Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Agradecemos perspicaz discussão sobre o desenvolvimento do ensaio FRET-Shu-UO Shan (California Institute of Technology). M.G., Y.Z. e X.L. foram financiados por fundos de inicialização da Universidade de Purdue para Y.Z. e X.L.This trabalho foi financiado em parte por uma concessão de semente da Purdue University Center para a biologia da planta.

1. design o ensaio de traste.
<ol><li>Baixe o arquivo de estrutura do complexo do Cul1•Cand1 do banco de dados da proteína (arquivo 1U6G).</li>
	<li>Exiba a estrutura de complexos em PyMOL o Cul1•Cand1.</li>
	<li>Use a função de medição no menu Assistente de PyMOL para estimar a distância entre o primeiro aminoácido da Cand1 e o último aminoácido de Cul1 (Figura 1).</li>
	<li>Carregar o Visualizador de espectros on-line (ver Tabela de ...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li><li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+probing+disease+mechanisms+using+model+systems.">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).</li><li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cellular+protein-protein+interactions:+Technological+strategies+and+opportunities.">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li><li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple,+direct,+and+quantitative+in+vitro+binding+assays.">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).</li><li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cand1-Cul1-Roc1+complex+reveals+regulatory+mechanisms+for+the+assembly+of+the+multisubunit+cullin-dependent+ubiquitin+ligases.">Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases.</a> Cell. 119 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. 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TRASTE é um fenômeno físico que é de grande interesse para o estudo e compreensão de sistemas biológicos19. Aqui, apresentamos um protocolo para teste e usando o FRET para estudar a cinética de ligação de duas proteínas de interação. Ao projetar o traste, consideramos três fatores principais: a sobreposição espectral entre o doador de emissão e aceitador da excitação, a distância entre os dois fluorophores e a orientação do dipolo do fluorophores28. Par...

Atividades biológicas em última análise, são realizadas por proteínas, mais do que interagir com outras pessoas para funções biológicas. Usando uma abordagem computacional, a quantidade total de interações da proteína-proteína em humanos é estimada em 650.000 ~1, e interrupção dessas interações muitas vezes leva a doenças2. Devido a seus papéis essenciais no controle de processos celulares e organismos, inúmeros métodos foram desenvolvidos para estudar interações da proteína-proteína, tais como levedura-dois-híbrido, complementação de fluorescência bimolecular, split-luciferase complementação e co-imunoprecipitação ensaio3. Enquanto esses métodos são bons em descobrir e confirmando as interações da proteína-proteína, eles são geralmente não-quantitativos e, portanto, fornecem informações limitadas sobre a afinidade entre os parceiros de proteína interagindo. Pull-downs quantitativas podem ser usados para medir a afinidade de ligação (por exemplo, a constante de dissociação Kd), mas ele não mede a cinética da ligação, nem pode ser aplicada quando o Kd é muito baixa devido a uma insuficiente relação sinal-ruído4. Espectroscopia de ressonância (SPR) de plasmon de superfície quantifica a cinética de ligação, mas requer uma superfície específica e a imobilização de um reagente na superfície, o que potencialmente pode alterar a propriedade de ligação do reagente5. Além disso, é difícil para SPR medir Associação rápida e taxas de dissociação5, e não é apropriado usar SPR para caracterizar o evento de troca de subunidades de proteínas em um complexo proteico. Aqui, descrevemos um método que permite medir taxas de proteína complexa montagem e desmontagem em uma escala de tempo em milissegundos. Este método foi essencial para determinar a função de Cullin -umssociated -Nedd8 -dissociated proteína 1 (Cand1) como o F-caixa proteína troca fator6,7.
Cand1 regula a dinâmica da E3 ligases do proteína (SCF) Skp1•Cul1•F-caixa, que pertencem à grande família de ligases do ubiquitin Cullin-anel. SCFs consistem no neddylation Cul1, que se liga a proteína de domínio de anel Rbx1, e uma proteína F-caixa intercambiável, o que recruta substratos e liga Cul1 através da proteína do adaptador Skp18. Como um ligase E3, SCF catalisa a conjugação da ubiquitina de seu substrato, e é ativado quando o substrato é recrutado pela proteína F-box, e quando Cul1 é modificado pela proteína ubiquitina-como Nedd89. Cand1 liga Cul1 sem modificações, e após a ligação, ele perturba tanto a associação de proteína Skp1•F-caixa com Cul1 e a conjugação de Nedd8 de Cul110,11,12,13. Como resultado, Cand1 parecia ser um inibidor da atividade do SCF in vitro, mas Cand1 deficiência em organismos causou defeitos que sugere um papel positivo de Cand1 na regulação de atividades SCF em vivo14,15,16 , 17. este paradoxo foi finalmente explicado por um estudo quantitativo que revelou as interações dinâmicas entre Cul1, Cand1 e Skp1•F-caixa de proteína. Utilizando ensaios de transferência (FRET) de energia ressonância fluorescência que detectam a formação dos complexos SCF e Cul1•Cand1, a associação e dissociação taxa constantes (k,na e kfora, respectivamente) foram medido individualmente. As medições revelaram que tanto Cand1 e Skp1•F-caixa de forma extremamente apertado complexo proteico com Cul1, mas o kfora do SCF é dramaticamente aumentado pela Cand1 e o kfora de Cul1•Cand1 é dramaticamente aumentada por Skp1•F-caixa proteína6,7. Estes resultados fornecem o apoio inicial e crítico para definir o papel de Cand1 como um fator de troca de proteína, que catalisa a formação de novos complexos SCF através da reciclagem de Cul1 desde os antigos complexos SCF.
Aqui, apresentamos o processo de desenvolvimento e usando o ensaio FRET para estudar a dinâmica do complexo Cul1•Cand17, e o mesmo princípio pode ser aplicado para estudar a dinâmica de várias biomoléculas. TRASTE ocorre quando um doador está animado com o comprimento de onda adequado, e um aceitador com espectro de excitação sobrepondo o espectro de emissão do doador está presente dentro de uma distância de 10 a 100 Å. O estado excitado é transferido para o aceitador, desse modo diminuindo a intensidade do doador e aumentando a intensidade de aceitador18. A eficiência do traste (E) depende do raio de Förster (R0) e a distância entre o doador e aceptor fluorophores (r) e é definida por: E = R06/ (R0 6 + r6). O raio de Förster (R0) depende de alguns fatores, incluindo a orientação angular de dipolo, a sobreposição espectral do par doador-aceitador e a solução usada19. Para aplicar o traste do ensaio em um fluorímetro de fluxo parou, que monitora a mudança das emissões doador em tempo real e permite medições de rápido k,na e kfora, é necessário estabelecer FRET eficiente que resulta em uma redução significativa das emissões de doador. Portanto, projetar FRET eficiente, escolhendo o par apropriado de corantes fluorescentes e sites sobre as proteínas alvo para anexar as tinturas é importante e será discutido neste protocolo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

