Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

무서 워 분석 결과의 개발에 대 한 통찰력이 토론에 감사 슈 Ou Shan (캘리포니아 공과대학) 하 고. 밀리, Y.Z., 및 X.L. Y.Z. 퍼듀 대학교에서 시작 기금에 의해 투자 되었다 그리고 X.L.This 일 식물 생물학에 대 한 퍼듀 대학 센터에서 종자 교부 금에 의해 부분에서 지원 했다.

1입니다. 디자인 무서 워 분석 결과입니다.
<ol><li>복잡 한 Cul1•Cand1의 구조 파일 단백질 데이터 은행 (1U6G 파일)에서 다운로드 합니다.</li>
	<li>PyMOL에 복잡 한 Cul1•Cand1의 구조를 볼 수 있습니다.</li>
	<li>PyMOL의 마법사 메뉴에서 측정 함수를 사용 하 여 첫 번째 아미노산의 Cand1와 Cul1의 마지막 아미노산 사이 거리를 견적 하기 위하여 (그림 1).</li>
	<li>?...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li><li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+probing+disease+mechanisms+using+model+systems.">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).</li><li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cellular+protein-protein+interactions:+Technological+strategies+and+opportunities.">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li><li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple,+direct,+and+quantitative+in+vitro+binding+assays.">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).</li><li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. 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무서 워 공부 하 고 이해 하는 생물 학적 시스템19에 대 한 큰 관심은 물리적 현상입니다. 여기, 우리는 테스트 및 무서 워 두 상호 작용 단백질의 바인딩 활동 연구를 사용 하 여 프로토콜 제시. 디자인할 때 무서 워, 우리 세 가지 주요 요소를 고려: 기증자 방출 및 수락자 여기, 두 fluorophores fluorophores28의 쌍 극 자 방향 사이의 거리 사이의 스펙트럼 중복. 무서 워...

