Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Författarna vill tacka Syddansk Universitet öppna politiska bidrag.

1. vector urval
<ol><li>Välja en vektor att utföra nedströms experiment med. Varje vektor är tillämplig för denna 2 - och 3-stegs PCR-metod.</li>
	<li>Baserat på valet av vektor, välja lämpliga restriktionsenzym för kloning.</li>
</ol>2. primer design för webbplatsen riktad mutagenes
<ol><li>Välja mellan antingen 2-steg eller 3 PCR-strategin (2-steg är endast för mutationer < 200 bp från vardera änden av DNA av intresse). För 2-stegs PCR, gå till steg 2.2 och 3-stegs PCR går...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli:+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA.">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li><li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli.">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

Webbplats riktad mutagenes har ett brett utbud av olika program, och här, representativa resultat från en in vivo och in vitro-experiment ingick som exempel på hur man gör biologiska slutsatser med hjälp av tekniken. Webbplats riktad mutagenes har länge varit den gyllengula standarden för RNA interaktionsstudier. Styrkan i tekniken ligger i kombinationen av att införa relevanta mutationer med efterföljande analyser och experiment (western blot eller EMSA) att dra slutsatser om specifika DNA webbplatser och deras...

DNA benämns ofta som blåkopian för en levande cell eftersom alla strukturer i cellen är kodade i sekvensen av dess DNA. Exakt replikering och DNA-reparationsmekanismer säkerställa att endast mycket låga priser av mutationer förekommer, vilket är viktigt för att upprätthålla rätt funktioner kodade gener. Förändringar i DNA-sekvensen kan påverka efterföljande funktioner på olika nivåer börjar med DNA (erkännande av transkriptionsfaktorer och restriktionsenzym), sedan RNA (baspar komplementaritet och sekundärt strukturera förändringar) och/eller protein (aminosyror sura substitutioner, borttagningar, tillägg eller ram-skift). Medan många mutationer inte påverkar geners funktion väsentligt, kan vissa mutationer i DNA har enorma konsekvenser. Således, webbplats riktad mutagenes är ett värdefullt verktyg för att studera betydelsen av specifika DNA webbplatser på alla nivåer.
Det här protokollet beskriver en riktad mutagenes strategi används för att införa specifika mutationer. Protokollet bygger på två olika PCR strategier: en 2-steg eller en 3-stegs PCR. 2-stegs PCR är tillämplig om önskad mutationen är nära slutet 5' eller 3' ände DNA av intresse (< 200 baspar (bp) från slutet) och 3-stegs PCR är tillämplig i alla fall.
I 2-steg närma sig PCR, 3 grundfärger är utformade, där en uppsättning primers är utformad för att förstärka DNA av intresse (grundfärger 1 och 3, framåt och bakåt, respektive), och en enda primer är utformad för att inkorporera mutationen. Mutationen att införa grundfärg (primer 2) bör ha en omvänd läggning om mutationen är nära slutet 5' och en framåt orientering om mutationen är nära slutet 3'. I det första steget för PCR förstärker primer 1 + 2 eller 2 + 3 ett litet fragment nära 5' slutet eller 3' slutet, respektive. PCR-produkten används sedan som en primer i steg två med primer 1 eller 3, vilket resulterar i en PCR-produkt med en mutation i DNA av intresse (figur 1A).
I 3-steg PCR, 4 primers är utformade, där en uppsättning primers är utformad för att förstärka DNA av intresse (grundfärger 1 och 4, framåt och bakåt, respektive) och en uppsättning primers är utformad för att inkorporera specifika mutationer med överlappande komplementaritet (primers 2 och 3, bakåt och framåt, respektive). I steg ett och två, grundfärger 1 + 2 och 3 + 4 förstärker 5' och 3' slutet. I steg tre, de resulterande PCR produkterna från steg ett och två används som mallar och förstärks med grundfärg 1 + 4. PCR-produkten alltså DNA av intresse med önskad mutationen (figur 1B).
Medan muterad DNA kan användas för alla efterföljande program, beskriver det här protokollet hur du kombinerar nytt DNA i en kloning vektor. Användningen av kloning vektorer har flera fördelar såsom användarvänlighet kloning och specifika experimentella tillämpningar beroende på funktioner av vektorn. Den här funktionen används ofta för RNA interaktionsstudier. En annan teknik för RNA interaktionsstudier är strukturella sondering av RNA i komplex med en annan RNA1,2 eller protein3,4. Men utförs strukturella sondera endast in vitro-medan webbplats riktad mutagenes och efterföljande kloning tillåter interaktionsstudier in vivo.
Webbplats riktad mutagenes har i stor utsträckning använts för RNA interaktionsstudier som presenteras här. Men den viktigaste metoden angående 2 - eller 3-steg PCR är tillämplig på någon bit av DNA och därmed inte bara begränsat till RNA-interaktionsstudier.
För att exemplifiera tekniken och dess möjliga användningsområden, används karakterisering av regioner som är viktiga för post-transcriptional reglering av mRNA, csgD, av Escherichia coli (E. coli). E. coli, csgD riktas av små icke-kodande RNA, McaS, i samarbete med ett protein, Hfq, att förtränga protein-uttryck av CsgD2,4,5. Tekniken används för att introducera mutationer att regionen base-ihopkoppling mellan csgD och McaS och Hfq bindande platsen för csgD. Den erhållna DNA är sedan klonade in en vektor som lämpar sig för efterföljande experiment. Nedströms tillämpningar av tekniken inkluderar både in vivo och in vitro-experiment. För illustration, exempel 1 kännetecknas i vivo med en western blot-analys och exempel 2 kännetecknas in vitro-med en elektroforetiska mobilitet Skift-analys (EMSA). I båda fallen är det illustrerade hur platsen riktad mutagenes kan användas i kombination med andra tekniker för att göra biologiska slutsatser om en gen av intresse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

