Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Vi takker Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) for indsigtsfulde diskussion om udviklingen af FRET assay. M.G., Y.Z. og X.L. blev finansieret af startup midler fra Purdue University til Y.Z. og X.L.This arbejde blev delvist understøttet af et frø tilskud fra Purdue University Center for Plantebiologi.

1. design FRET assay.
<ol><li>Hent filen struktur af komplekse Cul1•Cand1 fra Protein Data Bank (fil 1U6G).</li>
	<li>Se strukturen i Cul1•Cand1 kompleks i PyMOL.</li>
	<li>Brug funktionen måling under menuen guiden af PyMOL for at anslå afstanden mellem den første aminosyre i Cand1 og den sidste aminosyre i Cul1 (figur 1).</li>
	<li>Indlæse online spectra fremviseren (Se Tabel af materialer) og se excitation og emission spektre af...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li><li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+probing+disease+mechanisms+using+model+systems.">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).</li><li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cellular+protein-protein+interactions:+Technological+strategies+and+opportunities.">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li><li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple,+direct,+and+quantitative+in+vitro+binding+assays.">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).</li><li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+kinetic+studies+of+biological+interactions:+A+review.">Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).</li><li>Pierce, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1+promotes+assembly+of+new+SCF+complexes+through+dynamic+exchange+of+F+box+proteins.">Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins.</a> Cell. 153 (1), 206-215 (2013).</li><li>Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1-Mediated+Adaptive+Exchange+Mechanism+Enables+Variation+in+F-Box+Protein+Expression.">Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression.</a> Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).</li><li>Zheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cul1-Rbx1-Skp1-F+boxSkp2+SCF+ubiquitin+ligase+complex.">Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex.</a> Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).</li><li>Kleiger, G., Deshaies, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag+Team+Ubiquitin+Ligases.">Tag Team Ubiquitin Ligases.</a> Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1+binds+to+unneddylated+CUL1+and+regulates+the+formation+of+SCF+ubiquitin+E3+ligase+complex.">CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex.</a> Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).</li><li>Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+unneddylated+cullin+1+and+regulates+its+neddylation.">TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation.</a> FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).</li><li>Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+cullins+and+modulates+ubiquitin+ligase+activity.">TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).</li><li>Goldenberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cand1-Cul1-Roc1+complex+reveals+regulatory+mechanisms+for+the+assembly+of+the+multisubunit+cullin-dependent+ubiquitin+ligases.">Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases.</a> Cell. 119 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ETA2,+an+apparent+ortholog+of+the+human+cullin-interacting+protein+CAND1,+is+required+for+auxin+responses+mediated+by+the+SCF(TIR1)+ubiquitin+ligase.">Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase.</a> Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CAND1,+an+Unmodified+CUL1-Interacting+Protein,+Is+Involved+in+Multiple+Developmental+Pathways+Controlled+by+Ubiquitin/Proteasome-Mediated+Protein+Degradation.">Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation.</a> the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).</li><li>Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtCAND1,+a+HEAT-repeat+protein+that+participates+in+auxin+signaling+in+Arabidopsis.">AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).</li><li>Lo, S. -. C., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1-Mediated+Substrate+Adaptor+Recycling+Is+Required+for+Efficient+Repression+of+Nrf2+by+Keap1.">CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).</li><li>Okamoto, K., Sako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+FRET+for+the+study+of+protein+interactions+and+dynamics.">Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).</li><li>Hussain, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET).">An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET).</a> arXiv preprint. , (2009).</li><li>Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+and+purification+of+recombinant+SCF+ubiquitin+ligases.">High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases.</a> Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).</li><li>Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortagging:+A+versatile+method+for+protein+labeling.">Sortagging: A versatile method for protein labeling.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).</li><li>Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Protein+Labeling+via+Sortase-Mediated+Transpeptidation.">Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-PAGE+of+Proteins.">SDS-PAGE of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+E2-E3+Assembly+and+Disassembly+Enable+Processive+Ubiquitylation+of+Cullin-RING+Ubiquitin+Ligase+Substrates.">Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates.</a> Cell. 139 (5), 957-968 (2009).</li><li>Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Stopped-flow+Kinetics+Methods+to+Investigate+the+Mechanism+of+Action+of+a+DNA+Repair+Protein.">Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).</li><li>Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Stopped-Flow+Fluorescence+and+Labeled+Nucleotides+to+Analyze+the+ATP+Turnover+Cycle+of+Kinesins.">Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs.">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Lin, C. T., Rorabacher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+approach+for+stopped-flow+kinetics+of+fast+second-order+reactions+involving+inhomogeneity+in+the+reaction+cell.">Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell.</a> Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).</li><li>Toseland, C. P., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Reaction+Kinetic+Techniques.">Rapid Reaction Kinetic Techniques.</a> Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Lin, C. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase-catalyzed+site-specific+conjugation+of+small-molecule+probes+to+proteins+in+vitro+and+on+the+surface+of+living+cells.">Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+short+peptide+tag+for+versatile+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).</li><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+Basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+GTPase+movement+on+an+RNA+scaffold+drives+co-translational+protein+targeting.">Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting.</a> Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).</li></ol>

FRET er et fysisk fænomen, som er af stor interesse for at studere og forstå biologiske systemer19. Vi præsenterer her, en protokol for afprøvning og brug af FRET for at studere bindende kinetik af to interagerende proteiner. Når du udformer FRET, vi anså tre hovedfaktorer: den spektrale overlapning mellem donor emission og acceptor excitation, afstanden mellem de to fluorophores og dipol orientering af fluorophores28. For at vælge fluorophores for FRET, vi overlejre...

