Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Vi takker Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) for innsiktsfulle diskusjon om utviklingen av bånd analysen. M.G., Y.Z. og X.L. ble finansiert av oppstart penger fra Purdue University til Y.Z. og X.L.This arbeidet var støttes delvis av frø stipend fra Purdue University Center for plante biologi.

1. prosjektert bånd analysen.
<ol><li>Last ned filen Cul1•Cand1 kompleks i struktur fra Protein Data Bank (filen 1U6G).</li>
	<li>Vise strukturen for Cul1•Cand1 i PyMOL.</li>
	<li>Bruk funksjonen måling på PyMOL veiviseren meny til å beregne avstanden mellom den første aminosyren av Cand1 og den siste aminosyren av Cul1 (figur 1).</li>
	<li>Last online spectra betrakteren (se Tabell for materiale) og Vis eksitasjon og utslipp spek...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li><li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+probing+disease+mechanisms+using+model+systems.">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).</li><li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cellular+protein-protein+interactions:+Technological+strategies+and+opportunities.">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li><li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple,+direct,+and+quantitative+in+vitro+binding+assays.">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).</li><li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+kinetic+studies+of+biological+interactions:+A+review.">Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).</li><li>Pierce, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1+promotes+assembly+of+new+SCF+complexes+through+dynamic+exchange+of+F+box+proteins.">Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins.</a> Cell. 153 (1), 206-215 (2013).</li><li>Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1-Mediated+Adaptive+Exchange+Mechanism+Enables+Variation+in+F-Box+Protein+Expression.">Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression.</a> Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).</li><li>Zheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cul1-Rbx1-Skp1-F+boxSkp2+SCF+ubiquitin+ligase+complex.">Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex.</a> Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).</li><li>Kleiger, G., Deshaies, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag+Team+Ubiquitin+Ligases.">Tag Team Ubiquitin Ligases.</a> Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1+binds+to+unneddylated+CUL1+and+regulates+the+formation+of+SCF+ubiquitin+E3+ligase+complex.">CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex.</a> Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).</li><li>Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+unneddylated+cullin+1+and+regulates+its+neddylation.">TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation.</a> FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).</li><li>Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+cullins+and+modulates+ubiquitin+ligase+activity.">TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).</li><li>Goldenberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cand1-Cul1-Roc1+complex+reveals+regulatory+mechanisms+for+the+assembly+of+the+multisubunit+cullin-dependent+ubiquitin+ligases.">Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases.</a> Cell. 119 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ETA2,+an+apparent+ortholog+of+the+human+cullin-interacting+protein+CAND1,+is+required+for+auxin+responses+mediated+by+the+SCF(TIR1)+ubiquitin+ligase.">Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase.</a> Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CAND1,+an+Unmodified+CUL1-Interacting+Protein,+Is+Involved+in+Multiple+Developmental+Pathways+Controlled+by+Ubiquitin/Proteasome-Mediated+Protein+Degradation.">Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation.</a> the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).</li><li>Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtCAND1,+a+HEAT-repeat+protein+that+participates+in+auxin+signaling+in+Arabidopsis.">AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).</li><li>Lo, S. -. C., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1-Mediated+Substrate+Adaptor+Recycling+Is+Required+for+Efficient+Repression+of+Nrf2+by+Keap1.">CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).</li><li>Okamoto, K., Sako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+FRET+for+the+study+of+protein+interactions+and+dynamics.">Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).</li><li>Hussain, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET).">An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET).</a> arXiv preprint. , (2009).</li><li>Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+and+purification+of+recombinant+SCF+ubiquitin+ligases.">High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases.</a> Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).</li><li>Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortagging:+A+versatile+method+for+protein+labeling.">Sortagging: A versatile method for protein labeling.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).</li><li>Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Protein+Labeling+via+Sortase-Mediated+Transpeptidation.">Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-PAGE+of+Proteins.">SDS-PAGE of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+E2-E3+Assembly+and+Disassembly+Enable+Processive+Ubiquitylation+of+Cullin-RING+Ubiquitin+Ligase+Substrates.">Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates.</a> Cell. 139 (5), 957-968 (2009).</li><li>Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Stopped-flow+Kinetics+Methods+to+Investigate+the+Mechanism+of+Action+of+a+DNA+Repair+Protein.">Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).</li><li>Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Stopped-Flow+Fluorescence+and+Labeled+Nucleotides+to+Analyze+the+ATP+Turnover+Cycle+of+Kinesins.">Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs.">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Lin, C. T., Rorabacher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+approach+for+stopped-flow+kinetics+of+fast+second-order+reactions+involving+inhomogeneity+in+the+reaction+cell.">Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell.</a> Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).</li><li>Toseland, C. P., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Reaction+Kinetic+Techniques.">Rapid Reaction Kinetic Techniques.</a> Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Lin, C. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase-catalyzed+site-specific+conjugation+of+small-molecule+probes+to+proteins+in+vitro+and+on+the+surface+of+living+cells.">Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+short+peptide+tag+for+versatile+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).</li><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+Basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+GTPase+movement+on+an+RNA+scaffold+drives+co-translational+protein+targeting.">Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting.</a> Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).</li></ol>

BÅND er et fysisk fenomen av stor interesse for å studere og forstå biologiske systemer19. Her presenterer vi en protokoll for testing og bruk av bånd bindende kinetics to samspill proteiner. Når du utformer bånd, vi vurdert tre viktige faktorer: spectral overlappingen mellom donor utslipp og acceptor eksitasjon, avstanden mellom de to fluorophores og dipol retningen av fluorophores28. Velg fluorophores for bånd, vi kledde eksitasjon og utslipp spektra av fluorophore...

