Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Ringraziamo Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) per penetranti discussione sullo sviluppo del dosaggio FRET. M.G., Y.Z. e X.L. sono stati finanziati dai fondi di avvio dalla Purdue University a Y.Z. e X.L.This lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di seme da Purdue University Center per biologia vegetale.

1. progettazione del dosaggio FRET.
<ol><li>Scaricare il file di struttura dei Cul1•Cand1 complessi da Protein Data Bank (file 1U6G).</li>
	<li>Visualizzare la struttura della Cul1•Cand1 complesso in PyMOL.</li>
	<li>Utilizzare la funzione di misurazione nel menu di creazione guidata di PyMOL per stimare la distanza tra il primo amminoacido di Cand1 e l'ultimo amminoacido di Cul1 (Figura 1).</li>
	<li>Il visualizzatore online spettri di carico (Vedi <s...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li><li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+probing+disease+mechanisms+using+model+systems.">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).</li><li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cellular+protein-protein+interactions:+Technological+strategies+and+opportunities.">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li><li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple,+direct,+and+quantitative+in+vitro+binding+assays.">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).</li><li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Reaction+Kinetic+Techniques.">Rapid Reaction Kinetic Techniques.</a> Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Lin, C. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase-catalyzed+site-specific+conjugation+of+small-molecule+probes+to+proteins+in+vitro+and+on+the+surface+of+living+cells.">Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+short+peptide+tag+for+versatile+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).</li><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+Basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+GTPase+movement+on+an+RNA+scaffold+drives+co-translational+protein+targeting.">Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting.</a> Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).</li></ol>

FRET è un fenomeno fisico che è di grande interesse per lo studio e la comprensione di sistemi biologici19. Qui, presentiamo un protocollo per il testing e usando FRET per studiare la cinetica di legame di due proteine interagenti. Quando si progetta FRET, abbiamo considerato tre fattori principali: la sovrapposizione spettrale tra donatore di emissione e accettore di eccitazione, la distanza tra i due fluorofori e l'orientamento del dipolo dei fluorofori28. Per scegliere...

