Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Os autores gostaria agradecer subsídios de política de acesso aberto de Universidade do Sul da Dinamarca.

1. seleção do vetor
<ol><li>Escolha um vetor para realizar experimentos a jusante com. Qualquer vetor é aplicável para este método PCR de 2 e 3 passos.</li>
	<li>Com base na escolha do vetor, escolha as enzimas de restrição apropriadas para clonagem.</li>
</ol>2. projeto primer para site dirigido mutagênese
<ol><li>Decidir entre a estratégia do PCR-passo 2 ou 3 (2-passo é apenas para as mutações < 200 bp de ambas as extremidades do DNA de interesse). Para a PCR 2-passo, vá para o ...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli:+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA.">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li><li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli.">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

Mutagenesis local-dirigido tem uma ampla gama de aplicações diferentes, e aqui, resultados representativos de uma in vivo e in vitro experimento foram incluídos como exemplos de como fazer conclusões biológicas usando a técnica. Mutagenesis local-dirigido foi, por muito tempo, o padrão ouro para estudos de interacção de RNA. A força da técnica reside na combinação da introdução de mutações relevantes com a jusante ensaios e experiências (por exemplo, borrão ocidental ou EMSA) para tirar conclusões sob...

DNA é muitas vezes referida como a estrutura de uma célula viva, uma vez que todas as estruturas da célula são codificadas na sequência de seu DNA. Replicação exata e mecanismos de reparo do DNA certifique-se de que só muito baixas taxas de mutações ocorrem, que é essencial para sustentar as funções corretas dos genes codificados. Alterações da sequência de DNA podem afetar funções sucessivas em diferentes níveis, começando com o DNA (reconhecimento por enzimas de restrição e fatores de transcrição), em seguida RNA (alterações de estrutura secundária e complementaridade de pares de base) e/ou proteínas (amino ácido substituições, supressões, adições ou quadro-turnos). Enquanto muitas mutações não afetam significativamente a função do gene, algumas mutações no DNA podem ter implicações enormes. Assim, o mutagenesis local-dirigido é uma ferramenta valiosa para estudar a importância dos locais específicos do DNA em todos os níveis.
Este protocolo descreve uma abordagem de mutagénese alvo usada para introduzir mutações específicas. O protocolo se baseia em duas diferentes estratégias PCR: um 2-passo ou um passo 3-PCR. Passo 2 PCR é aplicável se a mutação desejada está perto da extremidade 5' ou extremidade 3' do DNA de interesse (< 200 pares de bases (bp) da extremidade) e o PCR do passo 3-é aplicável em todos os casos.
Na abordagem PCR no passo 2, 3 primeiras demão são projetadas, na qual destina-se um conjunto de primers para amplificar o DNA de interesse (primeiras demão 1 e 3, para a frente e reverso, respectivamente), e um único primer é projetado para incorporar a mutação. A mutação, apresentando a primeira demão (cartilha 2) deve ter uma orientação reversa, se a mutação é perto da extremidade 5' e uma orientação para a frente se a mutação está perto da extremidade 3'. Na primeira etapa do PCR, cartilha 1 + 2 ou 2 + 3 amplifica um fragmento pequeno perto da extremidade 5' ou 3' final, respectivamente. O produto resultante da PCR é usado como um primer na etapa dois com primer 1 ou 3, resultando em um produto PCR com uma mutação no DNA de interesse (figura 1A).
No passo 3-PCR, 4 cartilhas destinam-se, na qual destina-se um conjunto de primers para amplificar o DNA de interesse (primeiras demão 1 e 4, para a frente e reverso, respectivamente) e um conjunto de primers é projetado para incorporar mutações específicas com sobreposição de complementaridade (primers, 2 e 3, reverter e encaminhar, respectivamente). Na etapa 1 e 2, as primeiras demão 1 + 2 e 3 + 4 amplificam a extremidade 5' e 3'. No terceiro passo, os produtos resultantes da PCR de passo um e dois são usados como modelos e amplificado com iniciadores 1 + 4. Assim, o produto resultante da PCR é o DNA de interesse com a mutação desejada (figura 1B).
Enquanto o DNA modificado pode ser usado para qualquer aplicação a jusante, este protocolo descreve como re-combinar o DNA em um vetor de clonagem. A utilização de vectores de clonagem tem diversas vantagens tais como facilidade de clonagem e aplicações experimentais específicas dependendo de características do vetor. Esse recurso é usado frequentemente para estudos de interacção de RNA. Outra técnica para estudos de interação RNA está sondando estruturais do RNA em complexo com outro RNA1,2 ou proteína3,4. No entanto, sondagem estrutural só é executada em vitro considerando mutagenesis local-dirigido e clonagem subsequentes permitem estudos de interação in vivo.
Mutagenesis local-dirigido tem sido extensivamente usado para estudos de interação RNA como apresentado aqui. No entanto, o método chave sobre 2 ou 3-passos PCR é aplicável a qualquer pedaço de DNA e, portanto, não apenas limitada a estudos de interação com o RNA.
Para exemplificar a técnica e seus possíveis usos, caracterização de regiões importantes para regulação pós-transcricional do mRNA, csgD, de Escherichia coli (e. coli) é usada. Em e. coli, csgD destina-se a pequeno RNA não-codificante, McaS, em cooperação com uma proteína, Hfq, para reprimir a expressão da proteína de CsgD2,4,5. A técnica é usada para introduzir mutações para a região de base-emparelhamento entre csgD e McaS e o sítio de ligação do Hfq de csgD. O DNA obtido é então clonado em um vetor apropriado para experimentos subsequentes. Aplicações a jusante da técnica incluem experimentos in vivo e in vitro. Para ilustração, exemplo 1 é caracterizado em in vivo usando um ensaio de borrão ocidental e exemplo 2 caracteriza-se in vitro usando um ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA). Em ambos os casos, é ilustrado o mutagenesis local-dirigido como pode ser usado em combinação com outras técnicas para fazer conclusões biológicas sobre um gene de interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