생물 학적 활동은 궁극적으로 대부분의 사람들과 상호 작용 적절 한 생물 학적 기능에 대 한 단백질에 의해 수행. 계산 방식을 사용 하 여, 인간의 단백질 단백질 상호 작용의 총 금액 650000 ~1, 추정 되 고 종종 이러한 상호 작용의 혼란 리드 질병2. 세포질 organismal 과정 통제에 그들의 필수적인 역할 때문 수많은 방법은 효 모 2 잡종, 분자 형광 보완성, 분할 luciferase 단백질 단백질 상호 작용 연구 개발 되었습니다. 보완성, 그리고 공동-immunoprecipitation 분석 결과3. 이러한 방법을 발견 하 고 확인 하는 단백질 단백질 상호 작용에 좋은 동안, 그들은 일반적으로 비 양적 하 고 따라서 상호 작용 단백질 파트너 간의 선호도 대 한 제한 된 정보를 제공. 양적 풀-다운 바인딩 선호도 (예: 분리 상수 Kd)를 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다 하지만 그것은 바인딩의 활동을 측정 하지 않습니다도 적용할 수 있는 그것은 Kd 는 부적당 한 것으로 인해 매우 낮은 때 신호 대 잡음 비율4. 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분광학 단정 바인딩 활동 있지만 특정 표면 및 잠재적으로 반응5의 바인딩 속성을 바꿀 수 있는 표면에 1 개의 반응의 동원 정지 합니다. 또한, 빠른 연결 및 분리 속도5, 측정 하는 SPR 어렵습니다 그리고 그것은 SPR 교환 단백질 복잡 한 소 단위 단백질의 이벤트 특성을 사용 하 여 적절 한. 여기, 우리는 단백질 복잡 한 조립과 해체 밀리초 시간 규모에서의 속도 측정을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 F 상자 단백질 교환 요소6,7 C율 린-ssociated-Nedd8-dissociated 단백질 1 (Cand1)의 역할을 결정 하기 위한 필수적 이었다.
Cand1은 Cullin 링 유비퀴틴 ligases의 큰 가족에 속하는 Skp1•Cul1•F 상자 단백질 (SCF) E3 ligases의 역학을 조절. SCFs 바인딩 링 도메인 단백질 Rbx1, Cul1 및 기판 신병 및 Cul1 접합 기 단백질 Skp18통해 바인딩하는 상호 교환 F 상자 단백질 cullin로 구성 됩니다. E3 리가 SCF catalyzes 유비퀴틴의 기판에의 활용 그리고 기판 F 상자 단백질에 의해 모집 및 Cul1 유비퀴틴-같은 단백질 Nedd89에 의해 수정 될 때 활성화 됩니다. Cand1 수정 되지 않은 Cul1 한다 Cul1와 Skp1•F-상자 단백질의 협회와 Cul110,11,,1213Nedd8 활용을 모두 바인딩 시 방해. 결과적으로, Cand1 SCF 활동 생체 외에서의 억제제 등장 하지만 생물에서 Cand1 결핍 발생 vivo14,,1516 에 SCF 활동 조절에 Cand1의 긍정적인 역할을 제안 하는 결점 , 17.이 역설은 마지막으로 Cul1, Cand1, 및 Skp1•F 상자 단백질 간의 동적 상호 작용을 밝혀 양적 연구에 의해 설명 했다. 형광 공명 에너지 전달 (무서 워) 분석 실험 SCF 및 Cul1•Cand1 단지의 형성을 검출 하는 사용 하 여, 협회 및 분리 속도 상수 (k에 / k에서각각) 했다 개별적으로 측정. Cand1와 Skp1•F-상자 단백질 형태로 매우 엄격한 복잡 한 Cul1, 그러나에서 떨어져 k SCF의 Cand1에 의해 극적으로 증가 하 고 있는 k에서 Cul1•Cand1는 극적으로 증가 했다 측정 공개 Skp1•F-상자 단백질6,7여. 이 결과 Cul1 이전 SCF 단지에서 재활용을 통해 새로운 SCF 단지의 형성 catalyzes 단백질 교환 요인으로 Cand1의 역할을 정의 하기 위한 초기 및 중요 한 지원을 제공 합니다.
여기, 우리가 개발 하 고 무서 워 분석 결과 사용 하 여 Cul1•Cand1 복잡 한7의 역학 연구의 절차를 제시 하 고 다양 한 생체 역학 연구에 동일한 원리를 적용할 수 있습니다. 무서 워 기증자는 적절 한 파장에 흥분 하 고 기증자 방출 스펙트럼 중복 여기 스펙트럼과 수락자 10-100의 거리 내에 존재 하는 경우에 발생 합니다 Å. 흥분된 상태 함으로써 기증자 강도 감소 하 고 증가 하는 수락자 강도18수락자로 전송 됩니다. 무서 워 (E)의 효율성 포스터 반경 (R0) 및 (r), 기증자 및 수락자 fluorophores 사이의 거리에 따라 달라 집니다 그리고에 의해 정의 됩니다: E = R06/ (R0 6 + r6). 포스터 반경 (R0) 쌍 극 자 각도 방향 등 몇 가지 요인에 따라 달라 집니다, 그리고 기증자 수락자 쌍 및 솔루션의 스펙트럼 중복 사용19. 실시간으로 기증자 방출의 변화를 모니터링 하 고 빠른 에 k에 와 k에서측정, 중지 흐름 fluorimeter에 무서 워 분석 결과 적용 하려면 그것은 효율적인 무서 워를 설정 하는 데 필요한 하 기증자 방출의 뜻깊은 감소에 있는 결과. 따라서, 염료를 연결할 대상 단백질에 형광 염료와의 적절 한 쌍을 선택 하 여 효율적인 무서 워 설계 중요 하 고이 프로토콜에서 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