Biologiske aktiviteter utføres til slutt av proteiner, mest som samhandler med andre for riktig biologiske funksjoner. Bruke en beregningsorientert tilnærming, den totale mengden protein-protein interaksjoner i human er anslått til ~ 650 0001og avbrudd i disse samhandlingene ofte fører til sykdommer2. På grunn av deres viktige roller i å kontrollere mobilnettet og organismebiologi prosesser, er mange metoder utviklet for å studere protein-protein interaksjoner, for eksempel gjær-to-hybrid, resultatet av dette fluorescens complementation, split-luciferase complementation og co-immunoprecipitation analysen3. Mens disse metodene er flink til å oppdage og bekrefter protein-protein interaksjoner, de er vanligvis ikke-kvantitative og dermed gir begrenset informasjon om affinitet mellom samspill protein partnerne. Kvantitativ rullegardinlistene kan brukes til å måle forpliktende tilhørighet (f.eks dissosiasjon konstanten Kd), men det måle ikke the kinetics av bindingen eller kan det brukes når Kd er svært lav på grunn av en utilstrekkelig signal-til-støy forholdet4. Overflaten plasmon resonans (SPR) spektroskopi kvantifiserer bindende kinetikk, men det krever en bestemt overflaten og immobilisering av en reactant på overflaten som potensielt kan endre binding-egenskapen reactant5. Videre er det vanskelig for SPR å måle rask association og dissosiasjon priser5, og det er ikke hensiktsmessig å bruke SPR for å karakterisere hendelsen utveksle protein underenheter i et protein kompleks. Her beskriver vi en metode som tillater måling av protein kompleks montering og demontering på et millisekund tidsskalaen. Denne metoden var avgjørende for fastsette rollen til Cullin - ssociated -Nedd8 -dissociated protein 1 (Cand1)i F-boks protein utveksling faktor6,7.
Cand1 regulerer dynamikken i Skp1•Cul1•F-boksen protein (SCF) E3 ligases, som tilhører familien Cullin-RING ubiquitin ligases. SCFs består av cullin Cul1, som binder RING domene protein Rbx1, og en utskiftbare F-boks protein, som rekrutterer underlag og binder Cul1 gjennom adapter protein Skp18. Som en E3 ligase, SCF gir Bøyning av ubiquitin til sin substrat, og aktiveres når underlaget er rekruttert av F-boks protein, og når Cul1 endres av ubiquitin-lignende protein Nedd89. Cand1 binder uforandret Cul1, og ved bindende, det forstyrrer både foreningen Skp1•F-box protein med Cul1 og Bøyning av Nedd8 Cul110,11,12,13. Resultatet Cand1 syntes å være en inhibitor av SCF aktivitet i vitro, men Cand1 mangel på organismer forårsaket som antyder en positiv rolle i Cand1 i å regulere SCF aktiviteter i vivo14,15,16 , 17. dette paradokset ble endelig forklart av en kvantitativ studie som avslørte de dynamiske interaksjonene mellom Cul1, Cand1 og Skp1•F-box protein. Bruker fluorescens resonans energi overføring (bånd) analyser som oppdager dannelsen av SCF og Cul1•Cand1 komplekser, foreningen og dissosiasjon rate konstanter (kpå og kav, henholdsvis) var målt individuelt. Målingene avslørte at både Cand1 og Skp1•F-box protein skjemaet stramt kompleks med Cul1, men den kav av SCF er dramatisk økte med Cand1 og den kav av Cul1•Cand1 økes dramatisk av Skp1•F-box protein6,7. Disse resultatene gir den første og kritiske støtten for definering av rollen for Cand1 som en protein utveksling faktor, som gir dannelsen av nye SCF komplekser gjennom gjenvinning Cul1 fra gamle SCF komplekser.
