Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Yazarlar Güney Danimarka Üniversitesi açık erişim ilkesi hibe teşekkür etmek istiyorum.

1. vektör seçimi
<ol><li>Bir vektör ile aşağı akım deneyler gerçekleştirmek için seçin. Herhangi bir vektör bu 2 ve 3 adım PCR yöntemi için geçerlidir.</li>
	<li>Vektör seçim üzerinde bağlı olarak, uygun enzimleri klonlama için seçin.</li>
</ol>2. astar tasarım site mutagenesis yönetmen
<ol><li>Her iki 2-adım veya 3 adımlı PCR strateji arasında karar (2-adımdır sadece mutasyonlar için < 200 faiz DNA'ın iki ucundan kan basıncı). 2-adım PCR adım 2.2 gidin ve ...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli:+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA.">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li><li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli.">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

Site yönettiği mutagenesis farklı uygulamaları geniş bir dizi var ve burada, bir içinde vivo ve tüp bebek deney temsilcisi sonuçlarından nasıl biyolojik sonuçlar yöntemi kullanarak yapmak için örnek olarak dahil edildi. Site yönettiği mutagenesis uzun süre RNA etkileşim çalışmaları için altın standart olmuştur. Aşağı akım deneyleri ve deneyler gen ürünlerinde fonksiyonları içinde belirli DNA siteleri ve onların önemi hakkında sonuçlara (örneğin, Batı leke veya Emsan) ile ilgili mut...