Mutagenesis local-dirigido é uma técnica usada para introduzir mutações específicas no DNA para investigar a interação entre pequenas moléculas de ácido ribonucleico (sRNA) não-codificantes e alvo mensageiro RNAs (mRNAs). Além disso, mutagenesis local-dirigido é usado para mapear locais obrigatórios de proteína específica de RNA. Uma introdução de PCR com base em etapas 2 e 3-etapa de mutações é descrita. A abordagem é relevante para todas as proteínas-RNA e estudos de interação RNA-RNA. Em suma, a técnica baseia-se na elaboração de cartilhas com o mutation(s) desejado e através de 2 ou 3 passos de PCR sintetizar um produto PCR com a mutação. O produto do PCR é usado para clonagem. Aqui, descrevemos como executar o mutagenesis local-dirigido com a abordagem de 2 e 3 passos para introduzir mutações a sRNA, McaS e o mRNA, csgD, para investigar o RNA-RNA e RNA-proteína interações. Podemos aplicar esta técnica para investigar interações de RNA; no entanto, a técnica é aplicável a todos os estudos de mutagênese (por exemplo, interações DNA-proteína, amino-ácido adição/exclusão/substituição). É possível introduzir qualquer tipo de mutação exceto bases não-natural, mas a técnica só é aplicável se um produto PCR pode ser usado para aplicação a jusante (por exemplo, clonagem e modelo para mais de PCR).

Para investigar interações RNA sobre regulação pós-transcricional do csgD, foi escolhida uma configuração de duplo vetor: um para expressar o csgD mRNA e outra para expressar o pequeno RNA não-codificante, McaS. csgD foi clonado em pBAD33, que é um plasmídeo de médio-cópia inducible arabinose com resistência ao cloranfenicol e McaS foi clonado em mini pNDM220 R1, que é um plasmídeo de cópia baixa inducible isopropílico β-D-1-thiogalactopyranosi...

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Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

Mutagenesis local-dirigido é uma técnica usada para introduzir mutações específicas no Ácido desoxirribonucleico (DNA). Este protocolo descreve como fazer o mutagenesis local-dirigido com um 2-passo e passo 3-cadeia da polimerase (PCR) com base em abordagem, que é aplicável a qualquer fragmento de DNA de interesse.