단백질은 생물 학적 시스템의 기본 연산자 그리고 그들은 일반적으로 다른 매크로-또는 그들의 생물 학적 기능을 수행 하는 작은 분자 상호 작용. 이러한 상호 작용은 매우 동적, 상호 작용 subunits 지속적으로 연결 하 고 특정 속도에서 해리를 의미 될 수 있습니다. 빠른 방법에 통찰력을 제공 양적 풀 다운 바인딩 속도 론을 공부 하는 상호 작용의 힘을 보여와 같은 기술을 사용 하 여 바인딩 선호도 측정 하는 동안 상호 작용 발생 하 고 얼마나 오랫동안 각 복잡 한 있을 수 있습니다. 또한,는 상호 작용에 대 한 중요 한 지식을 제공 하는 다른 요인에 의해 규제 메커니즘을 공개 도움이 단백질 교환 요인 등 약물, 추가 요소가 존재 상호 작용의 속도 측정 합니다 생물학과 의학 연구의 전진입니다. 여기, 우리는 높은 내장 협회 속도가지고 있으며 다른 단백질에 의해 신속 하 게 해리 될 수 있는 복잡 한 단백질의 바인딩 활동을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 메서드는 생체 외에서, 단백질 복합물의 대형을 보고 형광 공명 에너지 전달을 사용 하 고 모니터링 빠른 연결 및 분리의 중단 흐름 fluorimeter에 실시간으로에서 복잡 한 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여 복잡 한 단백질의 협회 및 분리 속도 상수 정량 된다.

Cul1 사이 무서 워 테스트를AMC 및 플래시Cand1, 우리가 먼저 70의 방출 강도 결정 nM Cul1AMC (기증자)와 70 nM 플래시Cand1 (수락자), 각각 (그림 3A-C, 블루 라인). 각 분석에만 한 방출 피크는 현재, 그리고 플래시Cand1의 방출 (수락자) 낮은 했다. 때 70 nM 각 Cul1의AMC 및 플래시Cand1 무서 워 생성...

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Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

단백질 단백질 상호 작용은 생물 학적 시스템에 대 한 중요 한 고 단백질 복합물의 기능과 역학에 대 한 통찰력을 제공 하는 바인딩 활동의 연구. 형광 공명 에너지 전달 및 중지 흐름 기법을 사용 하 여 복잡 한 단백질의 운동 매개 변수를 수량화 하는 방법을 설명 합니다.