Tüm yapılar hücrenin DNA'sının sırayla kodlanır ettiği DNA kez için bir yaşam hücre planı denir. Doğru çoğaltma ve DNA tamir mekanizmaları mutasyonların sadece çok düşük oranları, doğru kodlanmış genler fonksiyonların sürdürülmesi için gerekli olduğu ortaya emin olun. Değişiklikleri DNA dizisinin farklı düzeylerde DNA'sını (transkripsiyon faktörleri ve enzimleri tarafından tanınması), sonra RNA (ikincil yapı değişiklik ve baz çifti tamamlayıcılık) ve/veya protein (amino başlayarak birbirini izleyen işlevleri etkileyebilir asit oyuncu değişikliği, silme, ekleme veya çerçeve-vardiya). Birçok mutasyonlar gen işlevini önemli ölçüde etkilemez ise bazı mutasyonlar DNA büyük etkileri olabilir. Böylece, mutagenesis site yönettiği belirli DNA siteleri her düzeyde önemi eğitim için değerli bir araçtır.
Bu iletişim kuralı belirli mutasyonlar tanıtmak için kullanılan bir hedeflenen mutagenesis yaklaşımı açıklar. Protokol iki farklı PCR stratejileri üzerinde dayanır: 2 adım veya 3 adımlı PCR. 2-adım PCR istenen mutasyon 5' uç ya da ilgi DNA 3' sonu yakın ise geçerlidir (< 200 baz çifti (bp) sonundan itibaren) ve 3-adım PCR tüm durumlarda geçerlidir.
2-adım PCR yaklaşımda, 3 astar tasarlanmıştır, hangi bir astar kümesi DNA'sı (astar 1 ve 3, ileriye ve geriye doğru sırasıyla) faiz yükseltmek için tasarlanmıştır ve tek bir astar mutasyon birleştirmek için tasarlanmıştır. Mutasyon 5' ucu ve ileriye doğru bir yönelim yakın ise mutasyon 3' ucu yakın ise astar (astar 2) tanıtımı mutasyon geriye doğru bir yönelim olmalı. İlk PCR adımda astar 1 + 2 ya da 2 + 3 5' uç veya 3' ucu yakın küçük bir parça sırasıyla güçlendirir. Elde edilen PCR ürünü sonra iki adımda bir astar astar 1 veya 3, böylece bir PCR ürünü faiz (Şekil 1A) DNA'daki bir mutasyon ile sonuçlanan ile kullanılır.
3-adım PCR 4 astar tasarlanmış, astar kümesi DNA'sı (astar 1 ve 4, ileriye ve geriye doğru sırasıyla) faiz yükseltmek için tasarlanmıştır ve astar bir dizi belirli mutasyonlar tamamlayıcılık örtüşen ile birleştirmek için tasarlanmıştır (astar 2 ve 3, geri ve ileri, sırasıyla). Bir ve iki adımda, astar 1 + 2 ve 3 + 4 5' ve 3' son yükseltmek. Üç adımda elde edilen PCR urun adım bir ve iki şablon olarak kullanılır ve astar 1 + 4 ile güçlendirilmiş. Böylece, elde edilen PCR ürünü istediğiniz mutasyon (Şekil 1B) ile ilgi DNA'sı.
Mutasyona uğramış DNA-ebilmek var olmak kullanılmış için aşağı akım herhangi bir uygulama iken, bu iletişim kuralını DNA klonlama vektör yeniden birleştirmek açıklar. Vektörel çizimler klonlama kullanım kolaylığı klonlama gibi çeşitli avantajları vardır ve özelliklere bağlı olarak belirli deneysel uygulamalar Yöneyin. Bu özellik genellikle RNA etkileşimi çalışmalar için kullanılır. Başka bir RNA etkileşim çalışmaları için karmaşık başka bir RNA1,2 veya protein3,ile4RNA'ın yapısal sondalama tekniğidir. Mutagenesis site yönettiği ve sonraki klonlama için etkileşim çalışmaları içinde vivo izin ise ancak, yapısal sondalama sadece tüp bebek gerçekleştirilir.
Site yönettiği mutagenesis yoğun olarak burada sunulan RNA etkileşim çalışmaları için kullanılmıştır. Ancak, anahtar yöntemi ile ilgili 2 - veya 3-adım PCR DNA herhangi bir parça için geçerlidir ve böylece sadece RNA-etkileşim çalışmaları için sınırlı.
Teknik ve olası kullanımları örneklemek için bölgeler için mRNA, csgD, Escherichia coli (e.coli) çoğu düzenleme önemli karakterizasyonu kullanılır. E. coli, csgD içinde küçük kodlamayan RNA tarafından McaS, protein, protein-ifade CsgD2,4,5bastırmak için Hfq, ile işbirliği içinde hedeflenmektedir. Teknik mutasyonlar McaS arasındaki csgD Bankası eşleştirme bölge ve csgDHfq bağlama site tanıtmak için kullanılır. Elde edilen DNA sonra sonraki deneyler için uygun bir vektör içine klonlanmış. Tekniğin aşağı akım uygulamalar içinde vivo, tüp bebek deneyleri içerir. İçin örnek, örnek 1 içinde vivo bir western blot yöntemi kullanarak karakterizedir ve örnek 2 tüp bebek bir elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan) kullanarak karakterizedir. Her iki durumda da, o resimli nasıl site yönettiği mutagenesis birlikte diğer teknikleri ile ilgi bir gen hakkında biyolojik sonuçlar yapmak için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

Site yönettiği mutagenesis küçük kodlamayan ribonükleik asit (sRNA) molekülleri ve hedef haberci RNA (mRNA) arasındaki etkileşimi araştırmak için DNA belirli mutasyonların tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Buna ek olarak, site yönettiği mutagenesis belirli protein bağlayıcı siteleri için RNA eşlemek için kullanılır. 2-adım ve 3-adım dayalı PCR giriş mutasyonların açıklanmıştır. Tüm protein-RNA ve RNA, RNA-RNA etkileşim çalışmaları ile ilgili bir yaklaşımdır. Kısacası, teknik astar istenen mutation(s) ile 2 veya 3 adımda bir PCR ürünü mutasyon ile sentezleme PCR aracılığıyla tasarlama üzerinde dayanır. PCR ürünü daha sonra klonlama için kullanılır. Burada, nasıl site yönettiği mutagenesis mutasyonlar sRNA, McaS ve mRNA, RNA, RNA-RNA ve RNA-protein etkileşimleri araştırmak için csgD, tanıtmak için her iki 2 ve 3 adım yaklaşım ile gerçekleştirileceğini açıklar. RNA etkileşimleri araştırmak için bu tekniği uygulamak; Ancak, tüm mutagenesis çalışmaları (örneğin, DNA-protein etkileşimleri, amino asit ekleme/değiştirme/silme) için uygun bir tekniktir. Mutasyon doğal olmayan üsler dışında herhangi bir tür tanıtmak mümkün ama tekniği yalnızca PCR ürünü aşağı akım uygulama (örneğin, klonlama ve daha fazla PCR için şablon) için kullanılması durumunda geçerlidir.

