Vores protokol giver forskerne mulighed for at isolere bioaktive signalmolekyler, der anvendes af krybdyr i kemisk kommunikation. Samt adskillelse og rensning af disse forbindelser til yderligere test, eller endda identifikation. Ved hjælp af denne metode, forskere kan få en kilde til kemiske signaler og derefter udtrække dem for deres kvantificering eller bioassay brug isoleret.
Demonstration af proceduren i dag vil være Holly Rucker, en ærer afhandling studerende fra mit laboratorium. Begynd med at anbringe fem centimeter kvadratiske stykker i en forseglelig glasbeholder med et hexankompatibelt låg og tilføje nok hexan til beholderen til at nedsænke skurets hudstykker helt ned, før beholderen forsegles. Den næste dag, bruge rene metal kraftbefæstelse til at fjerne skuret stykker, ryste stykkerne, som de er fanget for at bevare eventuelle resterende hexan i beholderen.
Til bestemmelse af den ekstraudlede lipidmasse overføres ekstraktet til en forvejet, rund bundkolbe og tændes for vakuumkilden til den roterende fordamper, og sørg for, at vakuumtrykket er tilstrækkeligt til at holde kolben fast på kondensatorens hals. Åbn udluftningen for enden af kondensatoren, skub kolben på kondensatorens hals, og luk udluftningen for at forsegle systemet. Efter at have sørget for, at kolben ikke kan kobles fra kondensatoren, når kolben frigives.
Kolben sænkes, indtil kun de nederste 10 % af kolben rører vandet i badet, og rotationen påbegyndes med middel hastighed. Hvis vakuum, hastighed, kondensator flow, og bad temperatur er optimale opløsningsmiddel damp forlader kolben vil kondensere på spolen og dryppe ind i genvinding kolben. Prøven fordampes under vakuum, indtil der er synlig for en perle væske med en diameter på under 1 centimeter i kolbens bund.
Sluk derefter for rotationen og vakuum, og løft kolben ud af badet. Hold kolbens hals, når vakuumtætningen frigives, og drej halsen til side af kolben fra kondensatoren. Perle af væske i ekstraktet vil størkne som hexan fordamper.
Når perle er tørret ved stuetemperatur i ca. fem minutter, danner lipiderne en gennemsigtig hvid til gul voks i kolben. Kolben vejes for at opnå den endelige masse og opløse lipiderne i det registrerede volumen hexan for at give et milligram eller mere lipid pr. milliliter hexan. For at forberede en kromatografi kolonne, bruge en træ dyvel stang, længere end kolonnen til at placere en fire-af-fire centimeter kvadrat af foldet glasfiber i bunden af et glas kromatografi kolonne.
Fastgør kolonnen i en røghætte til et standardringsstativ, og åbn stophanen. Dernæst hældes vasket og tørret sand i kolonnen, indtil cirka tre centimeter sand hviler over glasfiber. Placer derefter mørkt papir under kolonnen, og tryk forsigtigt på det.
Nu skal du placere en 500 milliliter bæger under kolonnen og langsomt våd sandet med ca 25 milliliter hexan, lukke stophanen, når der er ca 0,5 centimeter hexan over sandet. For at aktivere den neutrale illumina, pipette deioniseret vand af et volumen svarende til 6% af illumina masse i dråber i hele illumina. Og dække kolben af aktiveret illumina, kraftigt hvirvlende opløsningen til jævnt sprede ladningen.
Når der ikke synlige klumper af illumina tilbage, tilsættes hexan, indtil illumina er helt dækket med omkring 0,5 centimeter hexan. Kolben hvirvles om for at danne en gylle, og der anbringes et nyt 500 milliliterglasbæger under kolonnen. Åbn stophanen, så hvirvle illumina igen, før støt hælde illumina i en ventileret tragt holdt i reservoiret af kolonnen, idet det pas på, at illumina afregner jævnt i kolonnen, og at ingen store bobler eller revner form.
Kolonnen dannes, når toppen af illumina er stabil og cirka fire centimeter under halsen af kolonnen i bunden af reservoiret. Brug derefter en pipette til at skylle indersiden af reservoiret med hexan for resterende illumina, og tilsæt forsigtigt et andet lag sand oven på illumina til cirka en centimeter under reservoiret. For fraktionering af lipid ekstrakt, bruge en lang glas pipette til at overføre lipid prøven til kolonnen og langsomt pipette ekstraktet for at undgå at forstyrre sandlaget.
Skyl ekstraktet modbydeligt med fem milliliter hexan og overfør vasken til kolonnen. Når alt ekstraktet er tilsat, åbnes stophanen, og prøven læsses ind i kolonnen. Når prøven er tilsat, skal kolonnen forblive mættet med opløsningsmiddel.
Hvis kolonnen tørrer ud, går prøven tabt. En forvejet og mærket rund bundkolbe anbringes under kolonnen for at opsamle den første fraktion. Og brug en ventileret glastragt til at hælde 100% procent hexan til siden af reservoiret for at undgå at forstyrre sandlaget.
Åbn derefter stophanen for at begynde elueringen og lukke stophanen, når ca. tre milliliter hexan forbliver over sandet øverst i kolonnen. Som større dyr naturligt producere mere hud lipider på grund af deres større samlede hudoverfladeareal, er det vigtigt at standardisere den ekstraherede lipid masse til dyrets snude udluftning længde. Når standardiseret til den samlede kaste hudmasse, den lineære forholdet mellem den ekstraherede hud lipid masse med massen af skuret huden ekstraheret er helt fjernet.
Efter fraktionering kan den samme standardiseringsmetode bruges sammen med masserne af de enkelte brøker. For eksempel, her hver fraktion ikke bidrager lige til den samlede ekstraheret lipid masse, som de neutrale lipider er den dominerende sæt af forbindelser efter masse andel, sammenlignet med hvert sæt af mere polære lipider. Hvis identifikationen af forbindelser er det endelige mål, skal du bruge rent glas, og du skal undgå plast for at forhindre kontaminering af prøverne.
Til sammensat identifikation kan der forfølges flydende eller gaskromatografi kombineret med massespektrometri, når prøverne er indsamlet. Alternativt kan bioassays udføres for at belyse prøvens bioaktivitet.