Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
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著者は、南デンマーク大学オープン アクセス ポリシー付与を感謝したいです。

1. ベクトルの選択
<ol><li>下流の実験を実行するベクトルを選択します。任意のベクトルは、この 2 と 3 ステップ PCR 法に適用されます。</li>
	<li>ベクトルの選択に基づき、適切な制限の酵素のクローニングのためを選択します。</li>
</ol>2. プライマー設計は、サイトを指示しました。
<ol><li>2 段または 3 段のいずれかの PCR 戦略の間に決定 (2 ステップは、突然変異だけ < 200 ...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. 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Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

サイト指示された突然変異誘発、さまざまなアプリケーションの広範な配列がありここでは、典型的な結果を in vivo と in vitro の実験からの手法を用いて生物学的結論の作り方の例として含まれていた。サイト指示された突然変異誘発は長い RNA 相互作用研究の黄金の標準をされています。技術の強みは下流の試金との遺伝子産物の機能の DNA の特定のサイトとその重要性についての結論を描?...

DNA は、セルのすべての構造は、DNA のシーケンスにエンコードから、一般に、生きている細胞の設計図と呼ばれます。正確なレプリケーションおよび DNA 修復機構は、唯一の非常に低率の突然変異が発生し、コード化された遺伝子の正しい機能を維持するために不可欠であるを確認します。DNA シーケンスの変更は、RNA (塩基対の相補性と二次構造変化) やタンパク質 (アミノ酸、DNA (転写因子と制限酵素によって認識)、始まるさまざまなレベルで連続的な機能に影響を及ぼす酸の置換、削除、追加またはフレーム シフト)。多くの突然変異は遺伝子の機能を大きく影響しません、DNA の変異の巨大な影響があります。したがって、サイト指示された突然変異誘発は、すべてのレベルで特定の DNA のサイトの重要性を研究するための貴重なツールです。
このプロトコルでは、特定の突然変異を導入するために使用対象となる突然変異誘発方法について説明します。プロトコルは、2 つの PCR 戦略: 2 ステップ、3 ステップ PCR。2 ステップ PCR は望ましい突然変異が 5' 端または興味の DNA の 3' 末端に近い場合は該当する (< 端から 200 塩基対 (bp)) と 3 ステップ PCR はすべての場合に適用されます。
2 ステップ PCR のアプローチで 3 プライマーを (プライマー 1 と 3、前方および逆引き、それぞれ)、興味の DNA を増幅するプライマーの 1 つのセットを設計、単一のプライマーは突然変異を組み込む設計されています。3' 端に近い場合は突然変異変異を 5' 末端と前方方向に近い場合 (プライマー 2) プライマーの導入変異が逆向きに必要です。最初の PCR のステップでは、プライマー 1 + 2 または 2 + 3 はそれぞれ 5' 末端もしくは 3' 末端、近くの小さな断片を増幅します。結果として得られる PCR の製品はプライマー 1 または 3、(図 1 a) の興味の DNA の変異を PCR の製品の結果を 2 つの手順でプライマーとして使用されます。
3 ステップ PCR のプライマーの 1 つのセットは (プライマー 1 と 4 は、前方および逆引き、それぞれ) 興味の DNA を増幅するため設計されています 4 プライマーが設計されています、相補性を重複で特定の突然変異を組み込むように、プライマーの 1 つのセット(プライマー 2 と 3 は逆し、転送、それぞれ)。手順 1 と 2、1 + 2、3 + 4 のプライマーが 5' と 3' 端を増幅します。ステップ 3 で結果として得られる PCR の製品からステップ 1 と 2 つのテンプレートとして使用し 1 + 4 のプライマーで増幅します。したがって、結果として得られる PCR の製品は望ましい突然変異 (図 1 b) と興味の DNA です。
変異する DNA は、任意のダウン ストリーム アプリケーションの使用できますが、このプロトコルはクローニング ベクトルに DNA を再結合する方法について説明します。クローニングの使用クローン作成の容易さなどいくつかの利点がありますとベクターの機能に応じて実験用途。この機能は RNA 相互作用研究のためよく使用されます。RNA 相互作用研究のための別のテクニックは別 RNA1,2または蛋白質3,の4との複合体の RNA の構造を探るします。ただし、構造プローブのみ実行される体外サイト指示された突然変異誘発と後続のクローニングが生体内での相互作用研究の許可。
サイト指示された突然変異誘発は、ここで示す RNA 相互作用研究のため広く使用されています。ただし、キーメソッドについて 2- または 3 ステップ PCR は DNA のどの部分に適用され、従って RNA 相互作用の研究だけでなく限られました。
技術とその用途を例示、 csgD、 エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) の mRNA の転写後調節に重要な領域の評価を使用します。エシェリヒア属大腸菌、csgDで狙われてる小さな非コーディングの RNA、岩国、Hfq、CsgD2,4、5の発現を抑制する蛋白質と協力。技術を使用して、 csgDと、岩国基地ペアリング地域とcsgDの Hfq 結合部位に変異を導入します。得られた DNA は、その後の実験に適したベクターにクローンを作成します。技術の下流のアプリケーションには、生体内および生体外での実験が含まれます。図では、例 1 の西部のしみのアッセイを用いた生体内の特徴は、例 2 は電気泳動の移動性シフト試金 (EMSA) を使用して生体外の特徴です。両方のケースでそれは図解方法サイト指示された突然変異誘発は興味の遺伝子の生物学的結論を出すために他の技術との組み合わせで使用できますです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

