Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke University of Southern Denmark åpen tilgang politikk tilskudd.

1. vektorvalget
<ol><li>Velg en vektor utføre nedstrøms eksperimenter med. Enhver vektor gjelder for denne 2 - og 3-trinns PCR metoden.</li>
	<li>Basert på valg av vektor, velge riktig begrensning enzymer for kloning.</li>
</ol>2. primer design for området regissert mutagenese
<ol><li>Velge mellom enten 2-step eller 3-trinns PCR strategien (2-step er bare for mutasjoner < 200 bp fra hver ende av DNA av interesse). For 2-trinns PCR, gå til trinn 2.2 og 3-trinns PCR gå til trinn 2.3.</li>
...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli:+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA.">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li><li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli.">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

Nettstedet-rettet mutagenese har en rekke forskjellige programmer, og her, representant resultater fra en in vivo og et i vitro eksperiment ble inkludert som eksempler på hvordan å gjøre biologiske konklusjoner ved hjelp av teknikken. Nettstedet-rettet mutagenese har lenge vært golden standarden for RNA samhandling studier. Styrken på teknikken ligger i kombinasjonen av introdusere relevante mutasjoner nedstrøms analyser og eksperimenter (f.eks western blot eller EMSA) for å trekke konklusjoner om bestemte DNA net...

DNA er ofte referert til som blåkopi av en levende celle siden alle strukturer av cellen er kodet i sekvensen av sin DNA. Nøyaktig replikering og DNA reparasjon mekanismer sikrer at bare svært lave priser av mutasjoner oppstår, som er avgjørende for å opprettholde riktige funksjonene av kodet gener. Endringer av DNA sekvensen kan påvirke påfølgende funksjoner på ulike nivåer starter med DNA (anerkjennelse av transkripsjonsfaktorer og begrensning enzymer), deretter RNA (base-par komplementaritet og sekundær endringer) og/eller protein (aminosyre Acid erstatninger, sletting, tilleggene eller ramme-Skift). Mens mange mutasjoner ikke påvirker gen funksjon betydelig, kan noen mutasjoner i DNA har enorme implikasjoner. Dermed er området-rettet mutagenese et verdifullt verktøy for å studere betydningen av spesifikke DNA nettsteder på alle nivåer.
Denne protokollen beskriver en målrettet mutagenese tilnærming brukes til å introdusere spesifikke mutasjoner. Protokollen er avhengig av to forskjellige PCR strategier: en 2-trinns eller en 3-trinns PCR. 2-trinns PCR gjelder hvis ønsket mutasjon ligger 5' slutten eller 3 slutten av DNA av interesse (< 200 base parene (bp) fra slutten) og 3-trinns PCR gjelder i alle tilfeller.
I 2-step PCR tilnærming, 3 primere er utformet som en rekke primere er utviklet for å forsterke DNA av interesse (primere 1 og 3, fremover og bakover, henholdsvis) og en enkelt primer er utformet for å innlemme mutasjon. Mutasjon introdusere grunning (primer 2) bør ha en omvendt retning hvis mutasjon er 5' slutten og en forover retning hvis mutasjon ligger 3 slutten. I det første trinnet PCR forsterker primer 1 + 2 eller 2 + 3 et lite fragment nær 5' slutten eller 3 slutt, henholdsvis. PCR sluttproduktet brukes deretter som en primer i trinn to med primer 1 eller 3, dermed resulterer i et PCR-produkt med en mutasjon i DNA av interesse (figur 1A).
Den 3-trinns PCR, 4 primere er utformet, der ett sett med primere er utviklet for å forsterke DNA av interesse (primere 1 og 4 fremover og bakover, henholdsvis) og en rekke primere er utformet for å omfatte spesifikke mutasjoner med overlappende komplementaritet (primere 2 og 3, snu og videresende, henholdsvis). I trinn en og to, primere 1 + 2 og 3 + 4 forsterke 5' og 3 slutten. I trinn tre, de resulterende PCR produktene fra trinn en og to er stjernen og forsterket med primere 1 + 4. Dermed er PCR sluttproduktet DNA av interesse med ønsket mutasjon (figur 1B).
Mens mutert DNA kan brukes for alle nedstrøms søknad, beskriver denne protokollen hvordan å kombinere DNA i en kloning vektor. Bruk av kloning vektorer har flere fordeler som brukervennlighet kloning og bestemte eksperimentelle programmer avhengig av funksjoner av vektoren. Denne funksjonen brukes ofte for RNA samhandling studier. En annen teknikk for RNA samhandling studier er strukturelle undersøkelser av RNA i kompleks med en annen RNA1,2 eller protein3,4. Imidlertid utføres strukturelle undersøkelser bare i vitro mens området-rettet mutagenese og påfølgende kloning tillater samhandling studier i vivo.
Nettstedet-rettet mutagenese har vært mye brukt for RNA samhandling studier som presenteres her. Men den viktigste metoden om 2 eller 3-trinn PCR gjelder for ethvert stykke DNA, og dermed ikke bare begrenset til RNA-interaksjon studier.
Du eksemplifiserer teknikken og bruksområdene, brukes karakteristikk av regioner viktig for post-transcriptional regulering av mRNA, csgD, av Escherichia coli (E. coli). E. coli , csgD er rettet av små ikke-koding RNA, McaS, i samarbeid med en protein, Hfq, å undertrykke protein uttrykk CsgD2,4,5. Teknikken brukes til å introdusere mutasjoner base-sammenkobling området mellom csgD og McaS og Hfq binding området av csgD. Innhentet DNA er deretter klonet i en vektor egnet for senere eksperimenter. Nedstrøms programmer av teknikken omfatter både i vivo og in vitro eksperimenter. For illustrasjon, eksempel 1 er preget i vivo bruker en western blot analysen og eksempel 2 er preget i vitro bruker en electrophoretic mobilitet Skift analyse (EMSA). I begge tilfeller er det illustrert hvordan området-rettet mutagenese kan brukes i kombinasjon med andre teknikker for å gjøre biologiske konklusjoner om en genet av interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