Biologiske aktiviteter udføres i sidste ende af proteiner, mest som interagerer med andre for ordentlig biologiske funktioner. Brug af et beregningsprogram tilgang, den samlede mængde protein-protein interaktioner i menneskelige skønnes for at være ~ 650.0001, og afbrydelse af disse interaktioner ofte fører til sygdomme2. På grund af deres væsentlige roller i at kontrollere cellulært og kropsligt processer, er talrige metoder blevet udviklet for at studere protein-protein interaktioner, såsom gær-to-hybrid, bimolecular fluorescens komplementering, split-luciferase komplementering, og co-immunoprecipitation assay3. Mens disse metoder er gode til at opdage og bekræfter protein-protein interaktioner, de er normalt ikke-kvantitative og dermed giver begrænsede oplysninger om affinitet mellem de interagerende protein partnere. Kvantitative pull-downs kan bruges til at måle bindingsaffinitet (f.eks. dissociationskonstant Kd), men det måle ikke kinetik af bindingen, og heller ikke kan det anvendes når Kd er meget lav på grund af en utilstrækkelig signal-støj-forholdet4. Overflade plasmon resonans (SPR) spektroskopi kvantificerer bindende kinetik, men det kræver en specifik overflade og immobilisering af en reaktant på overfladen, som potentielt kan ændre egenskaben binding af reaktanter5. Desuden er det vanskeligt for SPR at måle hurtig association og dissociation satser5, og det er ikke hensigtsmæssigt at bruge SPR for at karakterisere begivenhed for at udveksle protein underenheder i et proteinkompleks. Her, beskriver vi en metode, der giver mulighed for måling af satserne for protein kompleks samling og demontering på en millisekund tidsskala. Denne metode var afgørende for bestemmelse af Cullin -enssociated -Nedd8 -dissociated protein 1 (Cand1) betydning som F-boks protein udveksling faktor6,7.
Cand1 regulerer dynamikken i Skp1•Cul1•F-box protein (SCF) E3 ligases, som hører til den store familie af Cullin søerne-RING ubiquitin ligases. SCFs består af cullin Cul1, som binder RING domæne protein Rbx1, og et udskifteligt F-boks protein, som rekrutterer substrater og binder Cul1 gennem adapter protein Skp18. Som en E3 ligase, SCF katalyserer konjugation af ubiquitin til sit bæremateriale, og det er aktiveret når substratet er rekrutteret af F-boks protein, og når Cul1 er ændret af ubiquitin-lignende protein Nedd89. Cand1 binder umodificeret Cul1, og efter bindende, det forstyrrer både sammenslutningen af Skp1•F-box protein med Cul1 og konjugering af Nedd8 til Cul110,11,12,13. Som følge heraf Cand1 syntes at være en hæmmer af SCF aktivitet in vitro, men Cand1 mangel i organismer forårsaget defekter, der antyder en positiv rolle i Cand1 i reguleringen af SCF aktiviteter i vivo14,15,16 , 17. dette paradoks blev endelig forklares ved en kvantitativ undersøgelse, der afslørede de dynamiske interaktioner blandt Cul1, Cand1 og Skp1•F-box protein. Ved hjælp af fluorescens resonans energi overførsel (FRET) assays, der registrerer dannelsen af de videnskabelige komité for levnedsmidler og Cul1•Cand1 komplekser, association og dissociation Vurder konstanter (kpå og kud, henholdsvis) var målt individuelt. Målingerne viste, at både Cand1 og Skp1•F-box protein form yderst stramme kompleks med Cul1, men de kud af SCF øges dramatisk af Cand1 og den kud af Cul1•Cand1 øges dramatisk af Skp1•F-box protein6,7. Disse resultater giver den første og afgørende støtte for definitionen af Cand1 som et protein udveksling faktor, som katalyserer dannelsen af nye SCF komplekser gennem genbrug Cul1 fra de gamle SCF komplekser.