Webbplats riktad mutagenes är en teknik som används för att införa specifika mutationer i DNA att undersöka samspelet mellan små icke-kodande ribonukleinsyra (sRNA) molekyler och målet messenger-RNA (mRNA). Dessutom används webbplats riktad mutagenes att mappa specifika protein bindningsställen till RNA. En 2-steg och 3 PCR-baserade införandet av mutationer beskrivs. Metoden är relevant för alla protein-RNA och RNA-RNA interaktionsstudier. Kort sagt, bygger tekniken på utforma grundfärger med den önskade Function"-mutation(er), och genom 2 eller 3 steg av PCR syntetisera en PCR produkt med mutationen. PCR-produkten används sedan för kloning. Här beskriver vi hur du utför webbplats riktad mutagenes med både 2 - och 3-stegs metoden att introducera mutationer i sRNA, McaS och mRNA, csgD, att undersöka RNA-RNA och RNA-protein interaktioner. Vi tillämpar denna teknik för att undersöka RNA interaktioner; tekniken är dock tillämpliga på alla mutagenes studier (t.ex. DNA-protein interaktioner, aminosyra ersättning/borttagning/tillägg). Det är möjligt att införa någon typ av mutation utom icke naturliga baser men tekniken är endast tillämplig om en PCR-produkten kan användas för efterföljande ansökan (t.ex. kloning och mall för ytterligare PCR).

Att undersöka RNA interaktioner angående post-transcriptional reglering av csgD, en dubbel vektor setup valdes: en att uttrycka den csgD mRNA och en annan för att uttrycka små icke-kodande RNA, McaS. csgD var klonade in pBAD33, som är en arabinos inducerbara medium-kopia plasmid med kloramfenikol motstånd och McaS var klonade in mini R1-pNDM220, som är en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducerbara låg kopia plasmid med ampicillin-resistens...

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Webbplats riktad mutagenes för In Vitro och i Vivo experiment exemplifieras med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Webbplats riktad mutagenes är en teknik som används för att införa specifika mutationer i deoxiribonukleinsyra (DNA). Det här protokollet beskriver hur man gör webbplats riktad mutagenes med en 2-steg och 3-stegs polymeras-kedjereaktion (PCR) baserat tillvägagångssätt som är tillämpliga på alla DNA-fragment av intresse.