Nettstedet-rettet mutagenese er en teknikk som brukes til å introdusere spesifikke mutasjoner i DNA å undersøke samspillet mellom små ikke-koding ribonukleinsyre (sRNA) molekyler og målet messenger RNAs (mRNAs). I tillegg brukes nettstedet-rettet mutagenese til å tilordne bestemte protein bindende områder til RNA. En 2-trinns og 3-trinns PCR basert innføring av mutasjoner er beskrevet. Tilnærmingen er relevant for alle protein-RNA og RNA-RNA samhandling studier. Kort sagt, avhengig teknikken designe primere med den ønskede mutation(s), og gjennom 2 eller 3 trinnene for PCR syntetisere et PCR produkt med mutasjon. PCR produktet brukes deretter for kloning. Her beskriver vi hvordan du utfører området-rettet mutagenese med både 2 - og 3-trinn tilnærming til å introdusere mutasjoner i sRNA, McaS og mRNA, csgD, å undersøke RNA-RNA og RNA-protein interaksjoner. Vi bruker denne teknikken for å undersøke RNA interaksjoner; teknikken er imidlertid gjelder for alle mutagenese studier (f.eks DNA-protein interaksjoner, aminosyre substitusjon/sletting/tillegg). Det er mulig å innføre noen form for mutasjon bortsett fra ikke-naturlige baser men teknikken gjelder bare hvis et PCR-produkt kan brukes for nedstrøms program (f.eks kloning og mal for ytterligere PCR).

Undersøke RNA interaksjoner om post-transcriptional regulering av csgD, en dobbel vektor oppsett ble valgt: en å uttrykke csgD mRNA og en annen for å uttrykke den liten ikke-koding RNA, McaS. csgD ble klonet i pBAD33, som er en arabinose induserbart medium-kopi plasmider chloramphenicol motstand og McaS ble klonet i mini R1 pNDM220, som er en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induserbart lav kopi plasmider med Ampicillin motstand. Wild type cs...

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Nettstedet-rettet mutagenese for In Vitro og Vivo eksperimenter eksemplifisert med RNA samhandling i Escherichia Coli

Nettstedet-rettet mutagenese er en teknikk som brukes til å introdusere spesifikke mutasjoner i deoksyribonukleinsyre (DNA). Denne protokollen beskriver hvordan området-rettet mutagenese med en 2-trinns og 3-trinns polymerasekjedereaksjons (PCR) basert tilnærming som gjelder for alle DNA del av interesse.