Her præsenterer vi proceduren for udvikling og anvendelse af FRET analysen for at studere dynamikken i Cul1•Cand1 komplekse7, og det samme princip kan anvendes for at studere dynamikken i forskellige biomolekyler. FRET opstår, når en donor er spændt med den passende bølgelængde, og en acceptor med excitation spektrum overlappende donor emission spektrum er til stede inden for en afstand på 10-100 Å. Den eksiterede tilstand er overført til acceptor, dermed faldende donor intensitet og øge acceptor intensitet18. FRET (E) effektivitet afhænger af både Förster radius (R0) og afstanden mellem donor og acceptor fluorophores (r), og er defineret af: E = R06/ (R0 6 + r6). Förster radius (R0) afhænger af et par faktorer, herunder dipol kantede orientering, den spektrale overlapning af donor-acceptor par, og løsningen anvendes19. Hvis du vil anvende FRET analysen på en stoppet-flow fluorimeter, som overvåger ændringen af donor emission i realtid og gør det muligt for målinger af hurtig kpå og kud, det er nødvendigt at fastlægge effektive FRET der resulterer i en betydelig reduktion af donor emission. Derfor udforme effektive FRET ved at vælge den passende par fluorescerende farvestoffer og websteder på target proteiner til at vedhæfte farvestofferne er vigtig og vil blive drøftet i denne protokol.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

Proteiner er de primære aktører i biologiske systemer, og de interagerer normalt med andre makro- eller små molekyler til at udføre deres biologiske funktioner. Sådanne interaktioner kan være meget dynamisk, hvilket betyder de interagerende underenheder er konstant forbundet og adskilt til bestemte priser. Mens måling bindende affinitet ved hjælp af teknikker, såsom kvantitative pull-down afslører styrken af interaktion, studerer bindende kinetik giver indsigt i, hvordan hurtigt vekselvirkningen opstår og hvor længe hver kompleks kan eksistere. Derudover måling kinetik af en interaktion ved tilstedeværelse af en yderligere faktor, som et protein udveksling faktor eller et stof, hjælper afslører den mekanisme, hvormed samspillet er reguleret af den anden faktor, give vigtig viden til de fremme af biologisk og medicinsk forskning. Her, beskriver vi en protokol til måling af den bindende kinetik af et protein kompleks, der har en høj iboende association og kan adskilles hurtigt af et andet protein. Metoden bruger fluorescens resonans energioverførsel rapportere dannelsen af protein kompleks in vitro, og det giver mulighed for overvågning af hurtig association og dissociation af kompleks i realtid på en stoppet-flow fluorimeter. Ved hjælp af denne analyse, er association og dissociation sats konstanter protein kompleks kvantificeret.

At teste FRET mellem Cul1AMC og FlAsHCand1, vi først bestemmes emissionen intensiteten af 70 nM Cul1AMC (donor) og 70 nM FlAsHCand1 (acceptor), henholdsvis (figur 3A-C, blå linjer). I hver ende, kun én emission højdepunkt var nutid, og emissionen af FlAsHCand1 var (acceptor) lav. Når 70 nM Cul1AMC og FlAsHCand1 blev blandet for at generere FRET, to emission topp...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein-protein interaktioner er kritisk for biologiske systemer, og undersøgelser af bindende kinetik give indsigt i den dynamik og funktion af proteinkomplekser. Vi beskriver en metode, der kvantificerer kinetiske parametre for et proteinkompleks ved hjælp af fluorescens resonans energioverførsel og stoppede strømmen teknik.