RNA etkileşimleri ile ilgili çoğu, düzenleme, csgD, bir çift vektör Kurulum seçildi araştırmak için: bir csgD ifade etmek için mRNA ve başka bir küçük kodlamayan RNA McaS ifade etmek için. csgD bir arabinoz indüklenebilir orta-kopya plazmid kloramfenikol direnci ile olan pBAD33 içine klonlanmış ve McaS izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) indüklenebilir düşük kopya plazmid olan mini R1 pNDM220, klonlanmış ile ampisilin direnç....

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Mutagenesis site yönettiği belirli mutasyonların Deoksiribonükleik asit (DNA) tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Bu iletişim kuralı site yönettiği mutagenesis ile 2 adım nasıl açıklar ve ilgi herhangi bir DNA parçası geçerlidir yaklaşım 3 adımlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) dayalı.

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Site yönelimli mutagenez, RNA-RNA ve RNA protein etkileşimleri gibi moleküler etkileşimleri incelemek için yararlıdır. Bu protokol, iki veya 3 adımlı PCR yaklaşımıyla site yönelimli mutagenezinnasıl gerçekleştirilini açıklar. Yöntemin temel avantajları, dahil edilebilen farklı mutasyonların çeşitliliğinin yanı sıra göreceli bir kolaylık ve bunun maliyetidir.Başlamak için, 2 adımiçin özel iki, bir ve iki, üç veya üç, üç, dört astar çiftleri, PCR ürün bir elde etmek için 3 adımpcr için özel vahşi tip DNA şablonu ve astar çiftleri kullanın. Agarose jel elektroforez ile PCR ürünleri doğrulamak için, bir mikrodalga fırın kullanarak, 1X TAE tampon 100 mililitre agarose iki gram eriterek% 2 agarose jel olun. Mililitre başına 0,5 mikrogram son konsantrasyonda ethidyum bromür ekleyin.Sonra agarose jel döküm. Katılaştırıldığında, bir elektroforez ünitesine yerleştirin. Bilinen boyutta bir DNA merdiveni yükleyin ve DNA yükleme boyası ile karıştırılmış PCR örnekleri kuyulara.Örnekleri 75 voltta 45 dakika çalıştırın. Uv transilluminator'da veya jel görüntüleme sistemiyle bantları görselleştirin. Daha sonra, pcr ürününü üretici protokolüne göre bir jel çıkarma kiti ile arındırın ve saflaştırılmış DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün.Sonra arındırılmış DNA'yı eksi 20 santigrat derecede TE tamponunda saklayın. 2 adımlı bir PCR ile site yönelimli mutagenez başlamak için, ilk vahşi tip DNA şablonu kullanın, sonra astar çiftleri iki, bir ve iki, beş astar mutasyonları için, ya da astar çiftleri iki, iki, ve iki, üç üç astar mutasyonlar PCR ürün iki elde etmek için. PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün.Daha sonra yabani tip DNA şablonu ve PCR ürün iki astar olarak, birlikte astar iki, üç beş priment mutasyon, ya da astar iki, üç priment mutasyon için bir, PCR ürün üç elde etmek için kullanın. PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün. Sonra arındırılmış DNA'yı TE tamponunda eksi 20 derecede saklayın.3 adımlı bir PCR ile site ye doğrudan mutagenezi başlatmak için, ilk olarak yabani tip