As proteínas são os operadores primários de sistemas biológicos, e geralmente interagem com outro macro - ou pequenas moléculas para realizar suas funções biológicas. Tais interações podem ser altamente dinâmicas, significando as subunidades interagindo constantemente são associadas e dissociadas a determinadas taxas. Enquanto a afinidade de ligação usando técnicas tais como suspenso quantitativo revela a força da interação, estudando a cinética de ligação de medição fornece insights sobre como rápido a interação ocorre e quanto tempo cada complexo pode existir. Além disso, medir a cinética da interação na presença de um fator adicional, como um fator de troca de proteína ou uma droga, ajuda a revelar o mecanismo pelo qual a interação é regulada por outro fator, fornecendo conhecimentos importantes para o avanço de pesquisas biológicas e médicas. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a cinética de ligação de um complexo de proteínas que tem uma taxa de associação intrínseca elevada e pode ser rapidamente dissociado por outra proteína. O método utiliza a transferência de energia de ressonância de fluorescência para relatar a formação do complexo proteína in vitro, e permite monitorar a rápida associação e dissociação do complexo em tempo real em um fluorímetro de fluxo parou. Usando este ensaio, as constantes de taxa de associação e dissociação da proteína complexa são quantificadas.

Para testar o traste entre Cul1AMC e FlAsHCand1, primeiro determinamos a intensidade de emissão de 70 nM Cul1AMC (o doador) e 70 nM Cand1 FlAsH(o aceitador), respectivamente (Figura 3A-C, azul linhas). Em cada análise, somente um pico de emissão estava presente e a emissão de Cand1 FlAsH(o aceitador) foi baixa. Quando 70 nM cada de Cul1AMC e FlAsHCand1 foram mist...

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Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Interações da proteína-proteína são essenciais para sistemas biológicos, e estudos sobre a cinética de ligação fornecem insights sobre a dinâmica e a função dos complexos da proteína. Nós descrevemos um método que quantifica os parâmetros cinéticos de uma proteína complexa usando transferência de energia de ressonância de fluorescência e a técnica de fluxo parou.