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

우리의 방법은 단백질 복합 체 형성의 운동학을 연구하는 데 도움이됩니다. 그것은 단백질 복합체가 얼마나 단단한지, 그리고 단백질 복합체 형성이 그밖 단백질에 의해 방해되는 경우에 기술합니다. 이 기술은 리포터로서 형광을 사용하여 정량적 방법으로 단백질 상호 작용을 연구할 수 있게 해주며, 우리의 분석법은 실시간으로 단백질 복합체의 연관성과 분리를 모니터링할 수 있습니다.먼저 단백질 데이터베이스에서 COL1 CAND1 복합체에 대한 데이터부터 시작하는 FRET 분석방법을 설계합니다. PyMOL에서 구조를 로드한 다음 마법사 메뉴로 이동하여 측정 기능을 사용하여 CAND1의 첫 번째 아미노산과 COL1의 마지막 아미노산 사이의 거리를 추정합니다. 그런 다음 온라인 스펙트럼 뷰어를 로드하고 7-아미노-4-메틸쿠마린과 FlASH의 흥분 및 방출 스펙트럼을 동시에 볼 수 있습니다.AMC는 FRET 기증자이며 FlASH는 FRET 수락자입니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 따라 다음하여 FRET 기증자 단백질로 세포를 준비합니다. 이어서, COL1 sortase RBX1 복합체를 발현하는 E.Coli 세포의 펠릿에 50밀리리터의 리시스 버퍼를 먼저 추가하여 COL1 sortase RBX1 복합체를 정화한다.50%의 진폭으로 초음파 처리로 얼음에 세포를 얼음으로 얼음. 3분 동안 전원을 번갈아 가며 1초 가시면 시료의 과열을 방지합니다. 생성된 셀 리세이트를 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 45분 동안 25, 000배 g에서 원심분리로 세포 이물질을 제거합니다.그런 다음, 글루타티온 구슬의 5 밀리리터에 상체를 추가하고 세포 용해를 취소섭씨 4도에서 배양. 인큐베이션에 따라 비드 용액 혼합물을 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 500회 g에서 원심분리합니다. 그런 다음 상체를 제거합니다.다음으로, 비드를 프로테아제 억제제가 없는 용해 완충제 5밀리리터로 씻는다. 솔루션을 원심분리한 후 상체를 제거합니다. 이제 세척된 비드에 3밀리리터의 리시스 버퍼를 추가하고 비드 슬러리를 빈 열로 옮겨 넣습니다.새 컬럼에 5밀리리터의 용출 버퍼를 추가한 다음 컬럼을 10분 동안 배양한 다음 용출액을 수집합니다. 다음으로, 글루타티온 구슬에서 용액에 밀리리터 당 5 밀리그램에 200 마이크로리터의 혈소판을 추가합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양한 후 단백질 샘플을 완충 A.Load로 3배 희석하여 단백질 샘플을 완충A로 로드하여 분당 5밀리리터제로 양화환 교환 크로마토그래피 컬럼을 평형화한다.그런 다음 완충 A에 버퍼 B의 0~50%의 그라데이션을 추가하여 분당 1밀리리터의 유량으로 단백질을 엘로우게 한다. 다음으로, FRET 기증자 단백질을 함유하는 용출 분획을 풀링하고 30킬로달톤 차단을 가진 초여골 막을 사용하여 2점 5 밀리리터로 농축합니다. 지금, 7-amino-4-메틸루마린을 탈염 컬럼을 사용하여 오테아제 버퍼로 FRET 기증자 단백질 샘플의 버퍼를 먼저 변경하여 분류 매개 트랜스펩티션을 통해 COL1의 c-terminus에 추가한다.이를 위해 먼저 25밀리리터의 분류 버퍼로 탈염 열을 평형화합니다. 그런 다음 FRET 기증자 단백질 용액의 2점 5밀리리터를 컬럼에 적재하고 흐름을 버립니다. 다음으로, 시료를 3점 5밀리리터의 분류 버퍼로 엘테우하고 흐름을 수집한다.용루액의 900 마이크로리터에서 600 마이크로몰라 정제 소분류 A 용액의 100 마이크로리터와 25 밀리머 GGGG-AMC 펩타이드의 10 마이크로리터를 추가합니다. 밤새 어둠 속에서 30°C의 반응 혼합물을 배양하여 COL1-AMC-RBX1을 생성합니다. 이제 모든 샘플을 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 로드하고 버퍼의 열 볼륨의 5배의 1포인트로 엘ute합니다.결국, COL1-AMC-RBX1을 포함하는 용출 분획을 풀링합니다. FRET 수락단백질을 준비하기 위해 텍스트 프로토콜을 따라가십시오. 많은 단계는 FRET 기증자 단백질 제제와 유사합니다.완료되면 FlASH CAND1 솔루션을 준비하십시오. 