Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

אנו מודים שן שו-Ou (המכון הטכנולוגי של קליפורניה) לדיון תובנה על התפתחות וזמינותו סריג. מ. ג, Y.Z. ו- X.L. במימון קרנות הפעלה מאוניברסיטת Purdue כדי Y.Z., X.L.This עבודה נתמך בחלקו על ידי מענק זרע מן המרכז של אוניברסיטת Purdue עבור ביולוגית הצמח.

1. עיצוב וזמינותו סריג.
<ol><li>הורד את הקובץ מבנה של Cul1•Cand1 מורכבות מ בנק מידע החלבונים (קובץ 1U6G).</li>
	<li>הציגו את המבנה של Cul1•Cand1 מתחם PyMOL.</li>
	<li>השתמש בפונקציה מדידה תחת התפריט אשף של PyMOL כדי להעריך את המרחק בין החומצה אמינית הראשון של Cand1 חומצת אמינו האחרונה ביותר של Cul1 (<strong cla...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li><li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+probing+disease+mechanisms+using+model+systems.">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).</li><li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cellular+protein-protein+interactions:+Technological+strategies+and+opportunities.">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li><li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple,+direct,+and+quantitative+in+vitro+binding+assays.">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).</li><li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+kinetic+studies+of+biological+interactions:+A+review.">Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).</li><li>Pierce, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1+promotes+assembly+of+new+SCF+complexes+through+dynamic+exchange+of+F+box+proteins.">Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins.</a> Cell. 153 (1), 206-215 (2013).</li><li>Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1-Mediated+Adaptive+Exchange+Mechanism+Enables+Variation+in+F-Box+Protein+Expression.">Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression.</a> Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).</li><li>Zheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cul1-Rbx1-Skp1-F+boxSkp2+SCF+ubiquitin+ligase+complex.">Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex.</a> Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).</li><li>Kleiger, G., Deshaies, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag+Team+Ubiquitin+Ligases.">Tag Team Ubiquitin Ligases.</a> Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1+binds+to+unneddylated+CUL1+and+regulates+the+formation+of+SCF+ubiquitin+E3+ligase+complex.">CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex.</a> Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).</li><li>Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+unneddylated+cullin+1+and+regulates+its+neddylation.">TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation.</a> FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).</li><li>Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+cullins+and+modulates+ubiquitin+ligase+activity.">TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).</li><li>Goldenberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cand1-Cul1-Roc1+complex+reveals+regulatory+mechanisms+for+the+assembly+of+the+multisubunit+cullin-dependent+ubiquitin+ligases.">Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases.</a> Cell. 119 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ETA2,+an+apparent+ortholog+of+the+human+cullin-interacting+protein+CAND1,+is+required+for+auxin+responses+mediated+by+the+SCF(TIR1)+ubiquitin+ligase.">Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase.</a> Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CAND1,+an+Unmodified+CUL1-Interacting+Protein,+Is+Involved+in+Multiple+Developmental+Pathways+Controlled+by+Ubiquitin/Proteasome-Mediated+Protein+Degradation.">Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation.</a> the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).</li><li>Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtCAND1,+a+HEAT-repeat+protein+that+participates+in+auxin+signaling+in+Arabidopsis.">AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).</li><li>Lo, S. -. C., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1-Mediated+Substrate+Adaptor+Recycling+Is+Required+for+Efficient+Repression+of+Nrf2+by+Keap1.">CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).</li><li>Okamoto, K., Sako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+FRET+for+the+study+of+protein+interactions+and+dynamics.">Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).</li><li>Hussain, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET).">An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET).</a> arXiv preprint. , (2009).</li><li>Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+and+purification+of+recombinant+SCF+ubiquitin+ligases.">High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases.</a> Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).</li><li>Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortagging:+A+versatile+method+for+protein+labeling.">Sortagging: A versatile method for protein labeling.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).</li><li>Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Protein+Labeling+via+Sortase-Mediated+Transpeptidation.">Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-PAGE+of+Proteins.">SDS-PAGE of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+E2-E3+Assembly+and+Disassembly+Enable+Processive+Ubiquitylation+of+Cullin-RING+Ubiquitin+Ligase+Substrates.">Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates.</a> Cell. 139 (5), 957-968 (2009).</li><li>Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Stopped-flow+Kinetics+Methods+to+Investigate+the+Mechanism+of+Action+of+a+DNA+Repair+Protein.">Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).</li><li>Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Stopped-Flow+Fluorescence+and+Labeled+Nucleotides+to+Analyze+the+ATP+Turnover+Cycle+of+Kinesins.">Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs.">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Lin, C. T., Rorabacher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+approach+for+stopped-flow+kinetics+of+fast+second-order+reactions+involving+inhomogeneity+in+the+reaction+cell.">Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell.</a> Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).</li><li>Toseland, C. P., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Reaction+Kinetic+Techniques.">Rapid Reaction Kinetic Techniques.</a> Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Lin, C. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase-catalyzed+site-specific+conjugation+of+small-molecule+probes+to+proteins+in+vitro+and+on+the+surface+of+living+cells.">Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+short+peptide+tag+for+versatile+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).</li><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+Basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+GTPase+movement+on+an+RNA+scaffold+drives+co-translational+protein+targeting.">Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting.</a> Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).</li></ol>