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Nosso método ajuda a estudar a cinética de uma formação complexa de proteínas. Descreve o quão apertado é um complexo proteico, e se a formação do complexo proteico é interferida por outras proteínas. Essa técnica permite estudar a interação proteína-proteína de forma quantitativa usando fluorescência como repórter, nosso ensaio pode monitorar a associação e a dissociação de um complexo proteico em tempo real.Para começar, desenhe o ensaio FRET a partir dos dados do complexo COL1 CAND1 do banco de dados de proteínas. Carregue a estrutura em PyMOL e, em seguida, vá para o menu do assistente e use a função de medição para estimar a distância entre o primeiro aminoácido do CAND1 e o último aminoácido de COL1. Em seguida, carregue o visualizador de espectros on-line e visualize os espectros de excitação e emissão de 7-amino-4-metilcoumarina e FlASH simultaneamente.A AMC é o doador da FRET e FlASH é o aceitador da FRET. Prepare as células com a proteína do doador FRET seguindo o protocolo de texto que acompanha. Em seguida, purifique o complexo COL1 sortase RBX1 adicionando primeiro 50 mililitros de tampão de lise a uma pelota de células E.Coli expressando o complexo COL1 sortase RBX1.Gelo as células no gelo com sônicação a 50%de amplitude. Alterne a potência por três minutos para que ela esteja um segundo ligado e, em seguida, um segundo de folga para evitar superaquecimento da amostra. Transfira o lise celular resultante para um tubo de centrifugação de 50 mililitros e remova os detritos celulares por centrifugação a 25.000 vezes g durante 45 minutos.Em seguida, adicione o supernatante a cinco mililitros de contas de glutationa e incuba-as a quatro graus Celsius para limpar o lisetê celular. Após a incubação, centrifugar a mistura de lise de contas a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius. Então, remova o supernatante.Em seguida, lave as contas com 5 mililitros de tampão de lise sem inibidor de protease. Depois de centrifuging a solução, remova o supernante. Agora, adicione três mililitros de tampão de lise às contas lavadas e transfira o chorume de contas para uma coluna vazia.À nova coluna, adicione também cinco mililitros de tampão de elução e, em seguida, incubar a coluna por 10 minutos e coletar o elunato. Em seguida, adicione 200 microliters de trombina a cinco miligramas por mililitro ao eluato das contas de glutationa. Após uma incubação noturna a quatro graus Celsius diluir a amostra de proteína três vezes com tampão A.Carregue a amostra de proteína para um tampão Uma coluna de cromatografia de troca cônica equilibrada em zero ponto cinco mililitros por minuto.Em seguida, adicione um gradiente de zero a 50% de tampão B no buffer A para elutar a proteína com uma taxa de fluxo de 1 mililitro por minuto. Em seguida, acumule as frações eluadas contendo a proteína do doador FRET e concentre-a até dois pontos cinco mililitros usando uma membrana de ultrafiltração com um corte de 30 kilodalton. Agora, adicione 7-amino-4-metilcoumarina ao c-terminus de COL1 através da transpeptidação mediada de classificação, mudando primeiro o buffer na amostra de proteína do doador FRET no buffer de separação usando uma coluna de dessalgação.Para isso, equilibre primeiro uma coluna de desalamento com 25 mililitros de tampão de tipo. Em seguida, carregue dois pontos cinco mililitros da solução de proteína doadora FRET na coluna e descarte o fluxo através. Em seguida, elute a amostra com três pontos cinco mililitros de tampão de tipo e coletar o fluxo através.Em 900 microlitadores do eluato, adicione 100 microlitres de 600 micromolar purificados uma solução e 10 microliters de um peptídeo GGGG-AMC de 25 mililitros. Incubar a mistura de reação a 30 graus Celsius no escuro durante a noite para gerar COL1-AMC-RBX1. Agora, carregue toda a amostra na coluna de cromatografia de exclusão de tamanho e elute-a com um ponto cinco vezes o volume da coluna de buffer.No final, acumule as frações eluadas contendo COL1-AMC-RBX1. Acompanhe o protocolo de texto para preparar a proteína aceitadora de FRET. Muitas das etapas são semelhantes à preparação da proteína do doador FRET.Uma vez concluída, prepare a solução FlASH CAND1. Primeiro, adicione um microliter da solução FlASH a 50 microliters da solução tetra-cys-CAND1 recém-preparada. Misture bem as soluções combinadas e incubar a mistura à temperatura ambiente no escuro por uma a duas horas para formar a solução FlASH CAND1.Em 300 microliters de buffer FRET, adicione COL1-AMC-RBX1 a uma concentração final de 70 nanomolares e transfira a solução para um cuvette. Coloque a cuvette no suporte amostral de um fluorômetro. Excite a amostra com 350 nanômetros de luz de excitação e escaneie