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Stedsrettet mutagenese er nyttig for å studere molekylære interaksjoner, som RNA-RNA, og RNA protein interaksjoner. Denne protokollen beskriver hvordan du utfører områderettet mutagenese med en to eller 3-trinns PCR-tilnærming. De viktigste fordelene med metoden er mangfoldet av forskjellige mutasjoner som kan innlemmes, samt en relativ letthet og kostnad for å gjøre det.For å begynne, bruk wild-type DNA-mal og primer par to, en og to, tre, spesifikk for 2-trinns, eller primer par tre, en og tre, fire, spesifikk for 3-trinns PCR for å få PCR produkt en. For å validere PCR-produkter ved agarose gel elektroforese, lage en 2% agarose gel ved å oppløse to gram agarose i 100 milliliter 1X TAE buffer, ved hjelp av en mikrobølgeovn. Tilsett ethidiumbromid ved en endelig konsentrasjon på 0,5 mikrogram per milliliter.Deretter kaster agarose gel. Når størknet, plasser den i en elektroforese enhet. Last en DNA-stige av kjent størrelse, og PCR-prøvene blandet med DNA-lasting fargestoff i brønner.Kjør prøver på 75 volt i 45 minutter. Og visualiser bånd på en UV-transilluminator eller med et gelavbildningssystem. Deretter renser du PCR-produktet med et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens protokoll og måler konsentrasjonen av det rensede DNA med et spektrofotometer.Oppbevar deretter det rensede DNA-et på minus 20 celsius i TE-buffer. For å begynne stedsrettet mutagenese med en 2-trinns PCR, bruk først den ville DNA-malen, deretter primeren parer to, en og to, to, for fem primer mutasjoner, eller primer par to, to og to, tre for tre priment mutasjoner for å få PCR produkt to. Valider PCR-produktet ved gelelektroforese, rens PCR-produktet og mål konsentrasjonen som beskrevet før.Bruk deretter den ville DNA-malen og PCR-produktet to som primer, sammen med primer to, tre for fem priment mutasjon, eller primer to, en for tre priment mutasjon, for å oppnå PCR produkt tre. Valider PCR-produktet ved gelelektroforese, rens PCR-produktet og mål konsentrasjonen som beskrevet før. Oppbevar deretter det rensede DNA-et på minus 20 grader celsius i TE-buffer.For å begynne steds direkte mutagenese med en 3-trinns PCR, bruk først den ville DNA-malen og primerparene tre, en og tre, to for å få PCR-produkt to. Bruk wild-type DNA-mal og primerpar tre, tre og tre, fire, for å få PCR produkt tre. Bruk wild-type DNA-mal og primerpar tre, tre og tre, fire, for å få PCR produkt tre.Valider PCR-produktet ved gelelektroforese, rens PCR-produktet og mål konsentrasjonen som beskrevet før. Til slutt bruker du to til fem nanogram PCR-produkter to og tre som mal sammen med primerpar tre, en og tre, fire, for å få PCR-produkt fire. Valider PCR-produktet ved gelelektroforese, rens PCR-produktet og mål konsentrasjonen som beskrevet før.Oppbevar det rensede DNA-et på minus 20 grader celsius i TE-buffer. I denne studien ble 2-trinns og 3-trinns stedsrettet mutagenese brukt til å undersøke RNA-interaksjoner om posttranskripsjonell regulering av CsgD. Wild-type CsgD ble PCR forsterket for å gi PCR produkt IA, og wild-type mcaS ble PCR forsterket for å gi PCR produkt IB. Ved hjelp av en 3-trinns PCR-strategi ble PCR-produkter IIA og IIIA syntetisert i de to første trinnene, og IVA i det tredje trinnet for å introdusere mutasjoner i CsgD.På samme måte ble gratis stedsrettede mutasjoner introdusert i mcaS for å gi PCR-produkter IIB, IIIB, i de to første trinnene, og IVB i tredje trinn. Western blot analyse viste at mens uttrykk for vill-type mcaS hindrer oversettelse av vill-type CsgD, mutasjoner i enten mcaS eller CsgD lindrer observert undertrykkelse. Mutasjoner i både CsgD og mcaS forhindrer imidlertid oversettelse av CsgD.Ved hjelp av en 2-trinns PCR-strategi ble PCR-produkter IIC, IID, IIE, IIF og IIG syntetisert i første trinn, og PCR-produkter IIIC, IIID, IIIE, IIIF og IIIG, i det andre trinnet for å introdusere mutasjoner til hele CsgD DNA. EMSA-resultatene av HFQ-bindingen til in vitro transkriberte CsgD wild-type og muterte RNA-er, syntetisert ved hjelp av PCR-produkter IIIC, IIID, IIIE, IIIF og IIIG, viste de økte KD-verdiene til mutert allelene. Dette viste seg at HFQ kunne binde mindre effektivt til mutantene.Videre hfq har flere bindende områder på CsgD, som er vist av de tre skiftene observert for vill-type RNA. Imidlertid observeres bare to bindende steder for forskjellige muterte RNA-er. Dermed identifiserer den stedsrettede mutasjonstilnærmingen primære og eller sekundære strukturer i CsgD mRNA som er viktige for fullstendig binding av HFQ.Metoden for stedsrettet mutagenese som er beskrevet her, er avhengig av PCR. God PCR praksis er derfor avgjørende for metoden og kan kreve optimalisering for å lykkes. Stedsrettet mutagenese er bare kraftig med alle tre metoder som EMSA og Western Blotting.Andre metoder, for eksempel, inkluderer ulike strukturelle analyser og noen aktivitetsanalyser, og etter oversettelse modifikasjon studier.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning av pH-avhengig aktivitet av<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Anstand HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; og<em&gt; I Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifisering av overflod og lading nivåer av overføring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse av Biolayer laboratoriefasiliteter (BLI) for å studere protein-protein interaksjoner i transkripsjon

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Ekstremt rask og spesifikk metabolsk merking av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Rask og kostnadseffektiv RNA-ekstraksjon av rottepanasittvev

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Stedsspesifikk lysinacetylering av histoner for nukleosomrekonstituering ved bruk av genetisk kodeutvidelse i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...