サイト指示された突然変異誘発は小さな非コーディング リボ核酸 (スルナ) 分子と対象のメッセンジャー Rna (Mrna) の相互作用を調査するため DNA の特定の突然変異を導入するための技術です。さらに、サイト指示された突然変異誘発は RNA 特定の蛋白質の結合サイトにマップされます。突然変異の 2 ステップ、3 ステップ PCR によって基づく概要を説明しています。アプローチはすべての蛋白質と核酸と RNA 相互作用の研究に関連します。一言で言えば、テクニックが必要な遺伝と突然変異を PCR の製品を合成 PCR の 2 または 3 の手順をプライマーの設計に依存します。PCR の製品は、クローニングのため使用されます。ここでは、両方の 2 と 3 のステップ アプローチ、スルナ、岩国、mRNA、 csgD RNA、RNA 蛋白質の相互作用を調査するために突然変異を導入するとサイト指示された突然変異誘発を実行する方法をについて説明します。RNA の相互を調査するこの手法を適用します。しかし、技術は、すべての突然変異誘発の研究 (DNA 蛋白質の相互作用、アミノ酸置換/削除/追加など) に適用されます。非天然基地を除いて突然変異のあらゆる種類を導入することが可能だが、テクニックは下流のアプリケーション (例えば、クローニングとさらに PCR のテンプレート) の PCR の製品を使用できる場合のみ。

CsgD、二重ベクトル セットアップが選ばれたの転写後調節に関する RNA 相互作用を調査する: csgDを表現する 1 つ mRNA、別の小さな非コーディングの RNA、岩国を表現します。csgDはクロラムフェニ コール耐性とアラビノース誘導媒体コピーのプラスミッドである pBAD33 に複製され、岩国はイソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 誘導低コピー プラスミ...

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Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

サイト指示された突然変異誘発は、デオキシリボ核酸 (DNA) の特定の突然変異を導入する技術です。このプロトコルは、2 ステップでサイト指示された突然変異誘発を行う方法をについて説明し、3 ステップのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) ベースのアプローチは、興味の DNA のフラグメントに適用可能であります。

