Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Wir danken Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) für aufschlussreiche Diskussion über die Entwicklung des Bund-Assays. M.G., Y.Z und X.L. wurden durch Start-Fonds von der Purdue University, Y.Z finanziert und X.L.This Arbeit wurde teilweise durch einen Zuschuss der Samen von Purdue University Center für Pflanzenbiologie unterstützt.

1. Entwurf der Bund-Assay.
<ol><li>Download der Strukturdatei der komplexen Cul1•Cand1 von der Protein Data Bank (Datei 1U6G).</li>
	<li>Zeigen Sie die Struktur des Komplexes in PyMOL Cul1•Cand1.</li>
	<li>Die Messfunktion unter Menü " Assistenten " von PyMOL verwenden, um den Abstand zwischen der ersten Aminosäure des Cand1 und die letzten Aminosäure des Cul1 zu schätzen (Abbildung 1).</li>
	<li>Laden Sie die Online-Spektren-Viewer (siehe ...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. 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FRET ist ein physikalisches Phänomen, das von großem Interesse für Studium und das Verständnis biologischer Systeme19ist. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Prüfung und Verwendung von Bund, um die verbindliche Kinetik der zwei interagierenden Proteine zu studieren. Beim Bund zu entwerfen, wir hielten drei Hauptfaktoren: die spektrale Überlappung zwischen Emission und Akzeptor Erregung Spender, der Abstand zwischen den zwei Fluorophore und die Dipol-Ausrichtung der Fluorophor...

Biologische Aktivitäten erfolgt letztlich durch Proteine, die meisten davon mit anderen für richtige biologische Funktionen interagieren. Mit einem rechnerischen Ansatz, der Gesamtbetrag der Protein-Protein-Interaktionen in der menschlichen wird voraussichtlich 650.000 ~1und Störung dieser Interaktionen oft führt zu Krankheiten2. Durch ihre entscheidende Rolle bei der Kontrolle der zellulärer und organismal Prozessen wurden zahlreiche Methoden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Hefe-zwei-Hybrid, bimolekulare Fluoreszenz Komplementierung, Split-Luciferase studieren Ergänzung und co-Immunopräzipitation Assay3. Während diese Methoden gut entdecken und Bestätigung von Protein-Protein-Interaktionen sind, sie sind in der Regel nicht-quantitative und somit bieten nur begrenzte Informationen über die Affinität zwischen den Interaktionspartnern Protein. Quantitative Pulldown-Menüs können zur Messung der Bindungsaffinität (z. B. die Dissoziationskonstante Kd), aber es misst nicht die Kinetik der Bindung, noch kann es angewendet werden, wenn die K-d sehr niedrig, da eine unzureichende ist Signal-Rausch-Verhältnis4. Surface Plasmon-Resonanz (SPR)-Spektroskopie quantifiziert die verbindliche Kinetik, aber es erfordert eine spezifische Oberfläche und Immobilisierung von einem Reaktionspartner auf der Oberfläche, die potenziell die Binding-Eigenschaft der Reaktanten5ändern können. Darüber hinaus ist es schwierig für SPR schnell Assoziation und Dissoziation Preise5messen, und es ist nicht angebracht, SPR verwenden, um die Charakterisierung der Veranstaltung zum Austausch von Protein-Untereinheiten in einem Proteinkomplex. Hier beschreiben wir eine Methode, die erlaubt Messraten von Protein komplexe Montage und Demontage auf einer Millisekunde Zeitskala. Diese Methode war wesentlich für die Bestimmung der Rolle von CUllin - Warnformate -Nedd8 -dIssociated Protein 1 (Cand1)als die F-Box Protein Austausch Faktor6,7.
