Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

ونحن نشكر شو-أوو "ولاية شأن" (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا) لمناقشة الثاقبة بشأن وضع مقايسة الحنق. الشخص، و Y.Z.، و X.L. ومولت أموال بدء التشغيل من جامعة بوردو إلى Y.Z. ودعم العمل X.L.This جزئيا بمنحه بذور من مركز جامعة بوردو "البيولوجيا النباتية".

1-تصميم المقايسة الحنق.
<ol><li>تحميل ملف هيكل Cul1•Cand1 المعقدة من "بنك بيانات البروتين" (الملف 1U6G).</li>
	<li>عرض هيكل Cul1•Cand1 المعقدة في بيمول.</li>
	<li>استخدام دالة القياس تحت قائمة معالج بيمول لتقدير المسافة بين الأحماض الأمينية الأولى من Cand1 وحمض أميني آخر من Cul1 (الشكل 1</...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li><li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+probing+disease+mechanisms+using+model+systems.">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).</li><li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cellular+protein-protein+interactions:+Technological+strategies+and+opportunities.">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li><li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple,+direct,+and+quantitative+in+vitro+binding+assays.">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).</li><li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+kinetic+studies+of+biological+interactions:+A+review.">Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).</li><li>Pierce, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1+promotes+assembly+of+new+SCF+complexes+through+dynamic+exchange+of+F+box+proteins.">Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins.</a> Cell. 153 (1), 206-215 (2013).</li><li>Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1-Mediated+Adaptive+Exchange+Mechanism+Enables+Variation+in+F-Box+Protein+Expression.">Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression.</a> Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).</li><li>Zheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cul1-Rbx1-Skp1-F+boxSkp2+SCF+ubiquitin+ligase+complex.">Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex.</a> Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).</li><li>Kleiger, G., Deshaies, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag+Team+Ubiquitin+Ligases.">Tag Team Ubiquitin Ligases.</a> Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1+binds+to+unneddylated+CUL1+and+regulates+the+formation+of+SCF+ubiquitin+E3+ligase+complex.">CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex.</a> Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).</li><li>Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+unneddylated+cullin+1+and+regulates+its+neddylation.">TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation.</a> FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).</li><li>Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+cullins+and+modulates+ubiquitin+ligase+activity.">TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).</li><li>Goldenberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cand1-Cul1-Roc1+complex+reveals+regulatory+mechanisms+for+the+assembly+of+the+multisubunit+cullin-dependent+ubiquitin+ligases.">Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases.</a> Cell. 119 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ETA2,+an+apparent+ortholog+of+the+human+cullin-interacting+protein+CAND1,+is+required+for+auxin+responses+mediated+by+the+SCF(TIR1)+ubiquitin+ligase.">Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase.</a> Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CAND1,+an+Unmodified+CUL1-Interacting+Protein,+Is+Involved+in+Multiple+Developmental+Pathways+Controlled+by+Ubiquitin/Proteasome-Mediated+Protein+Degradation.">Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation.</a> the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).</li><li>Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtCAND1,+a+HEAT-repeat+protein+that+participates+in+auxin+signaling+in+Arabidopsis.">AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).</li><li>Lo, S. -. C., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1-Mediated+Substrate+Adaptor+Recycling+Is+Required+for+Efficient+Repression+of+Nrf2+by+Keap1.">CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).</li><li>Okamoto, K., Sako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+FRET+for+the+study+of+protein+interactions+and+dynamics.">Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).</li><li>Hussain, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET).">An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET).</a> arXiv preprint. , (2009).</li><li>Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+and+purification+of+recombinant+SCF+ubiquitin+ligases.">High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases.</a> Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).</li><li>Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortagging:+A+versatile+method+for+protein+labeling.">Sortagging: A versatile method for protein labeling.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).</li><li>Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Protein+Labeling+via+Sortase-Mediated+Transpeptidation.">Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-PAGE+of+Proteins.">SDS-PAGE of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+E2-E3+Assembly+and+Disassembly+Enable+Processive+Ubiquitylation+of+Cullin-RING+Ubiquitin+Ligase+Substrates.">Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates.</a> Cell. 139 (5), 957-968 (2009).</li><li>Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Stopped-flow+Kinetics+Methods+to+Investigate+the+Mechanism+of+Action+of+a+DNA+Repair+Protein.">Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).</li><li>Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Stopped-Flow+Fluorescence+and+Labeled+Nucleotides+to+Analyze+the+ATP+Turnover+Cycle+of+Kinesins.">Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs.">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Lin, C. T., Rorabacher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+approach+for+stopped-flow+kinetics+of+fast+second-order+reactions+involving+inhomogeneity+in+the+reaction+cell.">Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell.</a> Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).</li><li>Toseland, C. P., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Reaction+Kinetic+Techniques.">Rapid Reaction Kinetic Techniques.</a> Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Lin, C. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase-catalyzed+site-specific+conjugation+of+small-molecule+probes+to+proteins+in+vitro+and+on+the+surface+of+living+cells.">Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+short+peptide+tag+for+versatile+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).</li><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+Basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+GTPase+movement+on+an+RNA+scaffold+drives+co-translational+protein+targeting.">Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting.</a> Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).</li></ol>

