Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Wij danken Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) voor inzichtelijke discussie over de ontwikkeling van de FRET assay. M.G., Y.Z. en X.L. werden gefinancierd door fondsen van het opstarten van Purdue University te Y.Z. en X.L.This werk gedeeltelijk werd gesteund door een subsidie van zaad van Purdue University Center voor plantenbiologie.

1. het ontwerp van de FRET assay.
<ol><li>Download het bestand van de structuur van de complexe Cul1•Cand1 van de Protein Data Bank (bestand 1U6G).</li>
	<li>De structuur van de Cul1•Cand1 complexe in PyMOL weergeven.</li>
	<li>Met de functie van de meting onder het menu van de Wizard voor PyMOL schatting maken van de afstand tussen de eerste aminozuur van de Cand1 en het laatste aminozuur van Cul1 (Figuur 1).</li>
	<li>Laden van de viewer online spect...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li><li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+probing+disease+mechanisms+using+model+systems.">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).</li><li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cellular+protein-protein+interactions:+Technological+strategies+and+opportunities.">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li><li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple,+direct,+and+quantitative+in+vitro+binding+assays.">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).</li><li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+kinetic+studies+of+biological+interactions:+A+review.">Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).</li><li>Pierce, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1+promotes+assembly+of+new+SCF+complexes+through+dynamic+exchange+of+F+box+proteins.">Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins.</a> Cell. 153 (1), 206-215 (2013).</li><li>Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1-Mediated+Adaptive+Exchange+Mechanism+Enables+Variation+in+F-Box+Protein+Expression.">Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression.</a> Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).</li><li>Zheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cul1-Rbx1-Skp1-F+boxSkp2+SCF+ubiquitin+ligase+complex.">Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex.</a> Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).</li><li>Kleiger, G., Deshaies, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag+Team+Ubiquitin+Ligases.">Tag Team Ubiquitin Ligases.</a> Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1+binds+to+unneddylated+CUL1+and+regulates+the+formation+of+SCF+ubiquitin+E3+ligase+complex.">CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex.</a> Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).</li><li>Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+unneddylated+cullin+1+and+regulates+its+neddylation.">TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation.</a> FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).</li><li>Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+cullins+and+modulates+ubiquitin+ligase+activity.">TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).</li><li>Goldenberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cand1-Cul1-Roc1+complex+reveals+regulatory+mechanisms+for+the+assembly+of+the+multisubunit+cullin-dependent+ubiquitin+ligases.">Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases.</a> Cell. 119 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ETA2,+an+apparent+ortholog+of+the+human+cullin-interacting+protein+CAND1,+is+required+for+auxin+responses+mediated+by+the+SCF(TIR1)+ubiquitin+ligase.">Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase.</a> Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CAND1,+an+Unmodified+CUL1-Interacting+Protein,+Is+Involved+in+Multiple+Developmental+Pathways+Controlled+by+Ubiquitin/Proteasome-Mediated+Protein+Degradation.">Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation.</a> the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).</li><li>Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtCAND1,+a+HEAT-repeat+protein+that+participates+in+auxin+signaling+in+Arabidopsis.">AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).</li><li>Lo, S. -. C., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1-Mediated+Substrate+Adaptor+Recycling+Is+Required+for+Efficient+Repression+of+Nrf2+by+Keap1.">CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).</li><li>Okamoto, K., Sako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+FRET+for+the+study+of+protein+interactions+and+dynamics.">Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).</li><li>Hussain, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET).">An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET).</a> arXiv preprint. , (2009).