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Mutagênese dirigida ao local é útil para estudar interações moleculares, como RNA-RNA e interações proteicas de RNA. Este protocolo descreve como executar mutagênese direcionada ao site com uma abordagem PCR de duas ou três etapas. As principais vantagens do método são a diversidade de diferentes mutações que podem ser incorporadas, bem como uma relativa facilidade e custo para fazê-lo.Para começar, use o modelo de DNA do tipo selvagem e os pares de primer dois, um e dois, três, específicos para pares de 2 etapas, ou primer três, um e três, quatro, específicos para PCR de 3 passos para obter um produto PCR. Para validar os produtos PCR por eletroforese de gel agarose, faça um gel de 2% de agarose dissolvendo dois gramas de agarose em 100 mililitros de tampão TAE 1X, usando um forno de micro-ondas. Adicione brometo de etídio a uma concentração final de 0,5 microgramas por mililitro.Em seguida, lançar o gel agarose. Quando solidificado, coloque-o em uma unidade de eletroforese. Carregue uma escada de DNA de tamanho conhecido, e as amostras de PCR misturadas com DNA carregando corante em poços.Execute amostras a 75 volts por 45 minutos. E visualize bandas em um transilluminator UV ou com um sistema de imagem em gel. Em seguida, purifique o produto PCR com um kit de extração de gel de acordo com o protocolo dos fabricantes e meça a concentração do DNA purificado com um espectotômetro.Em seguida, armazene o DNA purificado a menos 20 celsius no buffer TE. Para iniciar mutagênese direcionada ao local com um PCR de 2 passos, primeiro use o modelo de DNA do tipo selvagem, depois o primer emparelha dois, um e dois, dois, para cinco mutações de primer, ou pares de primer dois, dois e dois, três para três mutações priment para obter o produto PCR dois. Valide o produto PCR por eletroforese de gel, purificar o produto PCR e medir sua concentração como descrito anteriormente.Em seguida, use o modelo de DNA tipo selvagem e o produto PCR dois como o primer, juntamente com primer dois, três para cinco mutação priment, ou primer dois, um para três mutação priment, para obter o produto PCR três. Valide o produto PCR por eletroforese de gel, purificar o produto PCR e medir sua concentração como descrito anteriormente. Em seguida, armazene o DNA purificado a menos 20 graus celsius no buffer TE.Para iniciar a mutagênese direta do local com um PCR de 3 passos, primeiro use o modelo de DNA do tipo selvagem e os pares de primer três, um e três, dois para obter o produto PCR dois. Use o modelo de DNA do tipo selvagem e os pares de primer três, três e três, quatro, para obter o produto PCR três. Use o modelo de DNA do tipo selvagem e os pares de primer três, três e três, quatro, para obter o produto PCR três.Valide o produto PCR por eletroforese de gel, purificar o produto PCR e medir sua concentração como descrito anteriormente. Por fim, use dois a cinco nanogramas de produtos PCR dois e três como modelo, juntamente com os pares de primer três, um e três, quatro, para obter o produto PCR quatro. Valide o produto PCR por eletroforese de gel, purificar o produto PCR e medir sua concentração como descrito anteriormente.Armazene o DNA purificado a menos 20 graus celsius no buffer TE. Neste estudo, foram utilizadas mutagênese direcionadas a 2 passos e 3 etapas para investigar as interações de RNA relativas à regulação pós-transcricional do CsgD. O CsgD do tipo selvagem foi amplificado para produzir IA do produto PCR, e o mcaS do tipo selvagem foi amplificado para produzir o produto PCR IB. Utilizando uma estratégia pcr de 3 passos, os produtos PCR IIA e IIIA foram sintetizados nos dois primeiros passos, e o IVA na terceira etapa para introduzir mutações em CsgD.Da mesma forma, mutações gratuitas direcionadas ao local foram introduzidas no MCAS para produzir produtos PCR IIB, IIIB, nas duas primeiras etapas, e IVB na terceira etapa. A análise de manchas ocidentais mostrou que, enquanto a expressão de mcaS tipo selvagem impede a tradução de CsgD tipo selvagem, mutações em mcaS ou CsgD aliviam a repressão observada. No entanto, mutações tanto no CsgD quanto no MCAS impedem a tradução de CsgD.Utilizando uma estratégia pcr de 2 passos, os produtos PCR IIC, IID, IIE, IIF e IIG, foram sintetizados na primeira etapa, e os produtos PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG, no segundo passo para introduzir mutações em todo o DNA CsgD. Os resultados da EMSA da vinculação HFQ a RNAs de tipo selvagem e mutante transcritos in vitro, sintetizados usando produtos PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG, mostraram o aumento dos valores de KD dos alelos mutantes. Isso provou que o HFQ poderia ligar-se menos eficientemente aos mutantes.Além disso, o HFQ possui vários locais de vinculação em CsgD, o que é mostrado pelos três turnos observados para o RNA do tipo selvagem. No entanto, apenas dois locais de ligação são observados para diferentes RNAs mutantes. Assim, a abordagem mutacional dirigida ao local identifica estruturas primárias e ou secundárias do MRNA CsgD que são importantes para a ligação completa do HFQ.O método para mutagênese direcionado ao local descrito aqui depende do PCR. Boas práticas de PCR são cruciais para o método e podem exigir otimização para ser bem sucedida. Mutagênese dirigida ao local só é poderosa com todos os três métodos como EMSA e Western Blotting.Outros métodos, por exemplo, incluem vários ensaios estruturais e alguns ensaios de atividade, e estudos de modificação de pós-tradução.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicação de interferometria Biolayer (BLI) para o estudo de interações proteína-proteína em transcrição

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Rotulagem metabólica extremamente rápida e específica do RNA in vivo com 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Extração rápida e econômica do RNA do tecido pancreático de rato

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Lysine Acetilation specific de Histones para Reconstituição Nucleososome usando Expansão do Código Genético em Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...