סריג הוא תופעה פיזיקלית זה עניין רב בלימוד והבנה של מערכות ביולוגיות19. כאן, אנו מציגים עבור בדיקה ושימוש סריג ללמוד את איגוד קינטיקה של שני חלבונים שמעצבת פרוטוקול. בעת עיצוב סריג, שקלנו שלושה גורמים עיקריים: ספקטרלי החפיפה בין התורם פליטה, מקבל עירור, המרחק בין את fluorophores שני, ?...

פעילויות ביולוגיות בסופו של דבר תבוצענה על ידי חלבונים, ביותר אשר אינטראקציה עם אחרים עבור תפקודים ביולוגיים נאותה. שימוש בגישה חישובית, הסכום הכולל של אינטראקציות חלבון-אנוש מוערך ~ 650,0001, שיבוש אינטראקציות אלה לעיתים קרובות מוביל מחלות2. עקב תפקידיהם חיוני בשליטה הסלולר תהליכים organismal, פותחו שיטות רבות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון, כגון שמרים-שני-היברידית, קומפלמנטציה פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית, פיצול-לוציפראז קומפלמנטציה ו- co-immunoprecipitation assay3. בעוד ששיטות אלה טובים גילוי ולאשר אינטראקציות חלבון-חלבון, הם בדרך כלל שאינם כמותיים, ובכך לספק מידע מוגבל לגבי הזיקה בין בני הזוג חלבון אינטראקציה. השפעה כמותית-דאונס יכול לשמש כדי למדוד את זיקה מחייבת (למשל, קבוע דיסוציאציה Kd), אבל זה לא למדוד את קינטיקה של האיגוד, ולא ניתן להחיל אותה כאשר Kd נמוכה מאוד עקב לקוי יחס אות לרעש4. פלזמון משטח תהודה (SPR) ספקטרוסקופיה מכמת את קינטיקה מחייב, אך זה דורש על משטח ספציפי בטקטיקות של מגיבים אחד על פני השטח, אשר פוטנציאל תוכל לשנות את המאפיין איגוד של מגיב5. יתר על כן, קשה למדוד דיסוציאציה המחירים5וארגון מהר SPR, וזה לא ראוי לעשות שימוש SPR לאפיין את האירוע של החלפת החלבוניות בתוך קומפלקס החלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת מדידת שיעור של חלבונים מורכבים הרכבה ופירוק בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה. שיטה זו היתה חיונית לצורך קביעת התפקיד של Cullin - ssociated -Nedd8 -dissociated חלבון 1 (Cand1)כמו F-box חלבון exchange גורם6,7.
Cand1 מסדיר את הדינמיקה של Skp1•Cul1•F-תיבת חלבון (SCF) E3 ligases, אשר שייכת למשפחה גדולה של Cullin-טבעת אוביקוויטין ligases. SCFs מורכב cullin Cul1, אשר נקשר החלבון תחום טבעת Rbx1, ולא של חלבון F-box להחלפה, אשר מגייס סובסטרטים ומאגד Cul1 דרך החלבון מתאם Skp18. E3 ליגאז, SCF מזרז את ההטיה של אוביקוויטין את המצע שלה, וגם זה מופעל כאשר המצע הוא גויס על ידי החלבון F-box, וכאשר Cul1 משתנה על ידי החלבון אוביקוויטין דמוי Nedd89. Cand1 נקשר Cul1 שלא שונתה, על הכריכה, זה משבש גם איגוד חלבון Skp1•F-box עם Cul1 וגם את ההטיה של Nedd8 Cul110,11,12,13. כתוצאה מכך, Cand1 שנראה מעכב פעילות SCF במבחנה, אבל חוסר Cand1 אורגניזמים גרם פגמים שמרמז תפקיד חיובי של Cand1 בוויסות פעילות SCF vivo14,15,16 , 17. פרדוקס זה הוסבר בסופו של דבר על ידי מחקר כמותי שגילה את האינטראקציות דינמי בין חלבון Cul1, Cand1 ו Skp1•F-box. באמצעות קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה (סריג) מבחני המאתרות את היווצרות מתחמי SCF ו- Cul1•Cand1, שיוך של דיסוציאציה לדרג קבועים (k- ו kחופש, בהתאמה) היו נמדד בנפרד. המדידות חשפו כי הן Cand1 והן Skp1•F-תיבת חלבון טופס הדוק ביותר מתחם עם Cul1, אבל את kהנחה של SCF מתגברת באופן דרמטי על ידי Cand1, kהנחה של Cul1•Cand1 הוא גדלו דרמטית. על ידי Skp1•F-תיבת חלבון6,7. תוצאות אלה מספקים את התמיכה הראשונית וקריטיים להגדרת תפקידו של Cand1 כגורם exchange חלבון, אשר מזרז היווצרות של מתחמי SCF חדש באמצעות מיחזור Cul1 מ מתחמי SCF הישן.
כאן, אנו מציגים את ההליך של פיתוח ושימוש וזמינותו סריג ללמוד את הדינמיקה של מורכבות Cul1•Cand17, ניתן להחיל את אותו עיקרון ללמוד את הדינמיקה של מולקולות שונות. סריג מתרחשת כאשר תורם הוא מתרגש עם הגל המתאים, מקבל עם ספקטרום עירור חפיפה ספקטרום הפליטה תורם קיים למרחק של 10-100 Å. המדינה נרגשת מועבר מקבל, ובכך להקטין את עוצמת התורם, הגדלת עוצמת מקבל18. היעילות של קשת/קשתית (E) תלוי רדיוס פורסטר (R0) והן את המרחק בין התורם ואת מקבל fluorophores (r), מוגדר על-ידי: E = R06/ (R0 6 + r6). רדיוס פורסטר (R0) תלויה במספר גורמים, כולל כיוון זוויתי דיפול, החפיפה ספקטרלי של הזוג מקבל התורם, והפתרון היה19. למרוח וזמינותו סריג fluorimeter עצר-flow, אשר מפקח על השינוי של הפליטה תורם בזמן אמת ומאפשר מדידות של מהיר k- ו kאת, זה הכרחי ליצור סריג יעיל זה תוצאות לירידה משמעותית של פליטת התורם. לכן, עיצוב סריג יעיל על-ידי בחירת הזוג המתאים של צבעי פלורסנט, ואתרים על החלבונים היעד כדי לצרף את צבע חשוב, יידונו ב פרוטוקול זה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

חלבונים הן חברות הסלולר העיקרי של מערכות ביולוגיות, הם בדרך כלל לקיים אינטראקציה עם אחרים מאקרו או מולקולות קטנות כדי לבצע תפקודים ביולוגיים שלהם. אינטראקציות כזה יכול להיות מאוד דינמיים, כלומר subunits שמעצבת כל הזמן משויך, חלופה מועדפת בשיעורים מסוימים. בעוד מדידה של זיקה מחייבת שימוש בטכניקות כגון הנפתח כמותיים חושף את עוצמת האינטראקציה, לומד את קינטיקה איגוד מספק תובנות על איך מהר האינטראקציה מתרחשת, כמה זמן כל מתחם יכולה להתקיים. יתר על כן, מדידה של קינטיקה של אינטראקציה בנוכחות גורם נוסף, כגון פקטור המרת חלבון או סם, מסייע לחשוף את המנגנון שבאמצעותו האינטראקציה מוסדר על ידי הגורם השני, מתן ידע חשוב עבור קידום מחקר ביולוגי ורפואי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול למדידת קינטיקה של איגוד של קומפלקס החלבונים יש שיעור גבוה האגודה מהותי, יכול להיות חלופה מועדפת במהירות על ידי חלבון אחר. השיטה משתמשת העברת אנרגיה של קרינה פלואורסצנטית תהודה לדווח היווצרות של המתחם חלבון במבחנה, והוא מאפשר ניטור של דיסוציאציה של המתחם בזמן אמת על fluorimeter זרימה הפסיק וארגון מהר. שימוש assay הזה, הם לכמת את קבועי קצב דיסוציאציה וארגון של החלבונים.