Her presenterer vi prosedyren for utvikling og bruk av bånd analysen for å studere dynamikken i Cul1•Cand1 komplekse7, og det samme prinsippet kan brukes til å studere dynamikken i ulike biomolecules. BÅND oppstår når en donor er glade med den riktige bølgelengden og en godkjenner med eksitasjon spectrum overlappende donor utslipp spektrum finnes innenfor en avstand på 10-100 Å. Opphisset tilstand overføres til acceptor, og dermed redusere donor intensiteten og øke acceptor intensitet18. Effektiviteten av bånd (E) avhenger både han selvmord radius (R0) og avstanden mellom giver og acceptor fluorophores (r), og er definert av: E = R06/ (R0 6 + r6). Han selvmord radius (R0) avhenger av flere faktorer, inkludert dipol kantete retningen, spectral overlappingen av donor-acceptor paret, og løsningen brukes19. Hvis du vil bruke bånd analysen på en stoppet-flow fluorimeter, som overvåker endring av donor utslipp i sanntid og muliggjør målinger av rask kpå og kav, er det nødvendig å etablere effektive bånd som resulterer i en betydelig reduksjon av donor utslipp. Derfor utforme effektive bånd ved å velge riktig par fluorescerende fargestoffer og områder på målet proteiner knytte fargestoffer er viktig og vil bli diskutert i denne protokollen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

Proteiner er primære operatører av biologiske systemer, og de kommuniserer vanligvis med andre makro- eller små molekyler utføre sine biologiske funksjoner. Slike samhandlinger kan være svært dynamisk, betyr de samspill underenheter er stadig forbundet og avstand på enkelte priser. Mens måle forpliktende tilhørighet med teknikker som kvantitative rullegardinmenyen avslører styrke samhandling, studere bindende kinetics gir innsikt i hvordan rask samspillet skjer og hvor lenge hver komplekset finnes. Videre måle the kinetics av en interaksjon i nærvær av en tilleggsfaktor, for eksempel en protein utveksling faktor eller et legemiddel, hjelper avsløre mekanismen som samhandlingen er regulert av den andre faktoren, gir viktig kunnskap for den fremme av biologisk og medisinsk forskning. Her beskriver vi en protokoll for å måle bindende kinetics av et protein kompleks som har en høy iboende tilknytning hastighet og kan bli atskilt raskt av en annen protein. Metoden bruker fluorescens resonans energi-overføring til å rapportere dannelsen av protein kompleks i vitro, og du kan overvåke rask foreningen og av komplekset i sanntid på en stoppet-flow fluorimeter. Bruker denne analysen, er association og dissosiasjon rate konstanter av proteinet kvantifisert.

Teste båndet mellom Cul1AMC og FlAsHCand1, vi først bestemt utslippsintensitet 70 nM Cul1AMC (giveren) og 70 nM FlAsHCand1 (acceptor), henholdsvis (figur 3A-C, blå linjer). I hver analyse, bare én utslipp toppen var nåtid og utslipp av FlAsHCand1 var (acceptor) lav. Når 70 nM i Cul1AMC og FlAsHCand1 ble blandet for å generere bånd, to utslipp toppene var tils...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein-protein interaksjoner er avgjørende for biologiske systemer, og studier av bindende kinetics gir innsikt i dynamikk og funksjonen av protein komplekser. Vi beskriver en metode som quantifies kinetic parameterne for et protein kompleks fluorescens resonans energioverføring og stoppet-flow teknikken.