بكى ظاهرة الفيزيائية التي ذات أهمية كبيرة لدراسة وفهم النظم البيولوجية19. نقدم هنا، على بروتوكول لاختبار واستخدام الحنق لدراسة حركية ملزمة من اثنين من البروتينات المتفاعلة. عند تصميم الحنق، يمكننا النظر في ثلاثة عوامل رئيسية: التداخل الطيفي بين المانحين الانبعاثات ويقبلون ا...

في نهاية المطاف تنفذ الأنشطة البيولوجية بالبروتينات، أكثر منها التفاعل مع الآخرين للوظائف البيولوجية المناسبة. استخدام نهج حسابي، ويقدر المبلغ الإجمالي لتفاعلات البروتين البروتين في الإنسان تكون ~ 650,0001، وتعطل هذه التفاعلات غالباً ما يؤدي إلى أمراض2. بسبب أدوارها الأساسية في السيطرة على العمليات الخلوية والعضوي، تطورت أساليب عديدة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين، مثل الخميرة-اثنين-الهجين، والتكامل bimolecular الأسفار، سبليت-لوسيفراس التكامل، و الإنزيم co-إيمونوبريسيبيتيشن3. بينما هذه الأساليب جيدة في اكتشاف وتأكيد تفاعلات البروتين البروتين، وعادة غير كمي وهكذا توفر معلومات محدودة عن تقارب بين الشركاء البروتين المتفاعلة. هبوطاً سحب الكمية يمكن استخدامها لقياس تقارب ملزم (مثلاً، تفارق الثابت كد)، ولكن لا قياس حركية للتوثيق، ولا يمكن تطبيقها عند كد منخفضة للغاية نظراً عدم كفاية الإشارات إلى الضجيج نسبة4. مطيافية الرنين (موارد البرنامج الخاصة) السطحية مأكل مثل الطحين يوضحها حركية ملزمة، ولكن يتطلب سطح معين والتثبيت من مادة التفاعل واحد على السطح، والتي يحتمل أن تكون تغيير خاصية الربط من مادة التفاعل5. وعلاوة على ذلك، من الصعب على موارد البرنامج الخاصة لقياس رابطة سريعة و معدلات الانفصال5، وأنه من غير المناسب لاستخدام موارد البرنامج الخاصة لوصف هذا الحدث من تبادل مفارز بروتين في بروتين معقدة. هنا، نحن تصف أسلوب الذي يتيح قياس معدلات البروتين الجمعية المعقدة والتفكيك في مقياس زمني ميلي ثانية. وكان هذا الأسلوب ضروري لتحديد دور جالين-صمامات-Nedd8-دإيسوسياتيد البروتين 1 (Cand1)ك مربع و تبادل6،عامل البروتين7.
وينظم Cand1 ديناميات مربع Skp1•Cul1•F البروتين (SCF) E3 ليجاسيس، التي تنتمي إلى عائلة كبيرة من عصابة سنعمل ubiquitin ligases. سكفس تتألف من كولن Cul1، الذي يربط البروتين المجال الدائري Rbx1، وبروتين و مربع لتبادل، الذي يجند ركائز ويربط Cul1 عن طريق البروتين محول Skp18. ليجاسى E3، SCF يحفز على تصريف أوبيكويتين إلى أن الركيزة، ويتم تنشيطه عندما يتم تجنيد الركيزة بالبروتين و مربع، وعندما يتم تعديل Cul1 بالبروتين مثل أوبيكويتين Nedd89. يربط Cand1 Cul1 غير معدلة، وعند الربط، أنه يعطل كل رابطة البروتين مربع Skp1•F مع Cul1 وعلى تصريف Nedd8 Cul110،11،،من1213. كنتيجة لذلك، Cand1 على ما يبدو مثبط لنشاط صندوق إنقاذ الطفولة في المختبر، ولكن نقص Cand1 في الكائنات الحية بسبب العيوب التي تشير إلى دور إيجابي من Cand1 في تنظيم أنشطة صندوق إنقاذ الطفولة في فيفو14،،من1516 , 17-وأوضح هذه المفارقة أخيرا بدراسة كمية التي كشفت التفاعلات الدينامية بين البروتين Cul1، Cand1، و Skp1•F--مربع. استخدام