie tre, uno e tre, due per ottenere il prodotto PCR due. Utilizzare il modello di DNA di tipo selvatico e le coppie primer tre, tre e tre, quattro, per ottenere il prodotto PCR tre. Utilizzare il modello di DNA di tipo selvaggio e primer coppie tre, tre e tre, quattro, per ottenere il prodotto PCR tre.Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza. Infine utilizzare da due a cinque nanogrammi di prodotti PCR due e tre come modello insieme alle coppie primer tre, una e tre, quattro, per ottenere il prodotto PCR quattro. Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza.Conservare il DNA purificato a meno 20 gradi Celsius nel tampone TE. In questo studio, la mutagenesi diretta dal sito in 2 e 3 step è stata utilizzata per indagare le interazioni dell'RNA riguardo alla regolazione post trascrizionale del CsgD. Il CsgD di tipo selvaggio è stato amplificato pcr per produrre IA prodotto PCR, e il mcaS di tipo selvaggio è stato amplificato pcr per produrre prodotto PCR IB. Utilizzando una strategia PCR in 3 fasi, i prodotti PCR IIA e IIIA sono stati sintetizzati nei primi due passaggi e IVA nella terza fase per introdurre mutazioni in CsgD.Allo stesso modo, mutazioni gratuite dirette dal sito sono state introdotte in mcaS per produrre prodotti PCR IIB, IIIB, nei primi due passaggi, e IVB nel terzo passaggio. L'analisi western blot ha mostrato che mentre l'espressione di mcaS di tipo selvatico impedisce la traduzione di CsgD di tipo selvaggio, mutazioni in mcaS o CsgD alleviano la repressione osservata. Tuttavia, le mutazioni sia in CsgD che in mcaS impediscono la traduzione di CsgD.Utilizzando una strategia PCR in 2 step, i prodotti PCR IIC, IID, IIE, IIF e IIG, sono stati sintetizzati nel primo passaggio e i prodotti PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG, nella seconda fase per introdurre mutazioni all'intero DNA CsgD. I risultati dell'EMSA del legame HFQ con gli RNA di tipo selvatico e mutante csgD trascritti in vitro, sintetizzati utilizzando prodotti PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG, hanno mostrato l'aumento dei valori KD degli alleli mutanti. Ciò dimostrò che il quartier generale poteva legarsi in modo meno efficiente ai mutanti.Inoltre hfq ha diversi siti di legame su CsgD, che è mostrato dai tre turni osservati per l'RNA di tipo selvaggio. Tuttavia, solo due siti di legame sono osservati per diversi RNA mutanti. Quindi l'approccio mutazionale diretto al sito identifica le strutture primarie e o secondarie dell'mRNA CsgD che sono importanti per il completo legame del quartier generale.Il metodo per la mutagenesi diretta dal sito qui descritto si basa sulla PCR. Buone pratiche pcr sono quindi cruciali per il metodo e potrebbero richiedere l'ottimizzazione per avere successo. La mutagenesi diretta dal sito è potente solo con tutti e tre i metodi come EMSA e Western Blotting.Altri metodi, ad esempio, includono vari saggi strutturali e alcuni saggi di attività, e studi di modifica post-traduzione.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

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