먼저 새로 준비된 테트라-시스-CAND1 솔루션의 50마이크로리터에 FlASH 용액의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 결합된 용액을 잘 혼합하고 FlASH CAND1 용액을 형성하기 위해 1~2시간 동안 어둠 속에서 실온에서 혼합물을 배양합니다.FRET 버퍼의 300 마이크로리터에서 COL1-AMC-RBX1을 최종 농도 70 나노몰러에 추가하고 용액을 큐벳으로 옮킨다. 플루오리오미터의 샘플 홀더에 큐벳을 놓습니다. 350 나노미터 흥분 광으로 샘플을 흥분시키고 한 나노 미터 단위로 400 ~ 600 나노미터의 방출 신호를 스캔합니다.그런 다음 FRET 버퍼의 300 마이크로 리터에서 COL1-AMC-RBX1및 FlASH-CAND1을 70 나노몰러의 최종 농도에 모두 추가합니다. 350 나노미터 흥분 광으로 샘플을 흥분시키고 한 나노 미터 단위로 400-600 나노미터에서 방출 신호를 스캔합니다. 350 나노미터에서 발산 광을 설정하고 450 나노미터 방출 광이 통과하고 500 ~ 650 나노 미터 방출 광을 차단 할 수있는 밴드 패스 필터를 사용합니다.충전 위치에 샘플 밸브를 사용하면 물로 채워진 3 밀리리터 주사기를 연결합니다. 그런 다음 시료 주사기를 여러 번 위아래로 움직여 물로 두 개의 시료 주사기를 세척하여 완료되면 물을 버립니다. 다음으로 FRET 버퍼로 채워진 3밀리리터 주사기를 연결합니다.샘플 주사기를 여러 번 위아래로 움직여 완료되면 물을 버리면 FRET 버퍼로 두 개의 샘플 주사기를 세척합니다. 이제 3 밀리리터 주사기를 연결하고 첫 번째 샘플 주사기 인 주사기 A를 FRET 버퍼에 100 나노 몰러 COL1-AMC-RBX1로 로드합니다. 그런 다음 시료 밸브를 드라이브 위치로 돌리고, 3 밀리리터 주사기를 주사기 B에 연결하고 FRET 버퍼에서 FlASH CAND1의 100 나노 몰러로 주사기 B를 적재하고 밸브를 드라이브 위치로 돌립니다.소프트웨어에서 획득하는 제어판을 열고 60초 동안 COL1-AMC의 방출을 기록합니다. 그런 다음 한 번의 촬영을 합니다. 각 샷에서 시간 동안 측정된 형광 신호의 감소와 단일 지수 곡선에 맞게 조정합니다.이전에 표시된 대로 시스템을 세척한 다음 FRET 버퍼에 100 나노몰러 COL1-AMC-RBX1 및 100 나노몰러 FlASH CAND1의 용액을 주사기 A.Connect로 설정하여 충전 위치에 있는 동안 시스템에 연결한 다음 시료 밸브를 드라이브 위치로 돌립니다. 그런 다음 Skp1-Skp2의 솔루션을 주사기 B.Connect에 로드하여 채우기 위치에 있는 동안 시스템에 연결합니다. 주사기 B를 로드한 다음 샘플을 드라이브 위치로 돌립니다.소프트웨어에서 제어판을 획득하고 엽니다. 30초 동안 COL1-AMC의 방출을 기록하는 프로그램을 설정합니다. 그런 다음 한 번의 촬영을 합니다.형광 신호는 주사기 A 및 주사기 B.70 나노몰러각각의 COL1-AMC 및 FlASH CAND1이 FRET를 생성하기 위해 혼합되었을 때, 배출 스펙트럼에 2개의 방출 피크가 존재했을 때 시간이 지남에 따라 증가합니다. 그리고 COL1-AMC의 피크가 낮아졌고 FlASH CAND1의 피크가 높아졌습니다. 전체 길이 CAND1이 FRET에 사용되었을 때 기증자 피크는 강도가 10% 감소하는 것으로 나타났습니다.그러나, CAND1이 첫 번째 나선을 잘린 후 기증자 피크 강도의 감소가 증가하여 더 높은 FRET 효율을 시사하여 신호 변화가 COL1-AMC와 FlASH CAND1 사이의 FRET로부터 발생했음을 확인하기 위해, 기증자 FRET는 수용자에서 체이스로 알려진 과도한 라벨이 없는 CAND1과 혼합되었다. 그 결과 기증자 피크가 완전히 복원되고 수용자 피크가 감소했습니다. 여기에 도시된 선형 회귀 분석에 따른 CAND1 농도를 가진 평균 관찰된 K값의 플롯이 있다.복합체의 상수를 측정하기 위해, 50 나노몰러 COL1-AMC는 일련의 관찰된 해리율 상수를 플로라시 CAND1의 농도 증가와 50 나노몰러 COL1-AMC를 혼합하여 측정되었다. 상수의 측정과 유사하게, COL1 및 CAND1의 관찰된 해리 상수는 정지된 유동 형광계에 시간이 지남에 따라 기증자 신호의 복원을 모니터링함으로써 발견되었다. 여기서 기증자 신호는 빠르게 증가하고 초당 4점의 관찰된 K 값을 드러냈다.대조적으로, 사전 조립된 복합체에 버퍼를 첨가했을 때, Skp1 Skp2에 의해 유발된 COL1 CAND1의 빠른 해리를 암시하는 신호 증가가 관찰되지 않았다. 가능한 한 어둠 속에서 형광을 유지하려고합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

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