fluorescence الرنين الطاقة نقل (الحنق) فحوصات الكشف عن تشكيل المجمعات SCF و Cul1•Cand1، رابطة وتفكك معدل الثوابت (كعلى kإيقاف، على التوالي) كانت تقاس على حدة. وكشفت القياسات أن Cand1 و Skp1•F--مربع البروتين شكل ضيق للغاية معقدة مع Cul1، ولكن كالخروج من صندوق إنقاذ الطفولة هو زيادة كبيرة من Cand1 و كالخروج من Cul1•Cand1 هو زيادة هائلة بمربع Skp1•F البروتين6،7. هذه النتائج توفير الدعم الأولى والحاسمة لتحديد دور Cand1 كعامل تبادل بروتين، مما يحفز تشكيل مجمعات SCF الجديدة من خلال إعادة التدوير Cul1 من مجمعات SCF القديمة.
هنا، نحن نقدم إجراءات لتطوير واستخدام مقايسة الحنق لدراسة ديناميات معقدة Cul1•Cand17، ويمكن تطبيق نفس المبدأ على دراسة ديناميات الجزيئات الحيوية المختلفة. بكى عند إحدى الجهات مانحة متحمس مع الطول الموجي المناسب، ويقبلون مع طيف الإثارة تداخل طيف انبعاث المانحة موجوداً ضمن مسافة 10-100. يتم تحويل الدولة متحمس يقبلون، وبالتالي تقليل كثافة المانحين وزيادة كثافة يقبلون18. كفاءة الحنق (ﻫ) يعتمد على دائرة نصف قطرها فورستر (ص0) والمسافة بين المانحين ويقبلون fluorophores (r)، ويتم تعريف بواسطة: E = 0ص6/(ص0 6 + ص6). دائرة نصف قطرها فورستر (ص0) يعتمد على عدد قليل من العوامل، بما في ذلك الاتجاه الزاوي ثنائي القطب، تستخدم التداخل الطيفي زوج يقبلون المانحين، والحل19. لتطبيق التحليل الحنق على فلوريميتير توقف التدفق، الذي يرصد تغير الانبعاثات المانحين في الوقت الحقيقي وتتيح قياسات سريعة كعلى و kإيقاف، من الضروري إثبات كفاءة الحنق التي النتائج في انخفاض كبير في انبعاثات المانحين. ولذلك، تصميم الحنق الكفاءة عن طريق اختيار الزوج المناسب الأصباغ الفلورية ومواقع على البروتينات المستهدفة تعلق الأصباغ مهم وسيتم مناقشتها في هذا البروتوكول.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

البروتينات هي عوامل التشغيل الأساسي للنظم البيولوجية، وعادة ما تتفاعل مع غيرها الكلي أو الجزيئات الصغيرة الاضطلاع بوظائفها البيولوجية. يمكن أن تكون مثل هذه التفاعلات ديناميكية للغاية، بمعنى الوحدات الفرعية المتفاعلة المرتبطة باستمرار ونأت بأسعار معينة. بينما قياس تقارب ملزم باستخدام تقنيات مثل الكمية المنسدلة يكشف قوة التفاعل، دراسة حركية ملزم يقدم أفكاراً حول كيفية حمل يحدث التفاعل وكم من الوقت يمكن أن يتواجد كل مجمع. وعلاوة على ذلك، يساعد قياس حركية تفاعل حضور عامل إضافي، مثل عامل تبادل بروتين أو دواء، تكشف عن الآلية التي تنظم التفاعل العامل الآخر، توفير معلومات هامة النهوض بالبحوث الطبية والبيولوجية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لقياس حركية ملزمة البروتين المعقدة التي لديها نسبة عالية من رابطة جوهرية ويمكن أن تنفصل بسرعة بروتين آخر. يستخدم الأسلوب نقل الطاقة صدى الأسفار إلى تقرير تشكيل البروتين المجمع في المختبر، وأنه يمكن رصد رابطة سريعة والانفصال من المجمع في الوقت الحقيقي على فلوريميتير توقف تدفق. باستخدام هذا الفحص، كمياً الثوابت معدل الرابطة وتفكك البروتين المعقدة.