Attività biologiche sono in ultima analisi, effettuate dalle proteine, più di cui interagire con gli altri per corrette funzioni biologiche. Utilizzando un approccio computazionale, l'importo totale delle interazioni proteina-proteina in essere umano è stimato essere ~ 650.0001e rottura di queste interazioni spesso conduce a malattie2. A causa del loro ruolo essenziale nel controllo dei processi cellulari e organismi, sono stati sviluppati numerosi metodi per lo studio delle interazioni proteina-proteina, quali lievito-due-ibrido, complementazione bimolecolare fluorescenza, Spalato-luciferasi 3analisi di complementazione e co-immunoprecipitazione. Mentre questi metodi sono bravi a scoprire e confermando le interazioni proteina-proteina, sono solitamente non quantitativi e così fornire informazioni limitate sull'affinità tra i partner di proteine interagenti. Quantitativi di pull-down può essere utilizzato per misurare l'affinità di legame (ad esempio, la costante di dissociazione Kd), ma non misura la cinetica dell'associazione, né può essere applicata quando il Kd è molto bassa a causa di un'inadeguata rapporto segnale-rumore4. Surface plasmon resonance (SPR) spettroscopia quantifica la cinetica di legame, ma richiede una superficie specifica e l'immobilizzazione di un reattivo sulla superficie, che potenzialmente può modificare la proprietà di associazione del reagente5. Inoltre, è difficile per SPR misurare veloce associazione e dissociazione tariffe5, e non è opportuno utilizzare SPR per caratterizzare l'evento di scambio delle unità secondarie della proteina in un complesso proteico. Qui, descriviamo un metodo che permette di misurare il tasso di proteine complesse montaggio e smontaggio in una scala di tempo di millisecondo. Questo metodo è essenziale per determinare il ruolo di Cullin -unesso -Nedd8 -dissociated della proteina 1 (Cand1) come il F-box protein cambio fattore6,7.
Cand1 regola la dinamica della ligasi E3 di Skp1•Cul1•F-casella proteina (SCF), che appartengono alla grande famiglia della ligasi di ubiquitin Cullin-anello. SCFs sono costituiti il cullin Cul1, che lega la proteina di dominio anello Rbx1, e una proteina F-box intercambiabile, che recluta substrati e lega Cul1 attraverso la proteina dell'adattatore Skp18. Come una E3 ligasi, SCF catalizza la coniugazione dell'ubiquitina al suo substrato ed è attivato quando il substrato è reclutato dalla proteina F-box, e quando Cul1 viene modificato dalla proteina ubiquitina-come Nedd89. Cand1 associa Cul1 non modificato e legandosi, disturba sia l'associazione di proteine Skp1•F-box con Cul1 e la coniugazione di Nedd8 a Cul110,11,12,13. Di conseguenza, Cand1 è sembrato essere un inibitore di attività SCF in vitro, ma Cand1 carenza negli organismi ha causato i difetti che suggerisce un ruolo positivo di Cand1 nel regolare l'attività SCF in vivo14,15,16 , 17. questo paradosso infine è stato spiegato da uno studio quantitativo che ha rivelato le interazioni dinamiche tra proteine Cul1, Cand1 e Skp1•F-box. Usando le fluorescenza risonanza energy transfer (FRET) analisi che rilevano la formazione dei complessi SCF e Cul1•Cand1, l'associazione e dissociazione rate costanti (ksu e koff, rispettivamente) sono stati misurato singolarmente. Le misurazioni hanno rivelato che sia Cand1 e Skp1•F-box forma estremamente stretta complesso proteico con Cul1, ma la kfuori di SCF è aumentata drammaticamente di Cand1 e la kfuori del Cul1•Cand1 è aumentato drammaticamente da Skp1•F-casella proteina6,7. Questi risultati forniscono il supporto iniziale e fondamentale per definire il ruolo di Cand1 come un fattore di scambio di proteina, che catalizza la formazione di nuovi complessi SCF attraverso il riciclo Cul1 dai vecchi complessi SCF.
Qui, presentiamo la procedura di sviluppare e utilizzare il tasto test per studiare la dinamica del complesso Cul1•Cand17, e lo stesso principio può essere applicato per lo studio della dinamica delle varie biomolecole. FRET si verifica quando un donatore è eccitato con la lunghezza d'onda appropriata, e un accettore con spettro di eccitazione sovrapposizione lo spettro di emissione del donatore è presente all'interno di una distanza di 10-100 Å. Lo stato eccitato viene trasferito al ricettore, quindi diminuendo l'intensità di donatore e aumentando l' intensità di accettore18. L'efficienza della FRET (E) dipende dalla funzione del raggio di Förster (R0) e la distanza tra il donatore e accettore fluorofori (r) ed è definito da: E = R06/ (R0 6 + r6). Il raggio di Förster (R0) dipende da alcuni fattori, tra cui l'orientamento angolare di dipolo, la sovrapposizione spettrale della coppia donatore-accettore e la soluzione usata19. Per applicare l'analisi FRET su un fluorimetro flusso interrotto, che rileva la variazione dell'emissione dei donatori in tempo reale e permette di eseguire misure di veloce ksu e kfuori, è necessario stabilire FRET efficiente che Risultati in una significativa riduzione dell'emissione di donatore. Di conseguenza, progettazione efficiente FRET scegliendo la coppia appropriata di coloranti fluorescenti e siti su proteine bersaglio per fissare i coloranti è importante e sarà discusso in questo protocollo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