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Plats-riktad mutagenes är användbart för att studera molekylära interaktioner, såsom RNA-RNA, och RNA-protein interaktioner. Detta protokoll beskriver hur du utför plats-riktad mutagenes med en två eller 3-stegs PCR-metoden. De viktigaste fördelarna med metoden är mångfalden av olika mutationer som kan införlivas, samt en relativ lätthet och kostnad för detta.Till att börja, använd den vilda-typ DNA-mallen och primerpar två, ett och två, tre, specifika för 2-stegs, eller primer par tre, ett och tre, fyra, specifika för 3-stegs PCR för att erhålla PCR produkt ett. För att validera PCR-produkter genom agarosgelelektrofores, gör en 2%agarosgel genom att lösa upp två gram agaros i 100 milliliter 1X TAE-buffert, med hjälp av en mikrovågsugn. Tillsätt ethidiumbromid vid en slutkoncentration på 0, 5 mikrogram per milliliter.Sedan kasta agarosgelen. När stelnat, placera den i en elektrofores enhet. Ladda en DNA-stege av känd storlek, och PCR-proverna blandas med DNA-lastningsfärgämne i brunnar.Kör prover på 75 volt i 45 minuter. Och visualisera band på en UV-transilluminator eller med ett gelbildsystem. Därefter rena PCR-produkten med en gel extraktionssats enligt tillverkarnas protokoll och mäta koncentrationen av den renade DNA med en spektrofotometer.Förvara sedan det renade DNA:t vid minus 20 celsius i TE-buffert. För att börja plats-riktade mutagenesis med en 2-stegs PCR, först använda vild-typ DNA-mallen, sedan primern par två, en och två, två, för fem primer mutationer, eller primer par två, två och två, tre för tre priment mutationer att erhålla PCR produkt två. Validera PCR-produkten genom gelelektrofores, rena PCR-produkten, och mät dess koncentration enligt beskrivningen tidigare.Använd sedan den vilda dna-mallen och PCR-produkten två som primer, tillsammans med primer två, tre för fem priment mutation, eller primer två, en för tre priment mutation, för att erhålla PCR produkt tre. Validera PCR-produkten genom gelelektrofores, rena PCR-produkten, och mät dess koncentration enligt beskrivningen tidigare. Förvara sedan det renade DNA:t vid minus 20 grader celsius i TE-buffert.För att börja site-direct mutagenesis med en 3-stegs PCR, först använda vild-typ DNA-mall och primer par tre, ett och tre, två för att erhålla PCR produkt två. Använd den vilda-typ DNA-mallen och primerpar tre, tre och tre, fyra, för att erhålla PCR produkt tre. Använd den vilda-typ DNA-mallen och primer par tre, tre och tre, fyra, för att få PCR produkt tre.Validera PCR-produkten genom gelelektrofores, rena PCR-produkten, och mät dess koncentration enligt beskrivningen tidigare. Slutligen använda två till fem nanogram av PCR produkter två och tre som mallen tillsammans med primer par tre, ett och tre, fyra, för att erhålla PCR produkt fyra. Validera PCR-produkten genom gelelektrofores, rena PCR-produkten, och mät dess koncentration enligt beskrivningen tidigare.Förvara det renade DNA:t vid minus 20 grader celsius i TE-buffert. I denna studie användes 2-stegs och 3-stegs plats-riktad mutagenes för att undersöka RNA interaktioner avseende post transkriptional reglering av CsgD. Den wild-type CsgD var PCR förstärkt för att ge PCR produkt IA, och den wild-type mcaSen var PCR förstärkt för att ge PCR-produkt IB. Med hjälp av en 3-stegs PCR-strategi, PCR produkter IIA och IIIA var syntetiserade i de två första stegen, och IVA i det tredje steget att införa mutationer i CsgD.På samma sätt infördes gratis plats-riktade mutationer i mcaS att ge PCR produkter IIB, IIIB, i de två första stegen och IVB i det tredje steget. Western blot analys visade att medan uttryck för vilda-typ mcaS förhindrar översättning av vilda-typ CsgD, mutationer i antingen mcaS eller CsgD lindrar den observerade förtryck. Mutationer i både CsgD och mcaS förhindrar dock översättning av CsgD.Med hjälp av en 2-stegs PCR-strategi, PCR produkter IIC, IID, IIE, IIF, och IIG, var syntetiserade i det första steget, och PCR produkter IIIC, IIID, IIIE, IIIF och IIIG, i det andra steget att införa mutationer till hela CSGD DNA. EMSA resultat av HFQ bindande till in vitro transkriberas CsgD vild-typ och mutant RNAs, syntetiseras med hjälp av PCR produkter IIIC, IIID, IIIE, IIIF och IIIG, visade ökade KD värden av mutanta alleler. Detta bevisade att HFQ kunde binda mindre effektivt till mutanterna.Dessutom har HFQ flera bindande platser på CsgD, som visas av de tre förskjutningarna som observeras för det wild-type RNA. Endast två bindningsställen observeras dock för olika mutanta RNAs. Således identifierar den plats-riktade mutational tillvägagångssättet primära och eller sekundära strukturer av CsgD mRNA som är viktiga för fullständig bindning av HFQ.Metoden för plats-riktad mutagenesis beskrivs här bygger på PCR. Bra PCR-metoder är därför avgörande för metoden och kan kräva optimering för att lyckas. Plats-riktad mutagenesis är bara kraftfull med alla tre metoder sådana EMSA och Västra Blotting.Andra metoder, till exempel, inkluderar olika strukturella analyser och vissa aktivitetsanalyser, och efter översättningsmodifieringsstudier.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detektering av den pH-beroende aktivitet för<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; och<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifiering av överflödet och laddning nivåer av överföring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Extremt snabb och specifik metabolisk märkning av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snabb och kostnadseffektiv RNA-utvinning av råtta bukspottskörteln vävnad

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Platsspecifik lysin acetylering av histoner för nukleosomkonstitution med hjälp av genetisk kodexpansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...