Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
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저자는 남쪽 덴마크의 대학 오픈 액세스 정책 보조금을 감사 하 고 싶습니다.

1. 벡터 선택
<ol><li>다운스트림 실험을 수행 하는 벡터를 선택 하십시오. 모든 벡터는이 2 및 3 단계 PCR 방법에 적용 됩니다.</li>
	<li>벡터의 선택에 따라 달라 집니다, 복제에 대 한 적절 한 제한 효소를 선택 합니다.</li>
</ol>2. 뇌관 디자인 사이트에 대 한 감독 mutagenesis
<ol><li>중 2 단계 또는 3 단계 PCR 전략 사이 결정 (2 단계는 돌연변이 < 200 bp의 DNA의 양쪽 끝에서). 2 단계 PCR를 위?...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

사이트 지시 된 mutagenesis는 광범위 한 다른 응용 프로그램, 그리고 여기, 대표는 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험 결과 기술을 사용 하 여 생물학적 결론을 확인 하는 방법의 예제로 포함 했다. 사이트 지시 된 mutagenesis는 오랫동안 RNA 상호 작용 연구에 대 한 황금 표준 되었습니다. 기술의 강점 다운스트림 분석 실험 및 실험 (예를들면, 서쪽 오 점 또는 EMSA)에 유전자 제품의 기능에 특정 DNA 사이트 ...