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

部位特異的変異生成は、RNA-RNA、RNAタンパク質相互作用などの分子相互作用を研究するのに有用です。このプロトコルは、2つまたは3段階のPCRアプローチでサイト指向変異誘発を行う方法を説明します。この方法の主な利点は、組み込むことができる異なる突然変異の多様性と、それを行うための相対的な容易さとコストです。まず、野生型DNAテンプレートとプライマーペア2、1、2、3、またはプライマーペア3、1、および3、4、PCR産物1を得るために使用します。アガロースゲル電気泳動によるPCR産物を検証するには、電子レンジを使用して1X TAEバッファーの100ミリリットルに2グラムのアガロースを溶解して2%アガロースゲルを作ります。1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの最終濃度で臭化エチジウムを添加します。その後、アガロースゲルをキャストします。固化したら、電気泳動ユニットに入れる。既知のサイズのDNAラダーをロードし、PCRサンプルをDNAローディング染料と混合して井戸に積み込みます。75ボルトでサンプルを45分間実行します。また、UVトランイルミエータまたはゲルイメージングシステムでバンドを可視化します。次に、メーカーのプロトコルに従ってゲル抽出キットでPCR製品を精製し、分光光度計で精製されたDNAの濃度を測定します。次に、精製したDNAをマイナス20°CでTEバッファーに保存します。2ステップPCRで部位特異的変異を開始するには、まず野生型DNAテンプレートを使用し、次にプライマーペア2、1および2、2、5プライマー突然変異、またはプライマーペア2、2、および2のプライマーペアを使用して、3つのプライマー突然変異に対してPCR産物2を得る。ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。次いで、野生型DNA鋳型とPCR産物2をプライマーとして使用し、プライマー2と共に、5つのプライマー突然変異に対して3つ、またはプライマー2、3つのプライマー突然変異に対して1つ、PCR産物3を得る。ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。次に、精製したDNAをマイナス20°CでTEバッファーに保存します。3ステップPCRで部位特異的突然変異誘発を開始するには、まず野生型DNAテンプレートとプライマーペア3、1、および3、2を使用してPCR産物2を得ます。野生型DNAテンプレートとプライマーの組を3、3、および3、4を使用して、PCR産物3を得る。野生型DNAテンプレートとプライマーの組を3、3、4、4で、PCR産物3を得る。ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。最後に、2~5ナノグラムのPCR産物をテンプレートとして用い、プライマーペア3、1、3、4を用いてPCR製品4を得る。ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。精製したDNAをマイナス20°CでTEバッファーに保存します。本研究では、CsgDの転写後調節に関するRNA相互作用を調べるには、2段階および3段階の部位特異的変異誘発を用いた。野生型のCsgDをPCR増幅してPCR産物IAを生成し、野生型mcaSをPCR増幅してPCR産物IBを生成した。3段階PCR戦略を用いて、最初の2つのステップでPCR産物IIAとIIIAを合成し、第3ステップではIVAをCsgDに変異を導入した。同様に、MCASでは、最初の2つのステップでIIB、IIIB、および3番目のステップでIVBを得るために、無料の部位指向突然変異が導入されました。ウェスタンブロット分析は、野生型mcaSの発現は野生型CsgDの翻訳を妨げるが、mcaSまたはCsgDのいずれかの突然変異が観察された抑圧を緩和することを示した。しかし、CsgDとmcaSの両方の突然変異は、CsgDの翻訳を妨げる。2ステップPCR戦略を用いて、PCR産物IIC、IID、IIE、IIF、およびIIGを第1ステップで合成し、第2ステップでは、CSgD DNA全体に変異を導入する第2のステップで、IIIC、IIID、IIIE、IIIF、およびIIIGをPCR産物としました。インビトロに転写されたCSgD野生型および変異型RNAへのHFQ結合のEMSAの結果は、PCR産物IIIC、IIID、IIIE、IIIF、およびIIIGを用いて合成し、変異型対立遺伝子のKD値の増加を示した。これは、HFQが突然変異体にあまり効率的に結合できることを証明した。さらにHFQは、CsgD上にいくつかの結合部位を有し、これは野生型RNAについて観察された3つのシフトによって示される。しかし、異なる変異型RNAに対して観察されるのは2つの結合部位のみである。したがって、サイト指向の突然変異アプローチは、HFQの完全結合に重要なCsgD mRNAの一次および二次構造を特定する。ここで説明する部位特異的突然変異誘発法はPCRに依存する。適切な PCR プラクティスは、この方法にとって非常に重要であり、最適化を成功させるために必要な場合があります。部位特異的突然変異誘発は、EMSAおよびウェスタンブロッティングのような3つの方法すべてにおいてのみ強力である。他の方法としては、例えば、種々の構造アッセイおよびいくつかの活性アッセイ、および翻訳後修飾研究が含まれる。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

糖タンパク質 x 線結晶構造解析および生物物理学的手法によって、免疫グロブリンフォールドのキャラクタリゼーション

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

4-チウラシル(Ers4tU)を使用したビボにおけるRNAの非常に迅速かつ特異的な代謝標識

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

ラット膵臓組織の迅速かつ費用対効果の高いRNA抽出

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

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大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...