لاختبار الحنق بين Cul1المجلس الطبي الأسترالي و فلاشCand1، نحن أولاً بتحديد كثافة الانبعاثات من 70 نانومتر Cul1المجلس الطبي الأسترالي (الجهة المانحة) و 70 نانومتر فلاشCand1 (acceptor)، على التوالي (الشكل 3Aخطوط-ج، الأزرق). في كل تحليل، الو...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

تفاعلات البروتين البروتين حاسمة بالنسبة للنظم البيولوجية، والدراسات المتعلقة بحركية ملزمة التبصير بديناميات ووظيفة البروتين المجمعات. يمكننا وصف أسلوب التي يوضحها المعلمات الحركية بروتين معقدة باستخدام أسلوب توقف تدفق ونقل الطاقة صدى الأسفار.

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

تساعد طريقتنا في دراسة حركية تكوين مركب البروتين. وهو يصف مدى ضيق مجمع البروتين ، وإذا كان يتم التدخل في تكوين البروتين المعقد من قبل البروتينات الأخرى. هذه التقنية تمكن دراسة البروتين البروتين التفاعل بطريقة كمية باستخدام الفلوريسكانس كمراسل، لدينا يمكن أن رصد الرابطة وفك ارتباط مجمع البروتين في الوقت الحقيقي.للبدء، تصميم مقايسة فريت بدءا من البيانات لمجمع COL1 CAND1 من قاعدة بيانات البروتين. تحميل هيكل في PyMOL، ومن ثم انتقل إلى القائمة المعالج واستخدام وظيفة قياس لتقدير المسافة بين الأحماض الأمينية الأولى من CAND1 والأحماض الأمينية الأخيرة من COL1. ثم، تحميل المشاهد الأطياف على الانترنت وعرض الإثارة والأطياف انبعاث 7-أمينية-4-ميثيلكومارين وFlASH في وقت واحد.AMC هو المانح FRET وFlash هو قبول فريت. إعداد الخلايا مع البروتين المانح FRET باتباع جنبا إلى جنب في بروتوكول النص المرافق. ثم، تنقية مجمع SORTASE COL1 RBX1 عن طريق إضافة أول 50 ملليلتر من العازلة تحلل إلى بيليه من الخلايا القولونية التعبير عن مجمع SORTASE COL1 RBX1.الجليد الخلايا على الجليد مع سونيكيشن في 50٪ السعة. بالتناوب السلطة لمدة ثلاث دقائق بحيث يكون ثانية واحدة على، ثم ثانية واحدة قبالة لمنع ارتفاع درجة حرارة العينة. نقل الخلية الناتجة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر وإزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 25، 000 مرات ز لمدة 45 دقيقة.ثم، إضافة إلى خمسة ملليلترات من الخرز الجلوتاثيون واحتضانها في أربع درجات مئوية لمسح الخلية lysate. بعد الحضانة، الطرد المركزي خليط حبة lysate في 1، 500 مرة ز لمدة دقيقتين في أربع درجات مئوية. ثم، إزالة المناط.المقبل، وغسل الخرز مع 5 ملليلتر من العازلة تحلل عدم وجود مثبطات البروتياز. بعد الطرد المركزي للحل، إزالة الفائق. الآن، إضافة ثلاثة ملليلتر من العازلة تحلل إلى الخرز غسلها ونقل الطين حبة في عمود فارغ.إلى العمود الجديد، إضافة أيضا خمسة ملليلترات من العازلة elution ومن ثم احتضان العمود لمدة 10 دقائق وجمع eluate. بعد ذلك، إضافة 200 ميكرولترات من ثرومبين في خمسة ملليغرام لكل ملليلتر إلى eluate من الخرز الجلوتاثيون. بعد حضانة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية تمييع عينة البروتين ثلاث أضعاف مع العازلة A.Load عينة البروتين إلى العازلة A توازنها تبادل العمود اللوني في صفر نقطة خمس ملليلتر في الدقيقة الواحدة.