</li><li>Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+and+purification+of+recombinant+SCF+ubiquitin+ligases.">High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases.</a> Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).</li><li>Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortagging:+A+versatile+method+for+protein+labeling.">Sortagging: A versatile method for protein labeling.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).</li><li>Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Protein+Labeling+via+Sortase-Mediated+Transpeptidation.">Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-PAGE+of+Proteins.">SDS-PAGE of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+E2-E3+Assembly+and+Disassembly+Enable+Processive+Ubiquitylation+of+Cullin-RING+Ubiquitin+Ligase+Substrates.">Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates.</a> Cell. 139 (5), 957-968 (2009).</li><li>Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Stopped-flow+Kinetics+Methods+to+Investigate+the+Mechanism+of+Action+of+a+DNA+Repair+Protein.">Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).</li><li>Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Stopped-Flow+Fluorescence+and+Labeled+Nucleotides+to+Analyze+the+ATP+Turnover+Cycle+of+Kinesins.">Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs.">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Lin, C. T., Rorabacher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+approach+for+stopped-flow+kinetics+of+fast+second-order+reactions+involving+inhomogeneity+in+the+reaction+cell.">Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell.</a> Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).</li><li>Toseland, C. P., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Reaction+Kinetic+Techniques.">Rapid Reaction Kinetic Techniques.</a> Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Lin, C. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase-catalyzed+site-specific+conjugation+of+small-molecule+probes+to+proteins+in+vitro+and+on+the+surface+of+living+cells.">Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+short+peptide+tag+for+versatile+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).</li><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+Basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+GTPase+movement+on+an+RNA+scaffold+drives+co-translational+protein+targeting.">Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting.</a> Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).</li></ol>

FRET is een fysieke fenomeen dat is van groot belang voor het bestuderen en begrijpen van biologische systemen19. Hier presenteren we een protocol voor het testen en het gebruik van de FRET te bestuderen van de bindende kinetiek van twee interacterende eiwitten. Bij het ontwerpen van FRET, vonden wij drie belangrijke factoren: de spectrale overlap tussen donor emissie en acceptor excitatie, de afstand tussen de twee fluorophores, en de oriëntatie van de dipool van de fluorophores<sup class="xref"...

Biologische activiteit worden uiteindelijk uitgevoerd door eiwitten, meest waarvan communiceren met anderen voor goede biologische functies. Met behulp van een rekenkundige benadering, de totale hoeveelheid eiwit-eiwitinteractie in mens wordt geschat op ~ 650.0001en verstoring van deze interacties vaak leidt tot ziekten2. Als gevolg van hun essentiële rol bij het beheersen van cellulaire en organisch processen, zijn tal van methoden ontwikkeld om te bestuderen van eiwit-eiwitinteractie, zoals gist-twee-hybride, bimolecular fluorescentie complementatie, split-luciferase complementatie en co-immunoprecipitation assay3. Terwijl deze methoden goed zijn in het ontdekken en bevestiging van eiwit-eiwitinteractie, ze zijn meestal niet-kwantitatieve en dus beperkte informatie verstrekken over de verwantschap tussen de interactie eiwit-partners. Kwantitatieve pull-downs kunnen worden gebruikt voor het meten van de bindende affiniteit (bijvoorbeeld de dissociatieconstante Kd), maar het niet meet de kinetiek van de binding, noch kan het worden toegepast wanneer de Kd erg laag als gevolg van een ontoereikende is Signal-to-noise verhouding4. Oppervlakte plasmon (SPR) resonantie spectroscopie kwantificeert de kinetiek van bindende, maar het vereist een specifieke oppervlakte en immobilisatie van een reactieve op het oppervlak, die de bindende eigenschap van het reactieve5kan wijzigen. Bovendien is het moeilijk voor SPR voor het meten van de snelle associatie en dissociatie tarieven5, en het is niet gepast gebruik van SPR te karakteriseren van de gebeurtenis van het uitwisselen van eiwit subeenheden in een eiwit complex. Hier beschrijven we een methode waarmee het meten van de tarieven van eiwit complex montage en demontage op de tijdschaal van een milliseconde. Deze methode was essentieel voor het bepalen van de rol van Cullin -eenssociated -Nedd8 -oissociated eiwit 1 (Cand1) als de F-doos eiwit uitwisseling factor6,7.