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Vår metode bidrar til å studere kinetikken til en proteinkompleks formasjon. Den beskriver hvor stramt et proteinkompleks er, og hvis den proteinkomplekse formasjonen forstyrres av andre proteiner. Denne teknikken gjør det mulig å studere protein-protein interaksjon på kvantitativ måte ved hjelp av fluorescens som reporter, vår analyse kan overvåke foreningen og disassociation av et protein kompleks i sanntid.Til å begynne med utformer du FRET-analysen som starter med dataene for COL1 CAND1-komplekset fra proteindatabasen. Last strukturen i PyMOL, og gå deretter til veivisermenyen og bruk målefunksjonen til å estimere avstanden mellom den første aminosyren i CAND1 og den siste aminosyren i COL1. Deretter laster du online spectra viewer og ser eksitasjon og utslipp spektra av 7-amino-4-metylokummarin og FlASH samtidig.AMC er FRET donor og FlASH er FRET acceptor. Forbered celler med FRET donorprotein ved å følge med i den medfølgende tekstprotokollen. Deretter renser du COL1 sortase RBX1-komplekset ved først å legge til 50 milliliter lysisbuffer til en pellet av E.Coli-celler som uttrykker COL1 sortase RBX1-komplekset.Is cellene på is med sonikering ved 50% amplitude. Veksler mellom strøm i tre minutter slik at den er ett sekund på, og deretter ett sekund av for å hindre overoppheting av prøven. Overfør den resulterende cellelylaten til et 50 milliliter sentrifugeringsrør og fjern celleavfallet ved sentrifugering ved 25.000 ganger g i 45 minutter.Deretter legger du til supernatant til fem milliliter glutationperler og inkuberer dem ved fire grader Celsius for å fjerne cellelylat. Etter inkubasjon sentrifuger perlen lysateblandingen ved 1, 500 ganger g i to minutter ved fire grader Celsius. Deretter fjerner du det overnaturlige.Deretter vasker du perlene med 5 milliliter lysisbuffer uten proteasehemmer. Etter sentrifugering av løsningen, fjern supernatanten. Legg nå til tre milliliter lysisbuffer til de vasket perlene og overfør perlesluren til en tom kolonne.I den nye kolonnen legger du også til fem milliliter elutionbuffer og deretter inkuberer kolonnen i 10 minutter og samler eluatet. Deretter legger du til 200 mikroliter trombin ved fem milligram per milliliter til eluatet fra glutationperlene. Etter en inkubasjon over natten ved fire grader Celsius fortynne proteinprøven tre ganger med buffer A.Last proteinprøven til en buffer En likevekts kationutveksling kromatografikolonne på null punkt fem milliliter per minutt.Deretter legger du til en gradering på null til 50 % buffer B i buffer A for å elute proteinet med en strømningshastighet på 1 milliliter per minutt. Deretter kan du slå sammen eluatefraksjonene som inneholder FRET-donorproteinet og konsentrere det ned til to punkt fem milliliter ved hjelp av en ultrafiltreringsmembran med en 30 kilodalton cutoff. Nå legger du til 7-amino-4-metylkummarin til c-terminus av COL1 gjennom sortase mediert transpeptidation ved først å endre bufferen i FRET donor protein prøven inn i sortase buffer ved hjelp av en desalting kolonne.For å oppnå dette, først likevekt en desalting kolonne med 25 milliliter sortase buffer. Deretter laster du to punkt fem milliliter av FRET donorproteinløsningen inn i kolonnen og kaster strømmen gjennom. Deretter elute prøven med tre punkt fem milliliter sortase buffer og samle flyten gjennom.I 900 mikroliter av eluatet, tilsett 100 mikroliter av 600 mikromos renset sortase En løsning og 10 mikroliter av et 25 millimolar GGGGGG-AMC peptid. Inkuber reaksjonsblandingen ved 30 grader Celsius i mørket over natten for å generere COL1-AMC-RBX1. Nå laster du hele eksemplet på størrelsesekskluderingskolonnen kromatografi og elute den med ett punkt fem ganger kolonnevolumet for buffer.Til slutt kan du utvalge eluate-brøkene som inneholder COL1-AMC-RBX1. Følg med i tekstprotokollen for å forberede FRET-akseptorproteinet. Mange av trinnene ligner på FRET donorproteinpreparatet.Når du er ferdig, klargjør FlASH CAND1-løsningen. Tilsett først en mikroliter av FlASH-oppløsningen til 50 mikroliter av den nyoppgjorte tetra-cys-CAND1-løsningen. Bland de kombinerte løsningene godt og inkuber blandingen ved romtemperatur i mørket i en til to timer for å danne FlASH CAND1-løsningen.I 300 mikroliter fretbuffer legger du col1-AMC-RBX1 til en endelig konsentrasjon på 70 nanomær og