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February 7th, 2019
DOI :
February 7th, 2019
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Title
0:37
Shed Skin Extraction and Lipid Mass Determination
3:01
Chromatography Column Preparation
5:19
Lipid Extract Fractionation
6:29
Results: Representative Standardized Fraction Masses Following Elution
7:23
Conclusion
Transcript
हमारा प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को रासायनिक संचार में सरीसृपों द्वारा उपयोग किए जाने वाले बायोएक्टिव सिग्नलिंग अणुओं को अलग करने की अनुमति देता है। साथ ही अतिरिक्त परीक्षण, या यहां तक कि पहचान के लिए इन यौगिकों के अलगाव और शुद्धि। इस विधि का उपयोग करके, शोधकर्ता रासायनिक संकेतों का स्रोत प्राप्त कर सकते हैं और फिर उन्हें अलगाव में उनके मात्राकरण या बायोसे उपयोग के लिए निकाल सकते हैं।
प्रक्रिया का प्रदर्शन आज होली रूकर, मेरी प्रयोगशाला से एक संमान थीसिस छात्र होगा । एक हेक्सान संगत ढक्कन के साथ एक सील योग्य ग्लास कंटेनर में पांच सेंटीमीटर चुकता टुकड़े रखकर शुरू करें और कंटेनर को सील करने से पहले शेड त्वचा के टुकड़ों को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए कंटेनर में पर्याप्त हेक्सान जोड़ें। अगले दिन, शेड के टुकड़ों को हटाने के लिए साफ धातु संदंश का उपयोग करें, टुकड़ों को हिलाते हुए क्योंकि उन्हें कंटेनर के भीतर किसी भी शेष हेक्सेन को बनाए रखने के लिए कब्जा कर लिया जाता है।
निकाले गए लिपिड मास को पूर्व तौला, गोल नीचे फ्लास्क में स्थानांतरित करने के लिए और वैक्यूम स्रोत को रोटरी वाष्पीकरण में चालू करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि वैक्यूम दबाव कंडेनसर की गर्दन पर फ्लास्क को पकड़ने के लिए पर्याप्त है। कंडेनसर के अंत में वेंट खोलें, कंडेनसर की गर्दन पर फ्लास्क स्लाइड करें, और सिस्टम को सील करने के लिए वेंट को बंद करें। यह सुनिश्चित करने के बाद कि फ्लास्क जारी होने पर कंडेनसर से डिस्कनेक्ट नहीं हो सकता है।
फ्लास्क को कम करें जब तक कि केवल नीचे 10% फ्लास्क स्नान में पानी को छूता है, और मध्यम गति से रोटेशन शुरू करता है। यदि वैक्यूम, गति, कंडेनसर प्रवाह, और स्नान तापमान इष्टतम हैं तो फ्लास्क छोड़ने वाला सॉल्वेंट वाष्प कुंडली पर गाढ़ा हो जाएगा और रिकवरी फ्लास्क में ड्रिप करेगा। एक सेंटीमीटर से कम व्यास वाले तरल का मनका फ्लास्क के तल में दिखाई देने तक वैक्यूम के नीचे नमूने को वाष्पित करें।
फिर रोटेशन और वैक्यूम बंद करें, और फ्लास्क को स्नान से बाहर उठाएं। वैक्यूम सील जारी होने के साथ ही फ्लास्क गर्दन को पकड़ें, और कंडेनसर से फ्लास्क को साइड करने के लिए गर्दन को मोड़ें। निकालने में तरल का मनका हेक्सेन वाष्पित होते ही जम जाएगा।
के बाद मनका के बारे में पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूख गया है, लिपिड फ्लास्क में पीले मोम के लिए एक पारदर्शी सफेद फार्म का होगा । अंतिम द्रव्यमान प्राप्त करने के लिए फ्लास्क का वजन करें और हेक्सान की रिकॉर्ड की गई मात्रा में लिपिड को घुलनशील करें ताकि हेक्सेन के एक मिलीलीटर के प्रति लिपिड की अधिक उत्पीड हुई जा सके। क्रोमेटोग्राफी कॉलम तैयार करने के लिए, एक लकड़ी के डॉवेल रॉड का उपयोग करें, जो कॉलम से अधिक लंबा है, जो ग्लास क्रोमेटोग्राफी कॉलम के नीचे चार-बाय-चार सेंटीमीटर वर्ग का जोड़ फाइबरग्लास की स्थिति में है।
एक मानक रिंग स्टैंड पर एक धूम हुड में कॉलम को सुरक्षित करें और स्टॉपकॉक खोलें। इसके बाद, कॉलम में धोया और सूखे रेत डालना जब तक लगभग तीन सेंटीमीटर रेत फाइबरग्लास के ऊपर टिकी हुई है। इसके बाद कॉलम के नीचे डार्क पेपर रखें और इसे धीरे-धीरे टैप करें।