Cand1 regelt de dynamiek van Skp1•Cul1•F-box eiwit (SCF) E3 ligases, die tot de grote familie van Cullin-RING ubiquitin ligases behoren. SCF bestaan uit de cullin Cul1, die de RING domein proteïne Rbx1 bindt, en een verwisselbare F-doos-eiwit, dat werft substraten en bindt Cul1 via de adapter proteïne Skp18. Als een ligase E3, SCF katalyseert de vervoeging van ubiquitin aan de ondergrond, en het wordt geactiveerd wanneer het substraat is aangeworven door de F-doos-eiwit, en als Cul1 door de ubiquitin-achtige eiwitten Nedd89wordt gewijzigd. Cand1 bindt ongewijzigde Cul1, en op bindende, het verstoort zowel de vereniging van Skp1•F-box eiwit met Cul1 en de vervoeging van Nedd8 naar Cul110,11,12,13. Dientengevolge, Cand1 leek, moet een inhibitor van de omwenteling van het SCF-activiteit in vitro, maar Cand1 deficiëntie in organismen veroorzaakt gebreken dat suggereert een positieve rol van Cand1 bij het reguleren van de SCF activiteiten in vivo14,15,16 , 17. deze paradox werd eindelijk verklaard door een kwantitatieve studie waaruit bleek de dynamische interacties tussen Cul1, Cand1 en Skp1•F-box eiwit. Met behulp van fluorescentie resonantie energie transfer (FRET) testen die de vorming van de Cul1•Cand1 en Financieringsmiddelen complexen detecteren, de associatie en dissociatie stem constanten (kop en kuit, respectievelijk) werden individueel gemeten. De metingen bleek dat zowel Cand1 als Skp1•F-box eiwit vorm uiterst krap complex met Cul1, maar de kaf van SCF dramatisch door de Cand1 toegenomen is en de kaf van Cul1•Cand1 is sterk toegenomen door Skp1•F-vak eiwit6,7. Deze resultaten verlenen de initiële en kritische steun voor het definiëren van de rol van Cand1 als een eiwit uitwisseling factor, die de vorming van nieuwe SCF complexen via recycling van Cul1 uit de oude SCF complexen katalyseert.
Hier presenteren we de procedure voor de ontwikkeling en het gebruik van de FRET bepaling te bestuderen van de dynamiek van de Cul1•Cand1 complexe7, en hetzelfde principe kan worden toegepast om te bestuderen van de dynamiek van verschillende biomoleculen. FRET treedt op wanneer een donor enthousiast met de juiste golflengte is, en een accepteerder met excitatie spectrum overlapt het emissiespectrum van de donor aanwezig binnen een afstand van 10-100 is Å. De geëxciteerde toestand wordt overgebracht naar de acceptor, waardoor verminderen de intensiteit van de donor en de acceptor intensiteit18verhogen. De efficiëntie van de FRET (E) is afhankelijk van zowel de Förster straal (R0) en de afstand tussen de donor en acceptor fluorophores (r), en wordt bepaald door: E = R06/ (R0 6 + r6). De Förster straal (R0) hangt af van enkele factoren, waaronder de dipool hoekige oriëntatie, de spectrale overlap tussen het donor-acceptor paar, en de oplossing gebruikt19. Toe te passen van de bepaling van de FRET op een fluorimeter gestopt-stroom, die de verandering van de emissie van de donor in real-time monitoren en metingen van snelle kop en kuitkunt, is het noodzakelijk om efficiënte FRET die resulteert in een aanzienlijke vermindering van de uitstoot van de donor. Daarom ontwerpen van efficiënte FRET door het kiezen van het juiste paar fluorescente kleurstoffen en sites op de doel-eiwitten te hechten de kleurstoffen is belangrijk en zal worden besproken in dit protocol.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

Eiwitten zijn de primaire operatoren van biologische systemen, en ze meestal in combinatie met andere macro- of kleine moleculen hun biologische functies te vervullen. Dergelijke interacties kunnen zeer dynamisch, wat betekent dat de interactie subeenheden zijn voortdurend gekoppeld aan en losgekoppeld op bepaalde tarieven. Terwijl de bindende affiniteit met behulp van technieken zoals kwantitatieve pull-down onthult de sterkte van de interactie, de bindende kinetiek studeren biedt u inzichten over hoe snel de interactie plaatsvindt en hoe lang elke complex kan bestaan. Bovendien meten de kinetiek van een interactie in de aanwezigheid van een bijkomende factor, zoals een eiwit uitwisseling factor of een drug, helpt het onthullen van het mechanisme waarmee de interactie wordt geregeld door de andere factor, die belangrijke kennis ten behoeve van de bevordering van de biologische en medisch onderzoek. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de kinetiek van de binding van een eiwit complex dat kent een hoge intrinsieke vereniging en kan snel worden losgekoppeld door een ander eiwit. De methode fluorescentie resonantie energieoverdracht gebruikt om het verslag van de vorming van het eiwit complex in vitro, en hiermee is controle op de snelle associatie en dissociatie van het complex in real time op een fluorimeter gestopt-flow. Met behulp van deze test, worden de snelheidsconstanten associatie en dissociatie van het eiwit complex gekwantificeerd.