DNA şablonu ve üç, bir ve üç, iki çift PCR ürün iki elde etmek için astar çiftleri kullanın. PCR ürün üç elde etmek için vahşi tip DNA şablonu ve astar çiftleri üç, üç ve üç, dört kullanın. PCR ürün üç elde etmek için vahşi tip DNA şablonu ve astar çiftleri üç, üç ve üç, dört, kullanın.PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün. Son olarak PCR ürün dört elde etmek için, üç, bir ve üç, dört astar çiftleri ile birlikte şablon olarak PCR ürünleri iki ila beş nanogram kullanın. PCR ürününü jel elektroforez ile doğrulayın, PCR ürününü arındırın ve daha önce açıklandığı gibi konsantrasyonunu ölçün.Saflaştırılmış DNA'yı EKSI 20 santigrat derecede TE tamponunda saklayın. Bu çalışmada, CSGD'nin transkripsiyonel düzenlemesi ile ilgili RNA etkileşimlerini araştırmak için 2 adımlı ve 3 aşamalı site yönelimli mutagenez kullanılmıştır. Yabani tip CsgD PCR ürün IA verim pcr amplifiye edildi, ve vahşi tip mcaS PCR ürün IB verim pcr amplifiye edildi. 3 adımlı PCR stratejisi kullanılarak, PCR ürünleri IIA ve IIIA ilk iki adımda sentezlendi ve CsgD'de mutasyonları tanıtmak için üçüncü adımda IVA sentezlendi.Benzer şekilde, mcaS'de pcr, IIIB, ilk iki adımda ve IVB'yi üçüncü adımda teslim etmek için ücretsiz site yönelimli mutasyonlar ortaya konmuşve bu mutasyonlar ortaya konmuşoldu. Batı leke analizi, yabani tip mcaS'nin ekspresyonu yabani tip CSGD'nin çevrilmesini engellerken, mcaS veya CsgD'deki mutasyonların gözlenen baskıyı hafifletdiğini göstermiştir. Ancak hem CsgD hem de mcaS'deki mutasyonlar CsgD'nin çevrilmesini engeller.2 adımlık BIR PCR stratejisi kullanılarak, PCR ürünleri IIC, IID, IIE, IIF ve IIG, ilk adımda sentezlendi ve PCR ürünleri IIIC, IIID, IIIE, IIIF ve IIIG, tüm CsgD DNA mutasyonları tanıtmak için ikinci adımda sentezlendi. PCR ürünleri IIIC, IIID, IIIE, IIIF ve IIIG kullanılarak sentezlenen in vitro transkripsiyonu CsgD yabani tipi ve mutant RNA'lara bağlanan HFQ'nun EMSA sonuçları mutant alellerin KD değerlerinin arttığını göstermiştir. Bu, HFQ'nin mutantlara daha az verimli bir şekilde bağlanabileceğini kanıtladı.Ayrıca HFQ'da CsgD'de yabani tip RNA için gözlenen üç vardiya ile gösterilen birkaç bağlama alanı vardır. Ancak, farklı mutant RNA'lar için sadece iki bağlama alanı gözlenmektedir. Bu nedenle, siteye yönelik mutasyonel yaklaşım, HFQ'nun tam bağlanması için önemli olan CsgD mRNA'nın primer ve veya sekonder yapılarını tanımlar.Burada açıklanan site yönelimli mutagenez yöntemi PCR'ye dayanır. İyi PCR uygulamaları yöntem için çok önemlidir ve başarılı olmak için optimizasyon gerektirebilir. Site yönelimli mutagenez sadece emsa ve Batı Blotting gibi üç yöntem ile güçlüdür.Diğer yöntemler, örneğin, çeşitli yapısal tahliller ve bazı etkinlik testleri ve çeviri sonrası değişiklik çalışmaları içerir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Rat Pankreas Dokusunun Hızlı ve Uygun Maliyetli RNA Ekstraksiyonu

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...