DNA는 종종 라고 합니다 살아있는 세포의 청사진 때문에 모든 구조는 세포의 DNA의 순서에 인코딩됩니다. 정확한 복제 및 DNA 수리 메커니즘 코딩된 유전자의 정확한 기능 유지에 필수적입니다, 돌연변이의 매우 낮은 요금 발생 확인 합니다. DNA 순서의 변화 다음 (자료 쌍 complementarity 그리고 이차 구조 변경) RNA 및 단백질 (아미노산 DNA 전사 요소와 제한 효소 (인식)로 시작 하는 서로 다른 수준에서 연속 함수에 영향을 미칠 수 있습니다. 산 성 대체, 삭제, 추가 또는 프레임 교대). 많은 돌연변이 유전자 기능을 크게 미치지 않습니다, 그러나 일부 돌연변이 DNA에서 거 대 한 의미를 가질 수 있습니다. 따라서, 사이트 지시 된 mutagenesis 모든 수준에서 특정 DNA 사이트의 중요성을 공부 하기 위한 유용한 도구입니다.
이 프로토콜에는 특정 돌연변이 소개 하는 데 사용 하는 타겟된 mutagenesis 접근 방식을 설명 합니다. 두 개의 서로 다른 PCR 전략에 의존 하는 프로토콜: 2 단계 또는 3 단계 PCR. 2 단계 PCR는 적용 가능한 경우 원하는 돌연변이의 DNA의 3' 끝 또는 5' 끝은 (< 200 기본적인 쌍 (bp) 끝에서) 3 단계 PCR 모든 경우에 적용 됩니다.
2 단계 PCR 방법에서 3 프라이 머는, 있는 뇌관의 한 세트의 (뇌관 1, 3, 앞으로 및 역방향, 각각), DNA를 증폭 하도록 설계 되었습니다 및 단일 뇌관은 돌연변이 통합 하도록 설계 되었습니다. 뇌관 (뇌관 2)을 소개 하는 돌연변이 돌연변이 5' 끝과 앞으로 방향 경우 경우 돌연변이 3' 끝은 역 방향이 있어야 합니다. 첫 번째 PCR 단계에서 뇌관 1 + 2 또는 2 + 3 각각 5' 끝 또는 3' 끝, 가까이 작은 파편을 증폭 한다. 유래 PCR 제품은 뇌관 1 또는 3, 관심 (그림 1A)의 DNA에 돌연변이와 PCR 제품에 따라서 결과와 2 단계에서 뇌관으로 사용 됩니다.
3 단계 PCR에 있는 뇌관의 1 세트는 (뇌관 1, 4, 앞으로 및 역방향, 각각)의 DNA를 증폭 하도록 설계 되었습니다. 4 뇌관 설계는 뇌관의 1 세트는 겹치는 complementarity 특정 돌연변이 통합 하도록 설계 되었습니다. (2, 3, 뇌관 역 그리고 앞으로, 각각). 1 및 2 단계에서 뇌관 1 + 2 및 3 + 4 증폭 5'과 3' 끝. 3 단계에서 로부터 유래 PCR 제품 1 단계 고 2는 사용 뇌관 1 + 4와 증폭. 따라서, 결과 PCR 제품은 원하는 돌연변이 (그림 1B)에 대 한 관심의 DNA 이다.
돌연변이 DNA 모든 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다,이 프로토콜에 다시 클로닝 벡터에는 DNA를 결합 하는 방법을 설명 합니다. 클로닝 벡터의 사용 복제의 용이성 등 몇 가지 장점이 및 벡터의 기능에 따라 특정 실험적인 응용 프로그램. 이 기능은 RNA 상호 작용 연구를 위해 자주 사용 됩니다. RNA 상호 작용 연구에 대 한 또 다른 기술은 다른 RNA1,2 또는 단백질3,4단지에서 RNA의 구조 조사입니다. 그러나, 구조 조사만 수행 됩니다 생체 외에서 반면 사이트 지시 된 mutagenesis와 후속 복제 허용 상호 작용 연구에 대 한 vivo에서.
사이트 지시 된 mutagenesis는 광범위 하 게 사용 되었습니다 RNA 상호 작용 연구로 여기에 제시. 그러나, 주요 방법에 관한 2-또는 3-단계 PCR는 DNA의 어떤 조각에 적용 이며 따라서 RNA 상호 작용 연구에 제한 뿐만 아니라.
기술과 그것의 가능한 사용을 예증 하 지역에 mRNA, 대장균 (대장균)의 csgD 의 post-transcriptional 규제에 대 한 중요 한 특성은 사용 됩니다. 대장균, csgD에서 대상 이다 작은 비 코딩 RNA, McaS, 단백질, Hfq, CsgD2,,45의 단백질 발현을 억 누르기 위해 협력. 기술은은 돌연변이 csgD , McaS, 사이 베이스 페어링 지역 그리고 csgD의 Hfq 바인딩 사이트에 소개 하는 데 사용 됩니다. 얻은 DNA는 다음 후속 실험에 적합 한 벡터에 복제 됩니다. 기술은의 다운스트림 응용 프로그램에는 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험 포함 됩니다. 이해를 돕기 위해 예제 1은 생체 조건 서쪽 오 점 분석 결과 사용 하 여 특징 하 고 예제 2 생체 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)를 사용 하 여 특징입니다. 두 경우 모두, 그것은 그림된 어떻게 사이트 감독 mutagenesis 관심의 유전자에 대 한 생물 학적 결론을 다른 기술 함께에서 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

사이트 지시 된 mutagenesis은 작은 비 코딩 ribonucleic 산 (요 스르나.) 분자와 대상 메신저 RNAs (mRNAs) 간의 상호 작용을 조사 하기 위하여 DNA에 있는 특정 돌연변이 소개 하는 기술입니다. 또한, 사이트 지시 된 mutagenesis는 RNA를 특정 단백질 바인딩 사이트를 매핑하는 데 사용 됩니다. 돌연변이의 2 단계와 3 단계 PCR 기반 소개 설명 되어 있습니다. 접근은 모든 단백질-RNA와 RNA RNA 상호 작용 연구에 관련이 있다. 즉, 기술 설계 뇌관 원하는 mutation(s)와 돌연변이 PCR 제품을 합성 하는 PCR의 2 또는 3 단계를 통해 사용 합니다. PCR 제품은 복제에 사용 됩니다. 여기, 우리는 요 스르나., McaS, 그리고 mRNA, csgD, RNA RNA와 RNA-단백질 상호 작용을 조사 하는 돌연변이 소개 하는 두 2 및 3 단계 접근 방식으로 mutagenesis 사이트 감독을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 우리 조사 RNA 상호 작용;이 기법을 적용 그러나, 기술은 모든 mutagenesis 연구 (예를 들어, DNA 단백질 상호 작용, 아미노 산 대체/삭제/추가)에 적용 됩니다. 비 자연 기지를 제외 하 고 돌연변이의 어떤 종류를 소개 수 있지만 기술은만 경우 적용 PCR 제품 다운스트림 응용 프로그램 (예: 복제 추가 PCR에 대 한 서식 파일)에 사용할 수 있습니다.