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Vores metode hjælper med at studere kinetik af et proteinkompleks dannelse. Den beskriver, hvor stramt et proteinkompleks er, og om proteinkompleksdannelsen forstyrres af andre proteiner. Denne teknik gør det muligt at studere protein-protein interaktion i kvantitativ måde ved hjælp af fluorescens som en reporter, kan vores analyse overvåge foreningen og disassociation af et proteinkompleks i realtid.Til at begynde med skal du designe FRET-analysen startende med dataene for COL1 CAND1-komplekset fra proteindatabasen. Læg strukturen i PyMOL, og gå derefter til guidemenuen og brug målefunktionen til at vurdere afstanden mellem den første aminosyre i CAND1 og den sidste aminosyre i COL1. Derefter indlæse online spektre seeren og se excitation og emission spectra af 7-amino-4-methylcoumarin og FlASH samtidigt.AMC er FRET donor og FlASH er FRET acceptor. Forbered cellerne med FRET-donorproteinet ved at følge med i den medfølgende tekstprotokol. Rens derefter COL1 sortase RBX1-komplekset ved først at tilføje 50 milliliter lysisbuffer til en pellet af E.Coli-celler, der udtrykker COL1-sortase RBX1-komplekset.Is cellerne på is med sonikering ved 50%amplitude. Suppleant strømmen i tre minutter, så det er et sekund på, og derefter et sekund ud for at forhindre overophedning prøven. Den resulterende celle lyser i et 50 milliliter centrifugeringsrør, og celleresterne fjernes ved centrifugering ved 25.000 gange g i 45 minutter.Derefter tilsættes supernatanten til fem milliliter glutathionperler og inkubere dem ved fire grader Celsius for at rydde cellens lysate. Efter inkubation, centrifuge bead lysat blandingen ved 1, 500 gange g i to minutter ved fire grader Celsius. Fjern derefter supernatanten.Dernæst vaskes perlerne med 5 milliliter lysis buffer uden proteasehæmmer. Efter centrifugering af opløsningen fjernes supernatanten. Nu tilsættes tre milliliter lysis buffer til de vaskede perler og overføre perlesalmning i en tom kolonne.Til den nye kolonne skal du også tilføje fem milliliter elution buffer og derefter inkubere kolonnen i 10 minutter og indsamle eluat. Dernæst tilsættes 200 mikroliter trombin på fem milligram pr. milliliter til eluatet fra glutathionperlerne. Efter en overnight inkubation ved fire grader Celsius fortyndes proteinprøven tre gange med buffer A.Load proteinprøven til en buffer En ækviliberet kationisk udveksling kromatografi kolonne ved nul punkt fem milliliter i minuttet.Derefter tilsættes en gradient på nul til 50% af buffer B i buffer A for at fremkalde proteinet med en strømningshastighed på 1 milliliter pr. minut. Dernæst pool eluate fraktioner, der indeholder FRET donor protein og koncentrere det ned til to punkt fem milliliter ved hjælp af en ultrafiltrering membran med en 30 kilodalton cutoff. Nu tilsættes 7-amino-4-methylcoumarin til c-terminus af COL1 gennem sortase medieret transpeptidation ved først at ændre bufferen i FRET donor protein prøve i sortase buffer ved hjælp af en afsaltning kolonne.For at opnå dette skal du først ligevægte en afsaltningskolonne med 25 milliliter sortasebuffer. Læg derefter to punkt fem milliliter af FRET donorproteinopløsningen i kolonnen, og kassér strømmen igennem. Dernæst eluter prøven med tre punkt fem milliliter af sortase buffer og indsamle strømmen igennem.I 900 mikroliter af eluatet tilsættes 100 mikroliter af 600 mikromolar rensede sortase A-opløsning og 10 mikroliter af et 25 millimolar GGGG-AMC peptid. Inkuber reaktionsblandingen ved 30 grader Celsius i mørke natten over for at generere COL1-AMC-RBX1. Nu indlæses hele prøven på størrelsen udelukkelse kromatografi kolonne og elute det med et punkt fem gange kolonnen volumen af buffer.I sidste ende skal du samle de elluatfraktioner, der indeholder COL1-AMC-RBX1. Følg med i tekstprotokollen for at forberede FRET-acceptorproteinet. Mange af trinene svarer til FRET donor protein præparat.Når flash CAND1-løsningen er færdig, klargøres. Først tilsættes en mikroliter af FlASH-opløsningen til 50 mikroliter af den frisklavede tetra-cys-CAND1-opløsning. Bland de kombinerede opløsninger godt og inkuber blandingen ved stuetemperatur i mørke i en til to timer for at danne FlASH CAND1 opløsningen.I 300 mikroliter FRET buffer, tilsæt COL1-AMC-RBX1 til en endelig koncentration på 70 nanomolar og overføre opløsningen til en cuvette. Cuvette i prøveholderen på et fluoritometer. Udgæng prøven