overfører løsningen til en cuvette. Plasser cuvette i prøveholderen på et fluoriometer. Oppånd prøven med 350 nanometer eksitasjonslys og skann utslippssignalene fra 400 til 600 nanometer ved ett nanometer trinn.Deretter, i 300 mikroliter med FRET-buffer, legger du til både COL1-AMC-RBX1 og FlASH-CAND1 til en endelig konsentrasjon på 70 nanomolar. Oppånd prøven med 350 nanometer eksitasjonslys og skann utslippssignalene fra 400-600 nanometer ved ett nanometer trinn. Sett eksitasjonslyset på 350 nanometer og bruk et båndpassfilter som gjør at 450 nanometers utslippslys kan passere og blokkere 500 til 650 nanometer utslippslys.Med prøveventilene i fyllposisjon koble en tre milliliter sprøyte fylt med vann. Vask deretter de to prøvesprøytene med vann ved å flytte prøvesprøyten opp og ned flere ganger, og kast vannet når du er ferdig. Deretter kobler du til en tre milliliter sprøyte fylt med FRET-buffer.Vask de to prøvesprøytene med FRET-bufferen ved å flytte prøvesprøytekjøringen opp og ned flere ganger, og kast vannet når det er ferdig. Koble nå til en tre milliliter sprøyte og legg den første prøvesprøyten, sprøyte A, med 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 i FRET-bufferen. Deretter vrir du prøveventilen til drivposisjon Koble også en tre milliliter sprøyte til sprøyte B og laster sprøyte B med 100 nanomull av FlASH CAND1 i FRET-bufferen og vri ventilen til drivposisjon.Åpne kontrollpanelet under erverv i programvaren og registrere utslipp av COL1-AMC i løpet av 60 sekunder. Så ta et enkelt skudd. Monter reduksjonen og de fluorescerende signalene målt over tid fra hvert skudd til en enkelt eksponentiell kurve.Vask systemet som tidligere vist, og legg deretter til en løsning på 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 og 100 nanomolar FlASH CAND1 i FRET-bufferen til sprøyte A.Koble det til systemet mens den er i fyllposisjon Last sprøyte A og vri deretter prøveventilen til drivposisjon. Deretter legger du en oppløsning av Skp1-Skp2 i sprøyte B.Koble den til systemet mens den er i fyllposisjon. Last sprøyte B, og vri deretter prøven til drivposisjonen.I programvaren, gå for å skaffe og åpne kontrollpanelet. Sett opp programmet for å registrere utslipp av COL1-AMC over 30 sekunder. Så ta et enkelt skudd.Fluorescenssignalene øker over tid etter at blandeoppløsninger fra sprøyte A og sprøyte B.Når 70 nanomolar hver av COL1-AMC og FlASH CAND1 ble blandet for å generere FRET, var det to utslippstopp til stede i utslippsspektraet. Og toppen av COL1-AMC ble lavere, og toppen av FlASH CAND1 ble høyere. Når hele cand1 ble brukt til FRET donortoppen viste en 10% reduksjon i intensitet.Men når CAND1 med sin første helix avkorting ble brukt reduksjon av donor topp intensitet ble økt til 30% noe som tyder på høyere FRET effektivitet For å bekrefte at signalendringene ble forårsaket av FRET mellom COL1-AMC og FlASH CAND1, donorFREKVENS ble blandet med overflødig umerket CAND1 kjent som Chase i acceptor. Som et resultat ble donortoppen fullstendig restaurert og akseptortoppen ble redusert. Vist her er et plott av den gjennomsnittlige observerte K-verdien med CAND1-konsentrasjonen etter lineær regresjonsanalyse.For å måle konstanten av komplekset ble 50 nanomolar COL1-AMC brukt i en rekke observerte dissosiasjonshastighetskonstanter målt ved å blande 50 nanomolar COL1-AMC med økende konsentrasjoner av FlASH CAND1. I likhet med målingen av den på konstante, ble den observerte dissosiasjonskonstanten til COL1 og CAND1 funnet ved å overvåke restaureringen av donorsignalet over tid på det stoppet strømningsfluorometeret. Her økte donorsignalet raskt, og det viste en observert K-verdi på nullpunkt fire per sekund.I motsetning, når buffer ble lagt til det forhåndsmonterte komplekset, ble det ikke observert noen signaløkning som tyder på at den raske dissosiasjonen av COL1 CAND1 ble utløst av Skp1 Skp2. Sørg for å minimere mengden lys donor- og akseptorproteinene er utsatt for. Prøv å holde fluoroforer i mørket så mye som mulig.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Bruke tidsbestemt proteinindusert fluorescensforbedring for å identifisere stabile lokale konformasjoner En α-Synuclein Monomer om gangen

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyl fluorescens energioverføringsstudie av ribosomet proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...