Le proteine sono i principali operatori dei sistemi biologici, e di solito interagiscono con altri macro - o piccole molecole per svolgere le loro funzioni biologiche. Tali interazioni possono essere altamente dinamiche, significato le subunità interagenti sono costantemente associate e dissociate a determinate tariffe. Mentre l'affinità di legame utilizzando tecniche quali discesa quantitativa rivela la forza dell'interazione, studiare la cinetica di legame di misurazione fornisce intuizioni su come veloce si verifica l'interazione e per quanto tempo ogni complesso può esistere. Inoltre, la cinetica di un'interazione in presenza di un fattore supplementare, ad esempio un fattore di scambio di proteina o un farmaco, di misura aiuta a rivelare il meccanismo mediante il quale l'interazione è regolata da un altro fattore, fornendo conoscenze importanti per la avanzamento della ricerca biologica e medica. Qui, descriviamo un protocollo per la misurazione la cinetica di legame di un complesso proteico che ha un tasso di alta associazione intrinseco e possa essere dissociato rapidamente da un'altra proteina. Il metodo utilizza il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza per segnalare la formazione del complesso della proteina in vitro, e consente il monitoraggio veloce associazione e dissociazione del complesso in tempo reale su un fluorimetro flusso interrotto. Usando questa analisi, le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso proteico sono quantificate.

Per testare il FRET tra Cul1AMC e FlAsHCand1, abbiamo determinato in primo luogo l'intensità di emissione di 70 nM Cul1AMC (il donatore) e 70 nM Cand1 FlAsH(il ricettore), rispettivamente (Figura 3A-C, blu linee). In ogni analisi, solo un picco di emissione era presente e l'emissione di Cand1 FlAsH(il ricettore) era basso. Quando 70 nM ogni di Cul1AMC e Cand1 FlAsHs...

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Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Interazioni proteina-proteina sono critiche per sistemi biologici, e studi di cinetica di legame forniscono intuizioni la dinamica e la funzione dei complessi della proteina. Descriviamo un metodo che quantifica i parametri cinetici di una proteina complessa che utilizza il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza e la tecnica di flusso interrotto.

Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Il nostro metodo aiuta a studiare la cinetica di una formazione complessa proteica. Descrive quanto sia stretto un complesso proteico, e se la formazione del complesso proteico viene interferito da altre proteine. Questa tecnica consente di studiare l'interazione proteina-proteina in modo quantitativo usando la fluorescenza come reporter, il nostro saggio può monitorare l'associazione e la dissociazione di un complesso proteico in tempo reale.Per iniziare, progettare il test FRET a partire dai dati per il complesso COL1 CAND1 dal database proteico. Caricare la struttura in PyMOL, quindi passare al menu della procedura guidata e utilizzare la funzione di misurazione per stimare la distanza tra il primo amminoacido di CAND1 e l'ultimo amminoacido di COL1. Quindi, caricare lo spettatore di spettri online e visualizzare contemporaneamente gli spettri di eccitazione ed emissione di 7-ammino-4-metilcumarina e FlASH.AMC è il donatore FRET e FlASH è l'accettore FRET. Preparare le cellule con la proteina donatrice FRET seguendo il protocollo di testo di accompagnamento. Quindi, purificare il complesso COL1 sortase RBX1 aggiungendo prima 50 millilitri di tampone di lisi a un pellet di cellule E.Coli che esprimono il complesso COL1 sortase RBX1.Ghiaccio le cellule sul ghiaccio con sonicazione al 50% di ampiezza. Alternare l'alimentazione per tre minuti in modo che sia un secondo su, quindi un secondo di riposo per evitare il surriscaldamento del campione. Trasferire il lysate cellulare risultante in un tubo di centrifugazione da 50 millilitri e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 25.000 volte g per 45 minuti.Quindi, aggiungere il supernatante a cinque millilitri di perline di glutatione e incubarli a quattro gradi Celsius per cancellare il lisato cellulare. Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela di lisato di perline a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, rimuovere il supernatante.Quindi, lavare le perline con 5 millilitri di tampone di lysis senza inibitore della proteasi. Dopo aver centrifugato la soluzione, rimuovere il supernatante. Ora, aggiungere tre millilitri di tampone di lisi alle perline lavate e trasferire il liquame di perline in una colonna vuota.Alla nuova colonna, aggiungere anche cinque millilitri di tampone di eluizione, quindi incubare la colonna per 10 minuti e raccogliere l'eluito. Quindi, aggiungere 200 microlitri di trombina a cinque milligrammi per millilitro all'eluito dalle perline di glutatione. Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius diluire il campione proteico tre volte con tampone A.Caricare il campione proteico in un tampone Una colonna di cromatografia a scambio cationico equilibrato a zero punti cinque millilitri al minuto.Quindi, aggiungere un gradiente da zero al 50% del tampone B nel tampone A per elutare la proteina con una portata di 1 millilitro al minuto. Successivamente, mettere in comune le frazioni di eluito contenenti la proteina donatrice FRET e concentrarla fino a due punti cinque millilitri utilizzando una membrana di ultrafiltrazione con un cutoff di 30 kilodalton. Ora, aggiungere 7-ammino-4-metilcumarina al c-terminale di COL1 attraverso la transpeptidazione mediata sortase cambiando prima il buffer nel campione di proteina donatrice FRET nel tampone sortase usando una colonna di desalinizzazione.A tale scopo, equilibrare prima una colonna di desalinizzazione con 25 millilitri di buffer sortase. Quindi, caricare due millilitri punto cinque della soluzione proteica donatrice FRET nella colonna e scartare il flusso attraverso. Successivamente, elutare il campione con tre punti cinque millilitri di tampone sortase e raccogliere il flusso attraverso.In 900 microlitri dell'eluito aggiungere 100 microlitri di soluzione di sortase purificata micromolare E 10 microlitri di un peptide GGGG-AMC da 25 millimolare. Incubare la miscela di reazione a 30 gradi Celsius al buio durante la notte per generare COL1-AMC-RBX1. A questo punto, caricare tutto il campione nella colonna cromatografia di esclusione delle dimensioni ed eluderlo con un punto cinque volte il volume di colonna del buffer.Alla fine, raggruppare le frazioni eluate contenenti COL1-AMC-RBX1. Segui il protocollo di testo per preparare la proteina accettore FRET. Molti dei passaggi sono simili alla preparazione delle proteine del donatore FRET.Una volta terminata, preparare la soluzione FLASH CAND1. In primo luogo, aggiungere un microliter della soluzione FlASH a 50 microlitri della soluzione tetra-cys-CAND1 appena preparata. Mescolare bene le soluzioni combinate e incubare la miscela a temperatura ambiente al buio per una o due ore per formare la soluzione FLASH CAND1.In 300 microlitri di tampone FRET, aggiungere COL1-AMC-RBX1 ad una concentrazione finale di 70 nanomolare e trasferire la soluzione in una cuvetta. Posizionare la cuvetta