med 350 nanometeroptimeringslys og scan emissionssignalerne fra 400 til 600 nanometer ved et nanometerinterval.Derefter, i 300 mikroliter af FRET buffer, tilføje både COL1-AMC-RBX1 og FlASH-CAND1 til en endelig koncentration på 70 nanomolar. Udret prøven med 350 nanometeroptimeringslys og scan emissionssignalerne fra 400-600 nanometer ved et nanometertrin. Indstil excitationslyset til 350 nanometer og brug et båndpasfilter, der gør det muligt for 450 nanometer emissionslys at passere og blokerer 500 til 650 nanometer emissionslys.Med prøveventilerne i påfyldningspositionen tilsluttes en tre millilitersprøjt fyldt med vand. Derefter vaskes de to prøvesprøjter med vand ved at flytte prøvesprøjten op og ned flere gange og kassere vandet, når det er færdigt. Tilslut derefter en tre millilitersprøjte fyldt med FRET-buffer.De to prøvesprøjter vaskes med FRET-bufferen ved at flytte prøvesprøjtens drev op og ned flere gange og kassere vandet, når det er færdigt. Nu skal du tilslutte en tre milliliter sprøjte og indlæse den første prøve sprøjte, sprøjte A, med 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 i FRET buffer. Drej derefter prøveventilen til drevpositionen Også, tilslut en tre millilitersprøjte til sprøjte B, og lad sprøjteN B med 100 nanomolar FlASH CAND1 i FRET-bufferen blive om, og ventilen drejes til drevpositionen.Åbn kontrolpanelet under erhverve i softwaren og registrere emissionen af COL1-AMC i løbet af 60 sekunder. Så tag et enkelt skud. Tilpas faldet og fluorescerende signaler målt over tid fra hvert skud til en enkelt eksponentiel kurve.Vask systemet som tidligere vist, og tilsæt derefter en opløsning på 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 og 100 nanomolar FlASH CAND1 i FRET-bufferen til sprøjte A.Tilslut det til systemet, mens det er i påfyldningspositionen Belastningssprøjten A, og drej derefter prøveventilen til drevpositionen. Dernæst skal du lægge en opløsning af Skp1-Skp2 i sprøjte B.Tilslut den til systemet, mens den er i påfyldningspositionen. Læg sprøjten B på, og drej derefter prøven til drevpositionen.I softwaren skal du anskaffe og åbne kontrolpanelet. Konfigurer programmet til at registrere emissionen af COL1-AMC over 30 sekunder. Så tag et enkelt skud.Fluorescenssignalerne øges over tid efter blanding af opløsninger fra sprøjte A og sprøjte B.Når 70 nanomolar hver af COL1-AMC og FlASH CAND1 blev blandet for at generere FRET, var der to emissionstoppe til stede i emissionsspektre. Og toppen af COL1-AMC blev lavere, og toppen af FlASH CAND1 blev højere. Når den fulde længde CAND1 blev brugt til FRET donor peak viste en 10% reduktion i intensitet.Men når CAND1 med sin første helix afkortet blev brugt reduktion af donor peak intensitet blev øget til 30%tyder på højere FRET effektivitet For at bekræfte, at signalet ændringer var resultatet af FRET mellem COL1-AMC og FlASH CAND1, donor FRET blev blandet med overskydende umærket CAND1 kendt som Chase i acceptoren. Som følge heraf blev donortoppen fuldstændigt genoprettet, og acceptortoppen blev reduceret. Vist her er et plot af den gennemsnitlige observerede K-værdi med CAND1-koncentrationen efter lineær regressionsanalyse.For at måle på konstanten af komplekset blev 50 nanomolar COL1-AMC anvendt i en række observerede dissociationshastighedskonstanter målt ved at blande 50 nanomolar COL1-AMC med stigende koncentrationer af FlASH CAND1. I lighed med målingen af den konstante påsætning blev den observerede dissociationskonstant for COL1 og CAND1 fundet ved at overvåge restaureringen af donorsignalet over tid på det stoppede flowfluorometer. Her steg donorsignalet hurtigt, og det afslørede en observeret K-værdi på nulpunkt fire per sekund.I modsætning hertil blev der, når bufferen blev føjet til det formonterede kompleks, ikke observeret nogen signalstigning, hvilket tyder på, at den hurtige dissociation af COL1 CAND1 blev udløst af Skp1 Skp2. Sørg for at minimere mængden af lys, som donoren og acceptorproteinerne udsættes for. Prøv at holde fluorophores i mørke så meget som muligt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens Anisotropi som værktøj til at studere protein-protein interaktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Udnyttelse af tidsforelt protein-induceret fluorescensforbedring til at identificere stabile lokale konformationer En α-Synuclein Monomer ad gangen

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...