Cand1 regelt die Dynamik der Skp1•Cul1•F-Box-Protein (SCF) E3 Ligases, die zu der großen Familie von Cullin-RING Ubiquitin Ligases gehören. SKSF bestehen aus den cullin, Cul1, die das RING Domain Protein Rbx1 bindet, und eine austauschbare F-Box Protein, das Rekruten Substrate und Cul1 durch den Adapter Protein Skp18bindet. Als eine E3-Ligase SCF katalysiert die Konjugation des Ubiquitin an seinem Substrat, und es ist aktiviert, wenn das Substrat durch die F-Box Protein rekrutiert und Cul1 des Proteins Ubiquitin-artigen Nedd89geändert wird. Cand1 bindet unmodifizierten Cul1 und bei der Bindung, stört es sowohl der Verband der Skp1•F-Box-Protein mit Cul1 und die Konjugation von Nedd8 bis Cul110,11,12,13. Infolgedessen Cand1 schien ein Inhibitor der SCF Aktivität in vitro, aber Cand1 Mangel in Organismen verursacht Mängel, die eine positive Rolle des Cand1 schlägt bei der Regulierung der SCF Aktivitäten in Vivo14,15,16 , 17. dieses Paradox erklärt sich schließlich durch eine quantitative Studie, die die dynamische Interaktionen zwischen Cul1, Cand1 und Skp1•F-Box-Protein enthüllt. Mit Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays, die die Bildung der SCF und Cul1•Cand1 komplexe erkennen, der Assoziation und Dissoziation bewerten konstanten (kauf und kab, beziehungsweise) wurden einzeln gemessen. Die Messungen ergaben, dass Cand1 und Skp1•F-Box Protein Form extrem engen Komplex mit Cul1, aber die kaus der SCF durch Cand1 drastisch erhöht wird und die kaus der Cul1•Cand1 wird drastisch erhöht Skp1•F-Box Protein6,7. Diese Ergebnisse unterstützen die aus- und kritische Bestimmung der Rolle der Cand1 als ein Protein Austausch Faktor, der die Bildung von neuen SCF-komplexe durch recycling von Cul1 aus der alten SCF komplexe katalysiert.
Hier präsentieren wir Ihnen das Verfahren der Entwicklung und Verwendung der Bund-Assay, um die Dynamik der Cul1•Cand1 Komplex7zu studieren, und das gleiche Prinzip kann angewendet werden, um die Dynamik der verschiedenen Biomolekülen zu studieren. Bund tritt auf, wenn ein Spender freut sich mit der entsprechenden Wellenlänge, und ein Akzeptor mit Anregungsspektrums Überlappung der Spender Emissionsspektrum in einer Entfernung von 10-100 ist Å. Die angeregten Zustand wird in den Akzeptor, wodurch abnehmender Spender Intensität und Akzeptor Intensität18übertragen. Die Effizienz der Bund (E) hängt der Förster-Radius (R0) und der Abstand zwischen Donor und Akzeptor Fluorophore (R) und zeichnet sich durch: E = R06/ (R0 6 + R6). Der Förster-Radius (R0) hängt von einigen Faktoren, einschließlich der Dipol Winkelorientierung, die spektrale Überlappung der Donor-Akzeptor-paar und die Lösung verwendet,19. Um die Bund-Assay auf einem Fluorimeter gestoppt-Flow anwenden, die die Änderung der Spender Emission in Echtzeit überwacht und ermöglicht Messungen der schnelle kauf und kaus, ist es notwendig, effiziente Bund, Ergebnisse einer signifikanten Reduktion der Spender Emission. Daher gestalten effiziente Bund durch die Wahl der entsprechenden paar fluoreszierende Farbstoffe und Websites auf die Zielproteine um die Farbstoffe zu befestigen ist wichtig und in diesem Protokoll diskutiert werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

Proteine sind die primären Betreiber von biologischen Systemen, und sie in der Regel interagieren mit anderen Makro oder kleine Moleküle, deren biologische Funktionen durchzuführen. Solche Interaktionen können sehr dynamisch, d. h. die interagierenden Untereinheiten sind ständig verbunden und getrennt zu bestimmten Preisen sein. Während Messen der Bindungsaffinität mit Techniken wie quantitative Pulldown-Menü zeigt die Stärke der Wechselwirkung, studieren die verbindliche Kinetik Einblicke darüber, wie schnell gibt die Interaktion erfolgt und wie lange jede Anlage bestehen kann. Darüber hinaus messen die Kinetik einer Interaktion in der Gegenwart ein zusätzlicher Faktor, wie ein Protein-Austausch-Faktor oder ein Medikament hilft den Mechanismus zu offenbaren, die Interaktion durch den anderen Faktor geregelt ist, wichtige Erkenntnisse für die Bereitstellung, der Förderung der biologischen und medizinischen Forschung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der verbindliche Kinetics von einem Proteinkomplex, das hat eine hohe intrinsische Verband und kann schnell durch ein anderes Protein getrennt werden. Die Methode verwendet Fluoreszenz Resonanz Energietransfer um zu melden, die Bildung von in-vitro-Protein-Komplex, und es ermöglicht die Überwachung der schnelle Assoziation und Dissoziation des Komplexes in Echtzeit auf einem gestoppt-Flow Fluorimeter. Mit diesem Test, werden die Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten von dem Proteinkomplex quantifiziert.