Voor het testen van de FRET tussen Cul1AMC en FlAsHCand1, we eerst bepaald de emissie-intensiteit van 70 nM Cul1AMC (de donor) en 70 nM FlAsHCand1 (de acceptor), respectievelijk (figuur 3A-C, blauwe lijnen). In elke analyse slechts één uitstoot piek aanwezig, en de uitstoot van FlAsHCand1 was was (de acceptor) laag. Wanneer 70 nM elke van Cul1AMC en FlAsHCand1 ware...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Eiwit-eiwitinteractie zijn kritisch voor biologische systemen, en studies over de bindende kinetiek inzicht verwerven in de dynamiek en de functie van eiwitcomplexen. Beschrijven we een methode die kwantificeert de kinetische parameters van een eiwit complex met behulp van fluorescentie resonantie-energie-overdracht en de techniek gestopt-flow.

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Onze methode helpt bij het bestuderen van de kinetiek van een eiwitcomplexe formatie. Het beschrijft hoe strak een eiwitcomplex is, en of de eiwitcomplexe vorming wordt verstoord door andere eiwitten. Deze techniek maakt het mogelijk om eiwit-eiwit interactie op kwantitatieve wijze te bestuderen met behulp van fluorescentie als verslaggever, onze test kan de associatie en ontkoppeling van een eiwitcomplex in real-time monitoren.Om te beginnen ontwerpt u de FRET-test die begint met de gegevens voor het COL1 CAND1-complex uit de eiwitdatabase. Laad de structuur in PyMOL en ga vervolgens naar het tovenaarsmenu en gebruik de meetfunctie om de afstand tussen het eerste aminozuur van CAND1 en het laatste aminozuur van COL1 te schatten. Laad vervolgens de online spectra-viewer en bekijk tegelijkertijd de excitatie en emissiespectra van 7-amino-4-methylcoumarine en FlASH.AMC is de FRET donor en FlASH is de FRET acceptor. Bereid cellen voor met het FRET-donoreiwit door mee te volgen in het bijbehorende tekstprotocol. Zuiver vervolgens het COL1 sortase RBX1-complex door eerst 50 milliliter lysebuffer toe te voegen aan een pellet van E.Coli-cellen die het COL1 sortase RBX1-complex uitdrukken.IJs de cellen op ijs met sonicatie op 50%amplitude. Wissel de stroom gedurende drie minuten af, zodat deze één seconde aan staat en vervolgens één seconde af om oververhitting van het monster te voorkomen. Breng het resulterende cellysaat over in een 50 milliliter centrifugatiebuis en verwijder het celpuin door middel van centrifugatie op 25.000 keer g gedurende 45 minuten.Voeg vervolgens de supernatant toe aan vijf milliliter glutathionkralen en broed ze uit op vier graden Celsius om de cellysaat te zuiveren. Na incubatie, centrifugeren de kraal lysate mengsel op 1, 500 keer g gedurende twee minuten op vier graden Celsius. Verwijder vervolgens de supernatant.Was vervolgens de kralen met 5 milliliter lysebuffer zonder proteaseremmer. Na het centrifugeren van de oplossing, verwijder de supernatant. Voeg nu drie milliliter lysebuffer toe aan de gewassen kralen en breng de kraaldrijfmest over in een lege kolom.Voeg aan de nieuwe kolom ook vijf milliliter elutiebuffer toe en vervolgens de kolom gedurende 10 minuten uitbroeden en verzamel het eluaat. Voeg vervolgens 200 microliter trombine met vijf milligram per milliliter toe aan het eluaat van de glutathionkralen. Na een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius verdun het eiwitmonster drie