os sinais de emissão de 400 a 600 nanômetros em incrementos de um nanômetro.Em seguida, em 300 microliters de buffer FRET, adicione tanto COL1-AMC-RBX1 quanto FlASH-CAND1 a uma concentração final de 70 nanomolar. Excite a amostra com 350 nanômetros de luz de excitação e escaneie os sinais de emissão de 400-600 nanômetros em incrementos de um nanômetro. Coloque a luz de excitação em 350 nanômetros e use um filtro de passagem de banda que permite que 450 nanômetros de luz de emissão passem e bloqueie 500 a 650 nanômetros de luz de emissão.Com as válvulas de amostra na posição de preenchimento conecte uma seringa de três mililitros cheia de água. Em seguida, lave as duas seringas de amostra com água movendo a seringa amostra para cima e para baixo várias vezes, descartando a água quando terminada. Em seguida, conecte uma seringa de três mililitros cheia com tampão FRET.Lave as duas seringas de amostra com o tampão FRET movendo a unidade de seringa amostra para cima e para baixo várias vezes, descartando a água quando terminada. Agora, conecte uma seringa de três mililitros e carregue a primeira seringa de amostra, seringa A, com 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 no buffer FRET. Em seguida, gire a válvula de amostra para a posição de acionamento Também, conecte uma seringa de três mililitros à seringa B e carregue a seringa B com 100 nanomolar de FlASH CAND1 no buffer FRET e gire sua válvula para a posição de acionamento.Abra o painel de controle adquirido no software e regise a emissão de COL1-AMC ao longo de 60 segundos. Então, dê um único tiro. Encaixe a diminuição e os sinais fluorescentes medidos ao longo do tempo de cada tiro para uma única curva exponencial.Lave o sistema como mostrado anteriormente e adicione uma solução de 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 e 100 nanomolar FlASH CAND1 no buffer FRET em seringa A.Conecte-o ao sistema enquanto estiver na posição de preenchimento Carregue a seringa A e, em seguida, gire a válvula de amostra para a posição de acionamento. Em seguida, carregue uma solução de Skp1-Skp2 em seringa B.Conecte-a ao sistema enquanto estiver na posição de preenchimento. Carregue a seringa B e, em seguida, gire a amostra para a posição da unidade.No software, vá para adquirir e abrir o painel de controle. Configure o programa para registrar a emissão de COL1-AMC em 30 segundos. Então dê um único tiro.Os sinais de fluorescência aumentam ao longo do tempo após a mistura de soluções de seringa A e seringa B.Quando 70 nanomolars cada um de COL1-AMC e FlASH CAND1 foram misturados para gerar FRET, dois picos de emissão estavam presentes nos espectros de emissões. E o pico de COL1-AMC ficou mais baixo, e o pico do FlASH CAND1 tornou-se mais alto. Quando o cand1 de comprimento completo foi utilizado para fret o pico do doador mostrou uma redução de 10% na intensidade.No entanto, quando o CAND1 com sua primeira hélice truncada foi usado a redução da intensidade de pico do doador foi aumentada para 30% sugerindo maior eficiência de FRET Para confirmar que as mudanças de sinal foram resultantes de FRET entre COL1-AMC e FlASH CAND1, o DOADOR FRET foi misturado com o excesso de CAND1 não rotulado conhecido como Chase no acceptor. Como resultado, o pico do doador foi totalmente restaurado e o pico do aceitador foi diminuído. Mostrado aqui é um gráfico do valor K médio observado com a concentração CAND1 após análise de regressão linear.Para medir a constante do complexo, 50 nanomolar COL1-AMC foram utilizados em uma série de constantes de taxa de dissociação observadas foram medidas pela mistura de 50 nanomolar COL1-AMC com concentrações crescentes de FlASH CAND1. Semelhante à medição do on constante, a constante de dissociação observada de COL1 e CAND1 foi encontrada monitorando a restauração do sinal doador ao longo do tempo no fluorômetro de fluxo parado. Aqui o sinal do doador aumentou rapidamente e revelou um valor K observado de zero ponto quatro por segundo.Em contraste, quando o buffer foi adicionado ao complexo pré-montado, não foi observado aumento de sinal sugerindo que a rápida dissociação do COL1 CAND1 foi desencadeada pelo Skp1 Skp2. Certifique-se de minimizar a quantidade de luz a que o doador e as proteínas aceitadoras estão expostas. Tente manter fluoroforos no escuro o máximo possível.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Monitorando a Dinâmica da Interação Proteína-RNA In Vivo em Alta Resolução Temporal Usando χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Utilizando o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas resolvidas pelo tempo para identificar conformações locais estáveis Um monômero α-sinucleína de cada vez

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...