Testen Sie den Bund zwischen Cul1AMC und FlAsHCand1 wir zunächst ermittelt die Emissionsintensität 70 nM Cul1AMC (Spender) und 70 nM FlAsHCand1 (Akzeptor), bzw. (Abb. 3A-C, blaue Linien). In jeder Analyse nur eine Emission Peak Gegenwart und die Emission von FlAsHCand1 war, war (Akzeptor) niedrig. Wenn 70 nM der Cul1AMC und FlAsHCand1 waren gemischt, um Bund zu gen...

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Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein-Protein-Interaktionen sind von entscheidender Bedeutung für biologische Systeme, und Studien der verbindliche Kinetik geben Einblicke in die Dynamik und Funktion von Proteinkomplexen. Wir beschreiben eine Methode, die die kinetischen Parameter von einem Proteinkomplex mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer und die gestoppt-Flow-Technik quantifiziert.

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Unsere Methode hilft, die Kinetik einer Proteinkomplexbildung zu untersuchen. Es beschreibt, wie eng ein Proteinkomplex ist und ob die Proteinkomplexbildung durch andere Proteine gestört wird. Diese Technik ermöglicht die quantitative Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion mit Hilfe der Fluoreszenz als Reporter, unser Assay kann die Assoziation und Disassoziation eines Proteinkomplexes in Echtzeit überwachen.Entwerfen Sie zunächst den FRET-Assay, beginnend mit den Daten für den COL1 CAND1-Komplex aus der Proteindatenbank. Laden Sie die Struktur in PyMOL, und gehen Sie dann zum Assistentenmenü und verwenden Sie die Messfunktion, um den Abstand zwischen der ersten Aminosäure von CAND1 und der letzten Aminosäure von COL1 abzuschätzen. Laden Sie dann den Online-Spektrenbetrachter und sehen Sie sich die Anregungs- und Emissionsspektren von 7-Amino-4-Methylcoumarin und FlASH gleichzeitig an.AMC ist der FRET Spender und FlASH der FRET-Akzeptor. Bereiten Sie Zellen mit dem FRET-Spenderprotein vor, indem Sie das begleitende Textprotokoll mitverfolgen. Reinigen Sie dann den COL1-Sortase-RBX1-Komplex, indem Sie zunächst 50 Milliliter Lysepuffer zu einem Pellet von E.Coli-Zellen hinzufügen, das den COL1-Sortase-RBX1-Komplex exient.Eis die Zellen auf Eis mit Beschallung bei 50%Amplitude. Wechseln Sie die Stromversorgung für drei Minuten, so dass es eine Sekunde auf, und dann eine Sekunde aus, um eine Überhitzung der Probe zu verhindern. Übertragen Sie das resultierende Zelllysat in ein 50 Milliliter Zentrifugationsrohr und entfernen Sie den Zellabfall durch Zentrifugation bei 25.000 mal g für 45 Minuten.Dann fügen Sie den Überstand zu fünf Milliliter Glutathionperlen hinzu und bebrüten sie bei vier Grad Celsius, um das Zelllysat zu löschen. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Perlenlysatmischung bei 1, 500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Überstand.Als nächstes waschen Sie die Perlen mit 5 Milliliter Lysepuffer ohne Protease-Hemmer. Nach dem Zentrifugieren der Lösung den Überstand entfernen. Fügen Sie nun drei Milliliter Lysepuffer in die gewaschenen Perlen und übertragen Sie die Perlenschlämme in eine leere Säule.Fügen Sie der neuen Spalte auch fünf Milliliter Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie die Spalte dann für 10 Minuten und sammeln Sie das Eluat. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter Thrombin bei fünf Milligramm pro Milliliter aus den Glutathionperlen zum Eluat hinzu. Nach einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius verdünnen Sie die Proteinprobe dreifach mit Puffer A.Laden Sie die Proteinprobe in einen Puffer Eine gleichimdigerische kationische Austauschchromatographie-Spalte bei null Punkt fünf Milliliter pro Minute.Fügen Sie dann einen Gradienten von Null zu 50 % des Puffers B in Puffer A hinzu, um das Protein mit einer Durchflussrate von 1 Milliliter pro Minute zu löschen. Als nächstes die Eluatfraktionen, die das FRET-Spenderprotein enthalten, zu bündeln und auf zwei Punkt-Fünfmilliliter mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem 30-Kilodalton-Cutoff zu konzentrieren. Fügen Sie nun 7-Amino-4-Methylcoumarin in den c-terminus von COL1 durch sortase vermittelte Transpeptidation hinzu, indem Sie zuerst den Puffer in der FRET-Spenderproteinprobe mithilfe einer Entsalzungssäule in den Sortase-Puffer ändern.Um dies zu erreichen, gleichen Sie zunächst eine Entsalzungsspalte mit 25 Millilitern Saähnenpuffer aus. Dann zwei Punkt fünf Milliliter der FRET-Spenderproteinlösung in die Säule laden und den Durchfluss entsorgen. Als nächstes, elute die Probe mit drei Punkt fünf Milliliter Sortase Puffer und sammeln den Fluss durch.In 900 Mikroliter des Eluats, fügen Sie 100 Mikroliter 600 Mikromolar gereinigte Sortase A Lösung und 10 Mikroliter eines 25 Millimolar GGGG-AMC Peptid. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 30 Grad Celsius im Dunkeln über Nacht, um COL1-AMC-RBX1 zu erzeugen. Laden Sie nun die gesamte Probe auf die Spalte "Größenausschlusschromatographie" und legen Sie sie mit einem Punkt fünfmal dem Spaltenvolumen des Puffers zu.Am Ende die Eluatfraktionen, die COL1-AMC-RBX1 enthalten, bündeln. Folgen Sie dem Textprotokoll, um das FRET-Akzeptorprotein vorzubereiten. Viele der Schritte ähneln der FRET-Spenderproteinzubereitung.Nach der Fertigstellung bereiten Sie die FlASH CAND1-Lösung vor. Fügen Sie zunächst einen Mikroliter der FlASH-Lösung zu 50 Mikrolitern der frisch zubereiteten Tetracys-CAND1-Lösung hinzu. Mischen Sie die kombinierten Lösungen gut und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur im Dunkeln für ein bis zwei Stunden, um die FlASH CAND1 Lösung zu bilden.In 300 Mikroliter FRET-Puffer, fügen Sie COL1-AMC-RBX1 zu einer Endkonzentration von 70 Nanomolar und übertragen Sie die Lösung in eine Küvette. Legen Sie die Küvette in den Probenhalter eines Fluorimeters. Reizen Sie die Probe mit 350 Nanometer Anregungslicht und scannen Sie die Emissionssignale von 400 bis 600 Nanometern in einem Nanometer-Schritten.Dann, in 300 Mikroliter FRET Puffer, fügen Sie sowohl COL1-AMC-RBX1 und FlASH-CAND1 zu einer endgültigen Konzentration von 70 Nanomolar. Reizen Sie die Probe mit 350 Nanometer Anregungslicht und scannen Sie die Emissionssignale von 400-600 Nanometern in einem Nanometer-Schritten. Stellen Sie das Anregungslicht auf 350 Nanometer ein und verwenden Sie einen Bandpassfilter, der 450 Nanometer Emissionslicht passieren lässt und 500 bis 650 Nanometer Emissionslicht blockiert.Verbinden Sie mit den Probenventilen an der Füllposition eine mit Wasser gefüllte Drei-Milliliter-Spritze. Dann waschen Sie die beiden Probenspritzen mit Wasser, indem Sie die Probenspritze mehrmals nach oben und unten bewegen und das Wasser nach Fertigstellung entsorgen. Schließen Sie als Nächstes eine mit FRET-Puffer gefüllte Drei-Milliliter-Spritze an.Waschen Sie die beiden Probenspritzen mit dem FRET-Puffer, indem Sie den Probenspritzenantrieb mehrmals nach oben und unten bewegen und das Wasser nach Fertigstellung entsorgen. Schließen Sie nun eine Drei-Milliliter-Spritze an und laden Sie die erste Probenspritze, Spritze A, mit 100 Nanomolar COL1-AMC-RBX1 in den FRET-Puffer. Dann drehen Sie das Probenventil in die Antriebsposition Auch eine Drei-Milliliter-Spritze an Spritze B anschließen und Spritze B mit 100 Nanomolar flASH CAND1 in den FRET-Puffer laden und das Ventil in die Antriebsposition drehen.