ثم، إضافة تدرج من صفر إلى 50٪ من المخزن المؤقت B في المخزن المؤقت A ل elute البروتين مع معدل تدفق 1 ملليلتر في الدقيقة الواحدة. بعد ذلك، تجمع كسور الويات التي تحتوي على البروتين المانح فريت والتركيز عليه وصولا الى نقطتين خمس ملليلتر باستخدام غشاء الترشيح الفائق مع قطع 30 كيلودالون. الآن، إضافة 7-amino-4-methylcoumarin إلى c-terminus من COL1 من خلال sortase بوساطة transpeptidation عن طريق تغيير أولا العازلة في عينة البروتين المانحة فريت في المخزن المؤقت sortase باستخدام عمود desalting.لتحقيق ذلك، توازن أول عمود إزالة سالت مع 25 ملليلتر من المخزن المؤقت sortase. ثم، تحميل نقطتين خمس ملليلتر من محلول البروتين المانح FRET في العمود والتخلص من التدفق من خلال. المقبل، elute العينة مع ثلاث نقاط خمس ملليلتر من المخزن المؤقت sortase وجمع تدفق من خلال.في 900 ميكرولترات من eluate، إضافة 100 ميكرولترات من 600 sortase تنقية ميكرومولار A الحل و 10 ميكرولترات من 25 ملليمولار GGGG-AMC الببتيد. احتضان خليط التفاعل في 30 درجة مئوية في الظلام بين عشية وضحاها لتوليد COL1-AMC-RBX1. الآن، تحميل كل من العينة على حجم استبعاد عمود الكروماتوغرافيا و elute ذلك مع نقطة واحدة خمسة أضعاف حجم العمود من المخزن المؤقت.في النهاية، تجمع الكسور المائلة التي تحتوي على COL1-AMC-RBX1. اتبع على طول في بروتوكول النص لإعداد البروتين قبول فريت. العديد من الخطوات مماثلة لإعداد البروتين المانحة فريت.بمجرد الانتهاء، قم بإعداد حل FlASH CAND1. أولا، إضافة مصغرة واحدة من حل FlASH إلى 50 ميكرولترات من حل تترا-cys-CAND1 الطازجة. اخلطي الحلول المشتركة جيدا وحضن الخليط في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة إلى ساعتين لتشكيل محلول FlASH CAND1.في 300 ميكرولترات من عازلة فريت، إضافة COL1-AMC-RBX1 إلى تركيز النهائي من 70 نانومولار ونقل الحل إلى cuvette. ضع الـ cuvette في حامل العينة من مقياس الفلور. استثارة العينة مع 350 ضوء الإثارة نانومتر ومسح إشارات الانبعاثات من 400 إلى 600 نانومتر في واحدة نانومتر الزيادات.ثم، في 300 ميكرولتررس من عازلة فريت، إضافة كل من COL1-AMC-RBX1 وFlASH-CAND1 إلى تركيز النهائي من 70 نانوموللار. اثير العينة مع 350 نانومتر ضوء الإثارة ومسح إشارات الانبعاثات من 400-600 نانومتر في واحدة نانومتر الزيادات. تعيين ضوء الإثارة في 350 نانومتر واستخدام شريط تمرير مرشح يسمح 450 نانومتر ضوء الانبعاثات لتمرير وكتل 500 إلى 650 نانومتر ضوء الانبعاثات.مع صمامات العينة في موضع ملء ربط حقنة ثلاثة ملليلتر مليئة بالماء. ثم، غسل الحقن العينتين بالماء عن طريق تحريك حقنة عينة محرك الأقراص صعودا وهبوطا عدة مرات، والتخلص من الماء عند الانتهاء. بعد ذلك، قم بتوصيل حقنة من ثلاثة ملليلتر مملوءة بمخزنة FRET.غسل الحقن العينة اثنين مع المخزن FRET عن طريق تحريك محرك حقنة عينة صعودا وهبوطا عدة مرات، والتخلص من الماء عند الانتهاء. الآن، قم بتوصيل حقنة ثلاثة ملليلتر وتحميل أول حقنة عينة، المحاقن A، مع 100 نانومولار COL1-AMC-RBX1 في المخزن المؤقت لـ FRET. ثم تحويل صمام عينة إلى موقف محرك الأقراص أيضا، توصيل حقنة ثلاثة ملليلتر إلى حقنة B وتحميل حقنة B مع 100 نانومولار من FLASH CAND1 في المخزن المؤقت فريت وبدوره صمام إلى موقف محرك الأقراص.