maal met buffer A.Load het eiwitmonster naar een buffer A geëquilibrated cationic exchange chromatografiekolom op nul punt vijf milliliter per minuut.Voeg vervolgens een verloop van nul tot 50% van buffer B toe in buffer A om het eiwit te ontwijken met een stroomsnelheid van 1 milliliter per minuut. Vervolgens, pool de eluate fracties met de FRET donor eiwit en concentraat tot twee punt vijf milliliter met behulp van een ultrafiltratie membraan met een 30 kilodalton cutoff. Voeg nu 7-amino-4-methylcoumarine toe aan het c-eindpunt van COL1 door middel van sortase gemedieerde transpeptidatie door eerst de buffer in het FRET-donoreiwitmonster in de sortasebuffer te veranderen met behulp van een ontziltingskolom.Om dit te bereiken, eerst evenwicht een desalting kolom met 25 milliliter van sortase buffer. Laad vervolgens twee punt vijf milliliter van de FRET-donoreiwitoplossing in de kolom en gooi de stroom erdoor weg. Vervolgens, elute het monster met drie punt vijf milliliter van sortase buffer en het verzamelen van de stroom door.Voeg in 900 microliter van het eluaat 100 microliter van 600 micromolar gezuiverde sortase A-oplossing en 10 microliters van een 25 millimolar GGGG-AMC peptide toe. Incubeer het reactiemengsel bij 30 graden Celsius in het donker 's nachts te genereren COL1-AMC-RBX1. Laad nu al het monster op de chromatografiekolom voor grootteuitsluiting en maak het met één punt vijf keer het kolomvolume van de buffer.Verpool uiteindelijk de eluate-fracties met COL1-AMC-RBX1. Volg mee in het tekstprotocol om het FRET acceptor eiwit voor te bereiden. Veel van de stappen zijn vergelijkbaar met de FRET donor eiwit preparaat.Bereid de FlASH CAND1-oplossing voor nadat deze klaar is. Voeg eerst één microliter van de FlASH-oplossing toe aan 50 microliter van de vers bereide tetra-cys-CAND1-oplossing. Meng de gecombineerde oplossingen goed en broed het mengsel bij kamertemperatuur in het donker gedurende één tot twee uur om de FlASH CAND1-oplossing te vormen.Voeg in 300 microliter FRET-buffer COL1-AMC-RBX1 toe aan een uiteindelijke concentratie van 70 nanomolar en breng de oplossing over in een cuvette. Plaats de cuvette in de monsterhouder van een fluoriometer. Prikkel het monster met 350 nanometer excitatielicht en scan de emissiesignalen van 400 tot 600 nanometer bij een nanometer stappen.Voeg vervolgens in 300 microliter FRET-buffer zowel COL1-AMC-RBX1 als FlASH-CAND1 toe aan een uiteindelijke concentratie van 70 nanomolar. Prikkel het monster met 350 nanometer excitatielicht en scan de emissiesignalen van 400-600 nanometer bij een nanometer stappen. Stel het excitatielicht in op 350 nanometer en gebruik een bandpassfilter waarmee 450 nanometer emissielicht kan passeren en 500 tot 650 nanometer emissielicht blokkeert.Met de monsterkleppen op de vulpositie sluit een drie milliliter spuit gevuld met water. Dan, was de twee monsterspuiten met water door het verplaatsen van het monster spuit rijden op en neer meerdere malen, het weggooien van het water wanneer u klaar bent. Sluit vervolgens een spuit van drie milliliter aan gevuld met FRET-buffer.Was de twee monsterspuiten met de FRET-buffer door de monsterspuit meerdere keren op en neer te bewegen en het water weg te gooien als het klaar is. Sluit nu een spuit van drie milliliter aan