Öffnen Sie das in der Software unter Acquire befindliche Bedienfeld und zeichnen Sie die Emission von COL1-AMC im Laufe von 60 Sekunden auf. Dann machen Sie einen einzigen Schuss. Passen Sie die Abnahme und die fluoreszierenden Signale, die im Laufe der Zeit von jedem Schuss auf eine einzelne exponentielle Kurve gemessen werden.Waschen Sie das System wie bisher gezeigt und fügen Sie dann eine Lösung von 100 Nanomolar COL1-AMC-RBX1 und 100 Nanomolar FlASH CAND1 im FRET-Puffer in die Spritze A.Connect it to the system, while it is in the fill position Load syringe A and then turn the sample valve to the drive position. Als nächstes laden Sie eine Lösung von Skp1-Skp2 in die Spritze B.Connect it to the system while it is in the fill position. Tragen Sie Spritze B und drehen Sie die Probe dann in die Antriebsposition.Gehen Sie in der Software, um das Bedienfeld zu erwerben und zu öffnen. Richten Sie das Programm ein, um die Emission von COL1-AMC über 30 Sekunden aufzuzeichnen. Dann machen Sie einen einzigen Schuss.Die Fluoreszenzsignale nehmen im Laufe der Zeit zu, nachdem Mischlösungen aus Spritze A und Spritze B. nach dem Mischen von Lösungen aus Spritze A und Spritze B. zugenommen haben. Als jeweils 70 Nanomolar von COL1-AMC und FlASH CAND1 gemischt wurden, um FRET zu erzeugen, waren zwei Emissionsspitzen in den Emissionsspektren vorhanden. Und der Gipfel von COL1-AMC wurde niedriger, und der Gipfel von FlASH CAND1 wurde höher. Wenn die volle Länge CAND1 für FRET verwendet wurde, zeigte der Spender-Peak eine 10%ige Verringerung der Intensität.Als jedoch CAND1 mit seiner ersten Helix abgeschnitten verwendet wurde, wurde die Reduktion der Spenderspitzenintensität auf 30% erhöht, was auf eine höhere FRET-Effizienz hindeutet, um zu bestätigen, dass die Signaländerungen durch FRET zwischen COL1-AMC und FlASH CAND1 resultierten, wurde der Spender FRET mit überschüssigem, nicht gekennzeichnetem CAND1 gemischt, der als Chase im Akzeptor bekannt ist. In der Folge wurde der Spendergipfel vollständig wiederhergestellt und der Akzeptanz-Peak verringert. Hier ist ein Diagramm des durchschnittlichen beobachteten K-Wertes mit der CAND1-Konzentration nach linearer Regressionsanalyse dargestellt.Zur Messung der Onkonstante des Komplexes wurde 50 Nanomolar COL1-AMC in einer Reihe von beobachteten Dissoziationsratenkonstanten gemessen, die durch Mischen von 50 Nanomolar COL1-AMC mit zunehmenden Konzentrationen von FlASH CAND1 gemessen wurden. Ähnlich wie bei der Messung der On-Konstante wurde die beobachtete Dissoziationskonstante von COL1 und CAND1 durch die Überwachung der Wiederherstellung des Spendersignals im Laufe der Zeit auf dem gestoppten Durchfluss-Fluorometer gefunden. Hier stieg das Spendersignal schnell an und es ergab einen beobachteten K-Wert von null Punkt vier pro Sekunde.Im Gegensatz dazu wurde beim Puffer zu dem vormontierten Komplex keine Signalerhöhung beobachtet, die darauf hindeutet, dass die schnelle Dissoziation von COL1 CAND1 durch Skp1 Skp2 ausgelöst wurde. Stellen Sie sicher, dass die Lichtmenge, der spender- und Akzeptorproteine ausgesetzt sind, minimiert wird. Versuchen Sie, Fluorophore so weit wie möglich im Dunkeln zu halten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Überwachung der Protein-RNA-Interaktionsdynamik in vivo mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...