이중 벡터 설정 선택 되었다 csgD 의 post-transcriptional 규정에 관한 RNA 상호 작용을 조사 하기: 하나 csgD 표현 하 mRNA 및 다른 작은 비 코딩 RNA, McaS 표현 하. csgD pBAD33, 페니 저항 arabinose 유도할 수 있는 매체 복사 플라스는으로 복제 했다 및 McaS는 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 유도할 수 있는 낮은 사본 플라스 미드는 미니 R1 pNDM220으로 복제 했다와 ?...

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Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

현장 지향 돌연변이 발생은 RNA-RNA 및 RNA 단백질 상호 작용과 같은 분자 상호 작용을 연구하는 데 유용합니다. 이 프로토콜은 2단계 또는 3단계 PCR 접근 방식을 사용하여 사이트 지향 돌연변이 발생을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 주요 장점은 통합 될 수있는 다른 돌연변이의 다양성뿐만 아니라 상대적 용이성과 비용을 수행하는 것입니다.시작하려면, 야생형 DNA 템플릿과 프라이머 쌍을 2단계, 2, 3, 2단계, 또는 프라이머 쌍 3, 1, 3, 4, PCR 제품 1개를 획득한다. 아가로즈 젤 전기포광에 의한 PCR 제품의 유효성을 검사하려면 전자레인지를 사용하여 1X TAE 버퍼 100밀리리터에 아가로즈 2그램을 용해하여 2%의 아가로즈 젤을 만듭니다. 밀리리터당 0.5 마이크로그램의 최종 농도에서 에티듐 브로마이드를 추가합니다.그런 다음 아가로즈 젤을 캐스팅합니다. 고형화되면 전기 전도 장치에 놓습니다. 알려진 크기의 DNA 사다리를 적재하고, PCR 샘플을 DNA 적재염료와 혼합하여 우물에 넣습니다.샘플을 75볼트에서 45분간 실행합니다. 또한 UV 트랜틸루미나이터 또는 젤 이미징 시스템으로 밴드를 시각화합니다. 다음으로, 제조업체 프로토콜에 따라 젤 추출 키트로 PCR 제품을 정화하고 분광계로 정제된 DNA의 농도를 측정한다.그런 다음 정제 된 DNA를 TE 버퍼에 영하 20 섭씨로 저장합니다. 2단계 PCR로 사이트 지향 돌연변이 발생을 시작하려면 먼저 야생형 DNA 템플릿을 사용한 다음 프라이머는 5개의 프라이머 돌연변이에 대해 2, 1, 2, 2, 프라이머 쌍을 2, 2, 2, 3개, 3개의 프라이머 돌연변이에 대해 PCR 제품 2개를 얻습니다. 젤 전기전도에 의한 PCR 제품을 검증하고, PCR 제품을 정화하고, 앞에서 설명한 바와 같이 농도를 측정한다.이어서 야생형 DNA 템플릿과 PCR 제품 2를 프라이머로 사용하고, 프라이머 2, 5개의 프라이밍 돌연변이에 대해 3개, 프라이머 2개, 3개의 프라이밍 돌연변이에 대해 1개, PCR 생성물 3개를 획득한다. 젤 전기전도에 의한 PCR 제품을 검증하고, PCR 제품을 정화하고, 앞에서 설명한 바와 같이 농도를 측정한다. 그런 다음 정제 된 DNA를 TE 버퍼에 영하 20도의 섭씨로 저장합니다.3단계 PCR로 사이트 직접 돌연변이 발생을 시작하려면 먼저 야생형 DNA 템플릿과 프라이머 쌍을 3, 1, 3, 2로 사용하여 PCR 제품 2를 얻습니다. 