Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
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Los autores desean dar las gracias a subvenciones de la política de acceso abierto Universidad de Dinamarca Meridional.

1. selección de vector
<ol><li>Elegir un vector para realizar experimentos posteriores con. Cualquier vector es aplicable para este método PCR de 2 y 3 pasos.</li>
	<li>Basado en elección del vector, seleccionar enzimas de restricción apropiadas para la clonación.</li>
</ol>2. primer diseño por sitio dirigido mutagénesis
<ol><li>Decidir entre bien la estrategia PCR paso 2 o 3 pasos (paso 2 es sólo para las mutaciones < 200 bp de cualquiera de los extremos de la DNA de interés). Para l...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli:+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA.">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li><li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli.">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

Mutagénesis sitio-dirigida tiene una amplia gama de aplicaciones, y aquí, se incluyeron como ejemplos de cómo hacer conclusiones biológicas mediante la técnica de los resultados representativos de un experimento in vitro y en vivo. Mutagénesis sitio-dirigida ha sido durante mucho tiempo el estándar de oro para los estudios de interacción de la RNA. La fuerza de la técnica radica en la combinación de la introducción de mutaciones relevantes con posteriores ensayos y experimentos (por ejemplo, western blot o EMS...

ADN se refiere a menudo como el plan de acción de una célula viva ya que todas las estructuras de la célula están codificadas en la secuencia de su ADN. Replicación exacta y mecanismos de reparación del ADN aseguran que se producen sólo muy bajas tasas de mutaciones, que es esencial para mantener la correcta funciones de genes codificados. Los cambios de la secuencia del ADN pueden afectar funciones sucesivas en diferentes niveles a partir de ADN (reconocimiento de factores de transcripción y las enzimas de restricción), entonces RNA (complementariedad de pares de base y alteraciones de la estructura secundaria) o proteínas (aminoácidos ácido sustituciones, supresiones, adiciones o cambios de marco). Mientras que muchas mutaciones no afectan significativamente la función gene, algunas mutaciones en el ADN pueden tener implicaciones enormes. Así, la mutagénesis sitio-dirigida es una valiosa herramienta para el estudio de la importancia de sitios específicos del ADN en todos los niveles.
Este protocolo describe un enfoque de mutagénesis dirigida utilizado para introducir mutaciones específicas. El protocolo se basa en dos estrategias diferentes de la polimerización en cadena: un paso de 2 o un PCR de 3 pasos. La PCR de 2 pasos es aplicable si la mutación deseada está cerca del extremo 5' o el extremo 3' del ADN de interés (< 200 pares de bases (bp) desde el extremo) y la PCR de 3 pasos es aplicable en todos los casos.
En el enfoque PCR de 2 pasos, 3 cartillas están diseñados, en la que está diseñado un conjunto de iniciadores para amplificar el ADN de interés (cartillas 1 y 3, adelante y atrás, respectivamente) y una sola cartilla está diseñada para incorporar la mutación. La mutación de la introducción de la cartilla (cartilla 2) debe tener una orientación inversa, si la mutación está cerca del extremo 5' y una orientación hacia adelante si la mutación es cerca del extremo 3'. En el primer paso de la polimerización en cadena, cartilla 1 + 2 o 2 + 3 amplifica un fragmento pequeño cerca del extremo 5' o 3' final, respectivamente. El producto resultante de la polimerización en cadena se utiliza entonces como una cartilla en el paso dos con la cartilla de 1 o 3, lo que resulta en un producto PCR con una mutación en el ADN de interés (figura 1A).
En la PCR 3 pasos, 4 cartillas están diseñados, en la que está diseñado un conjunto de iniciadores para amplificar el ADN de interés (cebadores 1 y 4, adelante y atrás, respectivamente) y un conjunto de iniciadores está diseñado para incorporar mutaciones específicas con la superposición de complementariedad (cartillas 2 y 3, atrás y adelante, respectivamente). En el paso uno y dos, cartillas 1 + 2 y 3 + 4 amplifican el extremo 5' y 3'. En el paso tres, los productos resultantes de la polimerización en cadena del paso uno y dos se utilizan como plantillas y amplificado con cebadores 1 + 4. Así, el producto resultante de la polimerización en cadena es el ADN de interés con la mutación deseada (figura 1B).
Mientras que el ADN mutado puede usarse para cualquier aplicación posterior, este protocolo describe cómo volver a combinar el ADN en un vector de clonación. El uso de vectores de clonación tiene varias ventajas tales como facilidad de clonación y aplicaciones experimentales específicas dependiendo de características del vector. Esta función se utiliza a menudo para estudios de interacción de la RNA. Otra técnica para estudios de interacción de la RNA es sondear estructural del ARN en complejo con otro RNA1,2 o proteína3,4. Sin embargo, sondeo estructural sólo se realiza in vitro mientras que mutagénesis sitio-dirigida y posterior clonación permiten estudios de interacción in vivo.
Mutagénesis dirigida se ha utilizado extensivamente para estudios de interacción de la RNA presentada aquí. Sin embargo, el método clave acerca de 2 - o 3-step PCR es aplicable a cualquier pieza de ADN y así no sólo se limita a los estudios de interacción de la RNA.
Para ejemplificar la técnica y sus posibles usos, se utiliza la caracterización de las regiones importantes para la regulación postranscripcional de la ARNm, csgD, de Escherichia coli (e. coli). En e. coli, csgD es dirigida por el pequeño ARN no codificante, McaS, en cooperación con una proteína Hfq, para reprimir la expresión de la proteína CsgD2,4,5. La técnica se utiliza para introducir mutaciones en la región de bases entre csgD y McaS y el sitio de unión de Hfq de csgD. El ADN obtenido luego se clona en un vector adecuado para experimentos posteriores. Aplicaciones posteriores de la técnica incluyen experimentos tanto in vivo como in vitro. Para Ilustración, caracteriza en vivo usando un análisis de western blot ejemplo 1 y ejemplo 2 se caracteriza in vitro usando un análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA). En ambos casos, es ilustrada cómo dirigida mutagénesis puede utilizarse en combinación con otras técnicas para establecer conclusiones biológicas sobre un gen de interés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