כדי לבדוק את סריג בין Cul1AMC , פלאשCand1, קבענו לראשונה את עוצמת הפליטה של 70 nM Cul1AMC (התורם) ו- 70 nM Cand1 פלאש(מקבל), בהתאמה (איור 3 אקווים-C, כחול). כל ניתוח, רק פסגה אחת פליטה היה נוכח, ולא את פליטת Cand1 פלאש(מקבל) היה נמוך. כאשר 70 nM כל ?...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

אינטראקציות חלבון-חלבון קריטי עבור מערכות ביולוגיות, מחקרים של קינטיקה איגוד לספק תובנות הדינמיקה והתפקוד של מתחמי חלבון. אנו מתארים שיטה מכמת את הפרמטרים קינטי של חלבון מורכב באמצעות קרינה פלואורסצנטית והעברת אנרגיה תהודה הטכניקה זרימה עצר.

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

השיטה שלנו מסייעת ללמוד את הקינטיקה של היווצרות מורכבת חלבון. הוא מתאר עד כמה הדוק קומפלקס חלבון, ואם היווצרות חלבון מורכב הוא התערב על ידי חלבונים אחרים. טכניקה זו מאפשרת ללמוד אינטראקציה חלבון-חלבון באופן כמותי באמצעות פלואורסצנטיות ככתב, המבחן שלנו יכול לפקח על הקשר והניתוק של קומפלקס חלבון בזמן אמת.כדי להתחיל, תכנן את המדגימה FRET החל מהנתונים עבור קומפלקס COL1 CAND1 ממסד הנתונים של החלבון. טען את המבנה ב- PyMOL ולאחר מכן עבור לתפריט האשף ולהשתמש בפונקציית המדידה כדי להעריך את המרחק בין חומצת האמינו הראשונה של CAND1 לבין חומצת האמינו האחרונה של COL1. לאחר מכן, לטעון את הצופה ספקטרה באינטרנט ולהציג את ספקטרום העירור והפיכה של 7-אמינו-4-מתילקומארין ו FlASH בו זמנית.AMC הוא תורם FRET ו FlASH הוא מקבל FRET. הכן תאים עם חלבון התורם FRET על ידי ביצוע יחד בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, לטהר את קומפלקס COL1 sortase RBX1 על ידי הוספת תחילה 50 מיליליטר של מאגר תיזה לכדור של תאי E.Coli המבטאים את קומפלקס RBX1 RBX1 קולי.קרח התאים על קרח עם sonication ב 50% משרעת. החלף את הכוח למשך שלוש דקות כך שהוא יעבור שנייה אחת ולאחר מכן שניה אחת כדי למנוע התחממות יתר של הדגימה. העבר את התא שנוצר lysate לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ולהסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 25, 000 פעמים g במשך 45 דקות.לאחר מכן, מוסיפים את העל-טבעי לחמישה מיליליטר של חרוזי גלוטתיון ומדגירים אותם בארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות את התא. לאחר הדגירה, צנטריפוגה תערובת ליאזט חרוז ב 1, 500 פעמים גרם במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את העל-טבעי.לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם 5 מיליליטר של חיץ תיזה ללא מעכב פרוטאז. לאחר צנטריפוגה הפתרון, להסיר את העל טבעי. עכשיו, להוסיף שלושה מיליליטר של חיץ תזה לתוך חרוזים שטופים ולהעביר את תרחיף חרוזים לתוך עמוד ריק.לעמודה החדשה, הוסף גם חמישה מיליליטר של מאגר אלוטיון ולאחר מכן הדגירה את העמודה במשך 10 דקות ולאסוף את eluate. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של טרומבין בחמישה מיליגרם למיליליטר לאלוטה חרוזי הגלוטתיון. לאחר דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס לדלל את דגימת החלבון שלוש פעמים עם חיץ A.Load דגימת החלבון למאגר עמוד כרומטוגרפיה חילופים cationic מנוון בנקודת אפס חמישה מיליליטר לדקה.לאחר מכן, הוסיפו שיפוע של אפס עד 50% של מאגר B במאגר A כדי לחמק מהחלבון עם קצב זרימה של מיליליטר לדקה. לאחר מכן, בריכת שברי eluate המכילים את החלבון תורם FRET ולרכז אותו עד שתי נקודות חמישה מיליליטר באמצעות קרום אולטרה סינון עם ניתוק 30 קילודלטון. עכשיו, להוסיף 7-אמינו-4-מתילקומארין c-terminus של COL1 באמצעות טרנספפטידה מתווית sortase על ידי שינוי הראשון את המאגר בדגימה חלבון תורם FRET לתוך מאגר sortase באמצעות עמודת התפלה.כדי להשיג זאת, תחילה לצייד עמודת התפלה עם 25 מיליליטר של מאגר sortase. לאחר מכן, לטעון שתי נקודות חמש מיליליטר של פתרון חלבון תורם FRET לתוך העמודה ולהשליך את הזרימה דרך. לאחר מכן, לחמק המדגם עם שלוש נקודות חמש מיליליטר של חיץ sortase ולאסוף את הזרימה דרך.ב 900 microliters של eluate, להוסיף 100 microliters של 600 micromolar מטוהרים sortase פתרון ו 10 microliters של פפטיד GGGG-AMC 25 מילימולר. הדגירה את תערובת התגובה ב 30 מעלות צלזיוס בחושך לילה כדי ליצור COL1-AMC-RBX1. עכשיו, לטעון את כל המדגם על העמודה כרומטוגרפיה אי הכללת גודל ולחמק ממנו עם נקודה אחת חמש פעמים את נפח העמודה של המאגר.בסופו של דבר, אסוף את שברי ה- ELUATE המכילים COL1-AMC-RBX1. בצע יחד בפרוטוקול הטקסט כדי להכין את חלבון מקבל FRET. רבים מהצעדים דומים להכנת החלבון התורם FRET.לאחר סיום, להכין את פתרון FLASH CAND1. ראשית, הוסיפו מיקרוליטר אחד של פתרון FlASH ל-50 מיקרוליטרים של פתרון הטטרה-ציסטה-CAND1 שהוכן טרי. מערבבים היטב את הפתרונות המשולבים ומדרגים את התערובת בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעה עד שעתיים כדי ליצור את פתרון FlASH CAND1.ב 300 microliters של מאגר FRET, להוסיף COL1-AMC-RBX1 לריכוז סופי של 70 nanomolar ולהעביר את הפתרון לתוך קובט. מניחים את ה cuvette במחזיק מדגם של פלואורימטר. לרגש את המדגם עם 350 ננומטר אור העירור ולסרוק את אותות הפליטה מ 400 כדי 600 ננומטר במרווחים ננומטר אחד.לאחר מכן, ב 300 microliters של חיץ FRET, להוסיף הן COL1-AMC-RBX1 ו FlASH-CAND1 לריכוז סופי של 70 ננומולרים. לרגש את המדגם עם 350 ננומטר אור העירור ולסרוק את אותות הפליטה מ 400-600 ננומטר במרווחים ננומטר אחד. הגדר את אור העירור על 350 ננומטר ולהשתמש מסנן לעבור הלהקה המאפשר 450 ננומטר פליטת אור לעבור וחוסם 500 כדי 650 ננומטר פליטת אור.עם שסתומי הדגימה בעמדת המילוי לחבר מזרק שלושה מיליליטר מלא במים. לאחר מכן, לשטוף את שני מזרקים מדגם עם מים על ידי הזזת כונן מזרק מדגם למעלה ולמטה מספר פעמים, השלכת המים כאשר סיים. לאחר מכן, חבר מזרק של שלושה מיליליטר מלא במאגר FRET.