야생형 DNA 템플릿과 프라이머 쌍 3, 3, 3, 4를 사용하여 PCR 제품 3개를 얻습니다. 야생형 DNA 템플릿과 프라이머 쌍 3, 3, 3, 4를 사용하여 PCR 제품 3개를 얻습니다.젤 전기전도에 의한 PCR 제품을 검증하고, PCR 제품을 정화하고, 앞에서 설명한 바와 같이 농도를 측정한다. 마지막으로 PCR 제품의 2 ~ 5 나노 그램을 프라이머 쌍 3, 1 및 3, 4와 함께 템플릿으로 사용하여 PCR 제품 4개를 얻습니다. 젤 전기전도에 의한 PCR 제품을 검증하고, PCR 제품을 정화하고, 앞에서 설명한 바와 같이 농도를 측정한다.정제된 DNA를 TE 버퍼에 영하 20도에 저장합니다. 이 연구에서는, 2단계 및 3단계 사이트 지향 돌연변이 발생은 CsgD의 전사 후 조절에 관한 RNA 상호 작용을 조사하기 위해 사용되었다. 야생형 CsgD는 PCR 제품 IA를 산출하기 위해 PCR증폭되었고, 야생형 맥아S는 PCR 제품 IB를 산출하기 위해 증폭되었다. 3단계 PCR 전략을 사용하여 PCR 제품 IIA 및 IIIA는 처음 두 단계로 합성되었으며, CSGD에서 돌연변이를 도입하는 세 번째 단계에서 IVA가 합성되었습니다.유사하게, 무료 사이트 지향 돌연변이는 처음 두 단계에서 PCR 제품 IIB, IIIB, 및 제 3 단계에서 IVB를 산출하기 위해 mcaS에 도입되었다. 서양 얼룩 분석은 야생 형 mcaS의 발현이 야생 형 CsgD의 번역을 방지하지만 mcaS 또는 CsgD의 돌연변이는 관찰 된 억압을 완화한다는 것을 보여주었습니다. 그러나, CsgD와 mcaS 둘 다에 있는 돌연변이는 CsgD의 번역을 방지합니다.2단계 PCR 전략을 사용하여 PCR 제품 IIC, IID, IIE, IIF 및 IIG를 첫 번째 단계에서 합성하고, PCR 제품 IIIC, IIID, IIIE, IIIF 및 IIIG를 통합하여 전체 CsgD DNA에 돌연변이를 도입하였다. 시험관 내 전사CsGD 와일드 타입 및 돌연변이 RNA에 대한 HFQ 결합의 EMSA 결과는 PCR 제품 IIIC, IIID, IIIE, IIIF 및 IIIG를 사용하여 합성되어 돌연변이 선제의 KD 값이 증가하는 것을 보여주었다. 이것은 HFQ가 돌연변이에 덜 효율적으로 결합할 수 있다는 것을 증명했습니다.또한 HFQ는 CsgD에 대한 여러 결합 부위를 가지고 있으며, 이는 야생 형 RNA에 대해 관찰된 세 교대에 의해 나타난다. 그러나 다른 돌연변이 RNA에 대해 두 개의 바인딩 사이트만 관찰됩니다. 따라서 현장 지향 돌연변이 접근법은 HFQ의 완전한 결합에 중요한 CsgD mRNA의 1차 또는 이차 구조를 식별합니다.여기에 설명된 사이트 지향 돌연변이 발생에 대한 방법은 PCR에 의존합니다. 좋은 PCR 관행은 이 방법에 매우 중요하며 성공하려면 최적화가 필요할 수 있습니다. 현장 지향 돌연변이 발생은 EMSA 및 웨스턴 블로팅과 같은 세 가지 방법 모두에서만 강력합니다.다른 방법, 예를 들어, 다양 한 구조 적인 해석 및 일부 활동 에세이를 포함, 번역 수정 연구 후.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

쥐 췌장 조직의 신속하고 비용 효율적인 RNA 추출

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...