Mutagénesis sitio-dirigida es una técnica utilizada para introducir mutaciones específicas en el ADN para investigar la interacción entre moléculas de ácido ribonucleico (sRNA) no codificante pequeñas y destino mensajero RNAs (mRNAs). Además, mutagénesis sitio-dirigida se utiliza para asignar sitios de unión de la proteína específica a RNA. Se describe una introducción de PCR basado en 2 pasos y 3 pasos de mutaciones. El enfoque es relevante para todos los estudios de interacciones RNA-RNA y proteína-RNA. En definitiva, la técnica se basa en el diseño de cartillas con la mutación deseada y a través de 2 o 3 pasos de PCR sintetizar un producto PCR de la mutación. El producto PCR entonces se utiliza para la clonación. Aquí, describimos cómo realizar mutagénesis sitio-dirigida con el enfoque de paso 2 y 3 para introducir mutaciones la sRNA, McaS y el mRNA, csgD, para investigar interacciones RNA-proteína y ARN-ARN. Aplicamos esta técnica para investigar las interacciones RNA; sin embargo, la técnica es aplicable a todos los estudios de mutagénesis (por ejemplo, las interacciones DNA proteína, aminoácido sustitución/supresión/adición). Es posible introducir a cualquier tipo de mutación excepto bases no natural pero la técnica sólo es aplicable si un producto PCR se puede utilizar para uso aguas abajo (por ejemplo, clonación y plantilla para más PCR).

Interacción del RNA con respecto a la regulación postranscripcional de csgD, fue elegida una configuración de doble vector: uno para expresar el csgD ARNm y otra para expresar el pequeño ARN no codificante, McaS. csgD fue reproducido en pBAD33, que es un plásmido arabinosa de la copia medio inducible con resistencia a cloranfenicol y McaS fue clonado en mini pNDM220 R1, que es un plásmido de copia baja inducible β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) isoprop?...

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Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagénesis sitio-dirigida para In Vitro e In Vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la ARN en Escherichia Coli

Mutagénesis sitio-dirigida es una técnica utilizada para introducir mutaciones específicas en el ácido desoxirribonucleico (ADN). Este protocolo describe cómo realizar mutagénesis sitio-dirigida con un 2-paso y enfoque, que es aplicable a cualquier fragmento de ADN de interés basado en la reacción en cadena de polimerasa de 3 pasos (PCR).