فتح لوحة التحكم تحت الحصول على البرنامج وسجل انبعاث COL1-AMC على مدى 60 ثانية. ثم، خذ طلقة واحدة. تناسب الانخفاض وإشارات الفلورسنت تقاس بمرور الوقت من كل طلقة إلى منحنى أسي واحد.غسل النظام كما هو مبين سابقا ثم إضافة حل من 100 نانومولار COL1-AMC-RBX1 و 100 نانومولار FlASH CAND1 في المخزن FRET في حقنة A.Connect أنه إلى النظام في حين أنه في موضع ملء تحميل حقنة A ومن ثم تحويل صمام عينة إلى موقف محرك الأقراص. بعد ذلك، تحميل حل من Skp1-Skp2 في حقنة B.Connect إلى النظام في حين أنه في موقف ملء. تحميل حقنة B ومن ثم تحويل العينة إلى موقف محرك الأقراص.في البرنامج، انتقل إلى الحصول على لوحة التحكم وفتحها. إعداد البرنامج لتسجيل انبعاث COL1-AMC على مدى 30 ثانية. ثم أخذ طلقة واحدة.وإشارات الفلوريسنس زيادة مع مرور الوقت بعد خلط الحلول من حقنة A والحقنة B.When 70 نانوموللار كل من COL1-AMC وFLASH CAND1 كانت مختلطة لتوليد فريت، وكانت هناك ذرتان للانبعاثات موجودة في أطياف الانبعاثات. وأصبحت ذروة COL1-AMC أقل، وأصبحت ذروة FlASH CAND1 أعلى. عندما تم استخدام الطول الكامل CAND1 لFRET أظهرت ذروة المانحين انخفاضًا بنسبة 10٪ في الكثافة.ومع ذلك، عندما تم استخدام CAND1 مع أول حلزوني تم اقتطاعها الحد من كثافة الذروة المانحة إلى 30٪ مما يشير إلى كفاءة أعلى من FRET لتأكيد أن التغييرات إشارة كانت نتيجة من FRET بين COL1-AMC وFLASH CAND1، تم خلط FRET المانح مع كاند غير الموسومة الزائدة المعروفة باسم تشيس في المقبّل. ونتيجة لذلك، أعيدت ذروة المانحين بالكامل وانخفضت ذروة المتقبل. يظهر هنا هو رسم من متوسط القيمة K الملاحظة مع تركيز CAND1 بعد تحليل الانحدار الخطي.لقياس ثابت على المجمع، 50 نانومولار COL1-AMC تم قياسها في سلسلة من الثوابت معدل تفكك لوحظ تم قياسها عن طريق خلط 50 نانومولار COL1-AMC مع زيادة تركيزات FlASH CAND1. وعلى غرار قياس الثابت الموجود، تم العثور على ثابت الانفصام الملاحظ لـ COL1 و CAND1 عن طريق رصد استعادة إشارة المانحة بمرور الوقت على مقياس فلوري التدفق المتوقف. هنا زادت إشارة المانح بسرعة وكشفت عن قيمة K الملاحظة من صفر نقطة أربعة في الثانية الواحدة.في المقابل، عندما تم إضافة المخزن المؤقت إلى مجمع ما قبل تجميعها، لوحظ أي زيادة إشارة تشير إلى أن تفكك سريع من كاند 1 COL1 تم تشغيلها بواسطة Skp1 Skp2. تأكد من تقليل كمية الضوء التي يتعرض لها المتبرع والبروتينات المقبولة. حاول أن تبقي الفلوروفورات في الظلام قدر الإمكان.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

مراقبة ديناميكيات تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي في الجسم الحي بدقة زمنية عالية باستخدام χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

استخدام تحسين الفلورية المستحث بالبروتين الذي تم حله زمنيا لتحديد التركيبات المحلية المستقرة α-Synuclein Monomer في كل مرة

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

جزيء واحد فلورسينس دراسة نقل الطاقة من تخليق البروتين ريبوسوم

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...