nel portacampioni di un fluoriometro. Eccitare il campione con una luce di eccitazione di 350 nanometri e scansionare i segnali di emissione da 400 a 600 nanometri con incrementi di un nanometro.Quindi, in 300 microlitri di tampone FRET, aggiungere sia COL1-AMC-RBX1 che FlASH-CAND1 a una concentrazione finale di 70 nanomolari. Eccitare il campione con una luce di eccitazione di 350 nanometri e scansionare i segnali di emissione da 400-600 nanometri con incrementi di un nanometro. Impostare la luce di eccitazione a 350 nanometri e utilizzare un filtro passa banda che consente a 450 nanometri di far passare la luce di emissione e blocca la luce di emissione da 500 a 650 nanometri.Con le valvole campione in posizione di riempimento collegare una siringa da tre millilitri riempita d'acqua. Quindi, lavare le due siringhe campione con acqua spostando l'unità della siringa campione su e giù più volte, scartando l'acqua al termine. Quindi, collegare una siringa da tre millilitri riempita con tampone FRET.Lavare le due siringhe campione con il tampone FRET spostando più volte l'unità della siringa campione su e giù, scartando l'acqua al termine. Ora, collegare una siringa da tre millilitri e caricare la prima siringa campione, la siringa A, con 100 nanomolari COL1-AMC-RBX1 nel buffer FRET. Quindi ruotare la valvola del campione nella posizione di azionamento Inoltre, collegare una siringa da tre millilitri alla siringa B e caricare la siringa B con 100 nanomolari di FlASH CAND1 nel buffer FRET e ruotare la valvola nella posizione di azionamento.Aprire il pannello di controllo in fase di acquisizione nel software e registrare l'emissione di COL1-AMC nel corso di 60 secondi. Quindi, fai un solo colpo. Adatta la diminuzione e i segnali fluorescenti misurati nel tempo da ogni colpo a una singola curva esponenziale.Lavare il sistema come mostrato in precedenza e quindi aggiungere una soluzione di 100 nanomolari COL1-AMC-RBX1 e 100 nanomolare FlASH CAND1 nel tampone FRET nella siringa A.Collegarlo al sistema mentre è in posizione di riempimento Carica la siringa A e quindi ruotare la valvola del campione nella posizione di azionamento. Quindi, caricare una soluzione di Skp1-Skp2 nella siringa B.Collegarla al sistema mentre è in posizione di riempimento. Caricare la siringa B e quindi ruotare il campione nella posizione di azionamento.Nel software, vai ad acquisire e aprire il pannello di controllo. Impostare il programma per registrare l'emissione di COL1-AMC in 30 secondi. Allora fai un solo colpo.I segnali di fluorescenza aumentano nel tempo dopo aver miscelato le soluzioni dalla siringa A e dalla siringa B.Quando 70 nanomolari ciascuno di COL1-AMC e FlASH CAND1 sono stati miscelati per generare FRET, due picchi di emissione erano presenti negli spettri di emissione. E il picco di COL1-AMC è diventato più basso, e il picco di FlASH CAND1 è diventato più alto. Quando il CAND1 a tutta lunghezza è stato utilizzato per FRET, il picco del donatore ha mostrato una riduzione del 10% dell'intensità.Tuttavia, quando CAND1 con la sua prima elica troncata è stata utilizzata, la riduzione dell'intensità di picco del donatore è stata aumentata al 30% suggerendo una maggiore efficienza FRET Per confermare che i cambiamenti del segnale erano il risultato di FRET tra COL1-AMC e FlASH CAND1, il FRET del donatore è stato mescolato con CAND1 senza etichetta in eccesso noto come Chase nell'accettore. Di conseguenza, il picco del donatore è stato completamente ripristinato e il picco dell'accettore è stato ridotto. Qui è mostrato un grafico del valore K medio osservato con la concentrazione CAND1 a seguito dell'analisi di regressione lineare.Per misurare la costante costante del complesso, 50 nanomolari COL1-AMC sono stati utilizzati in una serie di costanti di velocità di dissociazione osservate sono state misurate mescolando 50 nanomolari COL1-AMC con concentrazioni crescenti di FLASH CAND1. Simile alla misurazione della costante on, la costante di dissociazione osservata di COL1 e CAND1 è stata trovata monitorando il ripristino del segnale del donatore nel tempo sul fluorometro a flusso interrotto. Qui il segnale del donatore è aumentato rapidamente e ha rivelato un valore K osservato di punto zero quattro al secondo.Al contrario, quando il buffer è stato aggiunto al complesso preassemblato, non è stato osservato alcun aumento del segnale che suggerisca che la dissociazione rapida di COL1 CAND1 sia stata innescata da Skp1 Skp2. Assicurarsi di ridurre al minimo la quantità di luce a cui sono esposte le proteine donatore e accettore. Cerca di tenere i fluorofori al buio il più possibile.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Ricerca

Biochimica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

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Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

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