לשטוף את שני מזרקים מדגם עם מאגר FRET על ידי הזזת כונן מזרק מדגם למעלה ולמטה מספר פעמים, השלכת המים כאשר סיים. עכשיו, לחבר מזרק שלושה מיליליטר ולטעון את המזרק מדגם הראשון, מזרק A, עם 100 ננומולאר COL1-AMC-RBX1 במאגר FRET. לאחר מכן להפוך את שסתום המדגם למצב הכונן גם, לחבר מזרק שלושה מיליליטר מזרק B לטעון מזרק B עם 100 nanomolar של FlASH CAND1 במאגר FRET ולהפוך את השסתום שלה למיקום הכונן.פתח את לוח הבקרה תחת לרכוש בתוכנה ולהקליט את הפליטה של COL1-AMC במהלך 60 שניות. ואז, לקחת ירייה אחת. התאם את הירידה ואת אותות הפלואורסצנט שנמדדו לאורך זמן מכל ירייה לעקומה מעריכית אחת.לשטוף את המערכת כפי שהוצג קודם לכן ולאחר מכן להוסיף פתרון של 100 ננומולרים COL1-AMC-RBX1 ו 100 ננומולאר FlASH CAND1 במאגר FRET לתוך מזרק A.Connect אותו למערכת בזמן שהוא במצב מילוי טען מזרק A ולאחר מכן להפוך את שסתום המדגם למיקום הכונן. לאחר מכן, לטעון פתרון של Skp1-Skp2 לתוך מזרק B.Connect אותו למערכת בזמן שהוא בעמדת מילוי. טען מזרק B ולאחר מכן הפוך את הדגימה למיקום הכונן.בתוכנה, עבור כדי לרכוש ולפתוח את לוח הבקרה. הגדר את התוכנית כדי להקליט את הפליטה של COL1-AMC מעל 30 שניות. אז קח ירייה אחת.אותות הפלואורסצנטיות גדלים עם הזמן לאחר ערבוב פתרונות ממזרק A ומזרק B.When 70 ננומולר כל אחד COL1-AMC ו FlASH CAND1 היו מעורבים כדי ליצור FRET, שתי פסגות פליטה היו נוכחים ספקטרום הפליטה. והפסגה של COL1-AMC הפכה נמוכה יותר, ואת השיא של FlASH CAND1 הפך גבוה יותר. כאשר נעשה שימוש ב- CAND1 באורך מלא עבור FRET, שיא התורם הראה ירידה של 10% בעוצמתו.עם זאת, כאשר CAND1 עם הסליל הראשון שלה נחתך שימש הפחתת עוצמת שיא התורם הוגדלה ל 30% מציע יעילות FRET גבוהה יותר כדי לאשר כי שינויי האות נבעו FRET בין COL1-AMC ו FlASH CAND1, FRET התורם היה מעורבב עם עודף CAND1 ללא פעמונים המכונה צ'ייס במקבל. כתוצאה מכך, שיא התורמים שוחזר במלואו ושיא המקבלים ירד. מוצג כאן הוא עלילה של ערך K שנצפה הממוצע עם ריכוז CAND1 בעקבות ניתוח רגרסיה ליניארית.כדי למדוד את הקבוע על המתחם, 50 ננומולרים COL1-AMC שימש בסדרה של קבועים שיעור דיסוציאציה שנצפו נמדדו על ידי ערבוב 50 ננומולרים COL1-AMC עם ריכוזים הולכים וגדלים של FlASH CAND1. בדומה למדידת הקבוע, קבוע הדיסוציאציה שנצפה של COL1 ו- CAND1 נמצא על ידי ניטור שחזור אות התורם לאורך זמן על פלואורומטר הזרימה שנעצר. כאן אות התורם גדל במהירות והוא חשף ערך K שנצפה של נקודת אפס ארבע לשנייה.לעומת זאת, כאשר המאגר נוסף למתחם שהורכב מראש, לא נצפתה עליית אות המצביעה על דיסוציאציה מהירה של COL1 CAND1 הופעלה על ידי Skp1 Skp2. הקפד למזער את כמות האור החלבונים התורם והמקבל נחשפים. נסה לשמור פלואורופורים בחושך ככל האפשר.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

ניצול שיפור פלואורסצנטיות הנגרמת על-ידי חלבון בזמן כדי לזהות קונפורמציות מקומיות יציבות אחת α-Synuclein Monomer בכל פעם

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...