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

La mutagénesis dirigida por el sitio es útil para estudiar las interacciones moleculares, como el ARN-ARN, y las interacciones de proteínas de ARN. Este protocolo describe cómo realizar la mutagénesis dirigida por el sitio con un enfoque de PCR de dos o 3 pasos. Las principales ventajas del método son la diversidad de diferentes mutaciones que se pueden incorporar, así como una relativa facilidad y costo para hacerlo.Para empezar, utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación dos, uno y dos, tres, específicos para pares de 2 pasos, o pares de imprimación tres, uno y tres, cuatro, específicos para PCR de 3 pasos para obtener el producto PCR uno. Para validar los productos de PCR mediante electroforesis de gel de agarosa, haga un gel de 2% de agarosa disolviendo dos gramos de agarosa en 100 mililitros de tampón 1X TAE, utilizando un horno microondas. Añadir bromuro de etidio a una concentración final de 0,5 microgramos por mililitro.Luego echa el gel de agarosa. Cuando se solidifice, colóquelo en una unidad de electroforesis. Cargue una escalera de ADN de tamaño conocido, y las muestras de PCR mezcladas con tinte de carga de ADN en pozos.Ejecuta muestras a 75 voltios durante 45 minutos. Y visualice las bandas en un transiluminador UV o con un sistema de imágenes de gel. A continuación, purificar el producto PCR con un kit de extracción de gel según el protocolo de los fabricantes y medir la concentración del ADN purificado con un espectrofotómetro.A continuación, almacene el ADN purificado en menos 20 grados centígrados en el tampón TE. Para comenzar la mutagénesis dirigida por el sitio con una PCR de 2 pasos, primero utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje, luego la imprimación empareja dos, uno y dos, dos, para cinco mutaciones de imprimación, o pares de imprimación dos, dos y dos, tres para tres mutaciones priment para obtener el producto PCR dos. Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente.A continuación, utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y el producto PCR dos como la imprimación, junto con la imprimación dos, tres para cinco mutaciones priment, o primera dos, una para tres mutaciones priment, para obtener el producto PCR tres. Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente. A continuación, almacene el ADN purificado a menos 20 grados centígrados en el tampón TE.Para comenzar la mutagénesis directa en el sitio con una PCR de 3 pasos, utilice primero la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación tres, uno y tres, dos para obtener el producto PCR dos. Utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación tres, tres y tres, cuatro, para obtener el producto PCR tres. Utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación tres, tres y tres, cuatro, para obtener el producto PCR tres.Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente. Por último, utilice dos a cinco nanogramos de productos de PCR dos y tres como plantilla junto con los pares de imprimación tres, uno y tres, cuatro, para obtener el producto PCR cuatro. Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente.Almacene el ADN purificado a menos 20 grados centígrados en el tampón TE. En este estudio, se utilizaron mutagénesis dirigida por el sitio de 2 y 3 pasos para investigar las interacciones de ARN con respecto a la regulación post transcripción de la CsgD. El CsgD de tipo salvaje fue PCR amplificado para producir PCR producto IA, y el tipo salvaje mcaS fue PCR amplificado para producir PCR producto IB. Utilizando una estrategia de PCR de 3 pasos, los productos de PCR IIA y IIIA se sintetizaron en los dos primeros pasos, e IVA en el tercer paso para introducir mutaciones en CsgD.Del mismo modo, se introdujeron mutaciones gratuitas dirigidas al sitio en mcaS para producir productos de PCR IIB, IIIB, en los dos primeros pasos, y IVB en el tercer paso. El análisis de western blot mostró que si bien la expresión de mcaS de tipo salvaje impide la traducción de la CsgD de tipo salvaje, las mutaciones en mcaS o CsgD alivian la represión observada. Sin embargo, las mutaciones tanto en la CsgD como en la mcaS impiden la traducción de la ENFERMEDAD de Csg.Utilizando una estrategia de PCR de 2 pasos, los productos de PCR IIC, IID, IIE, IIF e IIG, se sintetizaron en el primer paso, y los productos de PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF y IIIG, en el segundo paso para introducir mutaciones en todo el ADN CsgD. Los resultados de la EMSA de la unión HFQ a los ARN mutantes y de tipo silvestre CsgD transcritos in vitro, sintetizados con productos de PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF y IIIG, mostraron el aumento de los valores de KD de los alelos mutantes. Esto demostró que HFQ podría unirse menos eficientemente a los mutantes.Además, HFQ tiene varios sitios de unión en CsgD, lo que se muestra en los tres turnos observados para el ARN de tipo salvaje. Sin embargo, sólo se observan dos sitios de enlace para diferentes ARN mutantes. Por lo tanto, el enfoque mutacional dirigido por el sitio identifica las estructuras primarias o secundarias del ARNm CsgD que son importantes para la unión completa de HFQ.El método de mutagénesis dirigida por el sitio descrito aquí se basa en la PCR. Las buenas prácticas de PCR son cruciales para el método y podrían requerir la optimización para tener éxito. La mutagénesis dirigida por el sitio sólo es poderosa con los tres métodos como EMSA e Western Blotting.Otros métodos, por ejemplo, incluyen varios ensayos estructurales y algunos ensayos de actividad, y estudios de modificación posterior a la traducción.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Investigación

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Cuantificación de la abundancia y la carga de los niveles de ARN de transferencia en Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicación de la interferometría de Biolayer (BLI) para el estudio de las interacciones proteínas y proteínas en la transcripción

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacciones con y la permeabilización de membrana de las mitocondrias cerebrales por Amiloide Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Etiquetado metabólico extremadamente rápido y específico de ARN In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Extracción rápida y rentable de ARN de tejido pancreático de rata

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

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Sitio Específico De La Acetilación De Lisina De Histonas Para La Reconstitución De Nucleosomas Utilizando La Expansión Del Código Genético En Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...