अब, कॉलम के नीचे 500 मिलीलीटर बीकर रखें और धीरे-धीरे हेक्सेन के लगभग 25 मिलीलीटर के साथ रेत को गीला करें, जब रेत के ऊपर लगभग 0.5 सेंटीमीटर हेक्सान होता है तो स्टॉपकॉक को बंद कर दें। तटस्थ इलुमिना को सक्रिय करने के लिए, पूरे इलुमिना में बूंदों में इलुमिना द्रव्यमान के 6% के बराबर मात्रा के पिपेट डिएकोन्ड पानी। और सक्रिय illumina के कुप्पी को कवर, तेजी से समाधान घूमता समान रूप से प्रभारी तितर-बितर करने के लिए ।
जब इलुमिना का कोई दिखाई देने वाला झुरमुट नहीं रहता है, तो हेक्सान को तब तक जोड़ें जब तक कि इलुमिना पूरी तरह से लगभग 0.5 सेंटीमीटर हेक्सेन से ढक न जाए। एक घोल बनाने के लिए फ्लास्क को भंवर करें, और कॉलम के नीचे एक नया 500 मिलीलीटर ग्लास बीकर रखें। स्टॉपकॉक खोलें, फिर इलुमिना को फिर से चक्कर लगाते हैं, इससे पहले कि इलुमिना को कॉलम के जलाशय में आयोजित एक वेंटेड कीप में डालना, यह ध्यान रखते हुए कि इलुमिना कॉलम के भीतर समान रूप से सुलझेगी और कोई बड़े बुलबुले या दरारें नहीं बनती हैं।
स्तंभ तब बनता है जब इलुमिना का शीर्ष स्थिर होता है और जलाशय के आधार पर कॉलम की गर्दन से लगभग चार सेंटीमीटर नीचे होता है। फिर, अवशिष्ट इलुमिना के लिए हेक्सान के साथ जलाशय के अंदर कुल्ला करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें, और धीरे-धीरे जलाशय के नीचे लगभग एक सेंटीमीटर तक इलुमिना के शीर्ष पर रेत की एक दूसरी परत जोड़ें। लिपिड निकालने के अंश के लिए, लिपिड नमूने को कॉलम में स्थानांतरित करने के लिए एक लंबे ग्लास पिपेट का उपयोग करें और रेत की परत को परेशान करने से बचने के लिए धीरे-धीरे निकालने को पिपेट करें।
हेक्सेन के पांच मिलीलीटर के साथ निकालने नीच कुल्ला और कॉलम को धोने हस्तांतरण। जब सभी अर्क जोड़े गए थे, तो स्टॉपकॉक खोलें और नमूने को कॉलम में लोड करने की अनुमति दें। एक बार नमूना जुड़ जाने के बाद, कॉलम को सॉल्वेंट के साथ संतृप्त रहना चाहिए।
अगर कॉलम सूख जाता है तो सैंपल गुम हो जाएगा। पहले अंश को इकट्ठा करने के लिए कॉलम के नीचे एक पूर्व तौला और लेबल गोल नीचे फ्लास्क रखें। और रेत की परत को परेशान करने से बचने के लिए जलाशय के किनारे पर 100% प्रतिशत हेक्सेन डालने के लिए एक वेंटेड ग्लास फ़नल का उपयोग करें।
फिर, एल्यूशन शुरू करने के लिए स्टॉपकॉक खोलें, स्टॉपकॉक को बंद करें जब हेक्साने के लगभग तीन मिलीलीटर कॉलम के शीर्ष पर रेत से ऊपर रहते हैं। चूंकि बड़े जानवर स्वाभाविक रूप से अपने अधिक कुल त्वचा सतह क्षेत्र के कारण अधिक त्वचा लिपिड का उत्पादन करते हैं, इसलिए निकाले गए लिपिड द्रव्यमान को जानवर की स्नाउट वेंट लंबाई में मानकीकृत करना महत्वपूर्ण है। एक बार कुल शेड त्वचा द्रव्यमान के लिए मानकीकृत, निकाले गए त्वचा के द्रव्यमान के साथ निकाले गए त्वचा लिपिड द्रव्यमान का रैखिक संबंध पूरी तरह से हटा दिया जाता है।
अंश के बाद, एक ही मानकीकरण दृष्टिकोण का उपयोग व्यक्तिगत अंशों की जनता के साथ किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यहां प्रत्येक अंश कुल निकाले गए लिपिड द्रव्यमान में समान रूप से योगदान नहीं दे रहा है, क्योंकि तटस्थ लिपिड अधिक ध्रुवीय लिपिड के प्रत्येक सेट की तुलना में द्रव्यमान अनुपात से यौगिकों का प्रमुख सेट हैं। यदि यौगिकों की पहचान अंतिम लक्ष्य है, तो साफ ग्लासवेयर का उपयोग करें और आपको नमूनों के प्रदूषण को रोकने के लिए प्लास्टिक से बचना चाहिए।
यौगिक पहचान के लिए, तरल या गैस क्रोमेटोग्राफी, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर नमूनों को एकत्र करने के बाद पीछा किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, नमूने की जैव गतिविधि को स्पष्ट करने के लिए बायोएसे कहते हैं।
सरीसृप में, विशिष्टताओं से त्वचा लिपिड यौन संकेतन के लिए महत्वपूर्ण हैं, इनवेसिव प्रजातियों के प्रबंधन में संभावित उपयोग के साथ । यहाँ, हम शेड त्वचा या पूरे जानवरों से त्वचा लिपिड निकालने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, कुल लिपिड द्रव्यमान का निर्धारण और विश्लेषण, और स्तंभ क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से भिन्नीकरण का उपयोग कर लिपिड को अलग.
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