en laad de eerste monsterspuit, spuit A, met 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 in de FRET-buffer. Draai vervolgens de monsterklep op de aandrijfpositie Ook sluit u een spuit van drie milliliter aan op spuit B en laad spuit B met 100 nanomolar FlASH CAND1 in de FRET-buffer en zet de klep naar de aandrijfpositie.Open het bedieningspaneel onder acquire in de software en noteren de emissie van COL1-AMC in de loop van 60 seconden. Neem dan een enkel schot. Pas de daling en de fluorescerende signalen gemeten in de tijd van elk schot tot een enkele exponentiële curve.Was het systeem zoals eerder getoond en voeg vervolgens een oplossing van 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 en 100 nanomolar FlASH CAND1 in de FRET buffer in spuit A.Connect het aan het systeem terwijl het in de vulpositie Load spuit A en zet het monster klep naar de drive positie. Laad vervolgens een oplossing van Skp1-Skp2 in spuit B.Connect it to the system while it is in the fill position. Laad spuit B en draai het monster naar de aandrijfpositie.In de software, ga naar het verwerven en open het bedieningspaneel. Stel het programma in om de uitstoot van COL1-AMC over 30 seconden vast te leggen. Neem dan een enkel schot.De fluorescentie signalen toenemen na verloop van tijd na het mengen van oplossingen van spuit A en spuit B.When 70 nanomolar elk van COL1-AMC en FlASH CAND1 werden gemengd om FRET te genereren, twee emissiepieken aanwezig waren in de emissiespectra. En de piek van COL1-AMC werd lager, en de piek van FlASH CAND1 werd hoger. Toen de volledige lengte CAND1 werd gebruikt voor FRET vertoonde de donorpiek een intensiteitsdaling van 10%.Echter, toen CAND1 met zijn eerste helix afgekapt werd gebruikt, werd de vermindering van de intensiteit van de donorpiek verhoogd tot 30%, wat duidt op een hogere FRET-efficiëntie Om te bevestigen dat de signaalwijzigingen het gevolg waren van FRET tussen COL1-AMC en FlASH CAND1, werd de donor FRET gemengd met overtollige niet-geëtiketteerde CAND1 die bekend staat als de Chase in de acceptor. Als gevolg hiervan werd de donorpiek volledig hersteld en werd de acceptorpiek verminderd. Hier wordt een plot weergegeven van de gemiddelde waargenomen K-waarde met de CAND1-concentratie na lineaire regressieanalyse.Om de constante van het complex te meten, werd 50 nanomolar COL1-AMC gebruikt in een reeks waargenomen dissociatiesnelheidconstanten werden gemeten door 50 nanomolar COL1-AMC te mengen met toenemende concentraties FlASH CAND1. Vergelijkbaar met de meting van de op constante, de waargenomen dissociatie constante van COL1 en CAND1 werd gevonden door het toezicht op het herstel van het donorsignaal na verloop van tijd op de gestopte stroomfluorometer. Hier steeg het donorsignaal snel en het openbaarde een waargenomen K waarde van nul punt vier per seconde.Wanneer daarentegen een buffer werd toegevoegd aan het voorgemonteerde complex, werd er geen signaalverhoging waargenomen die suggereert dat de snelle dissociatie van COL1 CAND1 werd geactiveerd door Skp1 Skp2. Zorg ervoor dat de hoeveelheid licht waar de donor en acceptor-eiwitten aan worden blootgesteld, worden geminimaliseerd. Probeer fluoroforen zoveel mogelijk in het donker te houden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...