Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Мы благодарим Шу-Ou Шань (Калифорнийский технологический институт) за глубокий дискуссии о развитии assay ладу. М.г., ВМФ и X.L. финансировались запуска средств из Университета Пердью в ВМФ и X.L.This работы была частично поддержана семян грант от центра Университета Purdue для биологии растений.

1. дизайн assay ладу.
<ol><li>Скачайте файл структуры Cul1•Cand1 комплекс из банка данных белков (файл 1U6G).</li>
	<li>Просмотр структуры комплекса в PyMOL Cul1•Cand1.</li>
	<li>Используйте функцию измерения под меню Мастер PyMOL оценить расстояние между первой amino acid Cand1 и последней амино кислоты C...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li><li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+probing+disease+mechanisms+using+model+systems.">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).</li><li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cellular+protein-protein+interactions:+Technological+strategies+and+opportunities.">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li><li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple,+direct,+and+quantitative+in+vitro+binding+assays.">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).</li><li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+kinetic+studies+of+biological+interactions:+A+review.">Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).</li><li>Pierce, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1+promotes+assembly+of+new+SCF+complexes+through+dynamic+exchange+of+F+box+proteins.">Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins.</a> Cell. 153 (1), 206-215 (2013).</li><li>Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1-Mediated+Adaptive+Exchange+Mechanism+Enables+Variation+in+F-Box+Protein+Expression.">Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression.</a> Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).</li><li>Zheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cul1-Rbx1-Skp1-F+boxSkp2+SCF+ubiquitin+ligase+complex.">Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex.</a> Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).</li><li>Kleiger, G., Deshaies, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag+Team+Ubiquitin+Ligases.">Tag Team Ubiquitin Ligases.</a> Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1+binds+to+unneddylated+CUL1+and+regulates+the+formation+of+SCF+ubiquitin+E3+ligase+complex.">CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex.</a> Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).</li><li>Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+unneddylated+cullin+1+and+regulates+its+neddylation.">TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation.</a> FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).</li><li>Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+cullins+and+modulates+ubiquitin+ligase+activity.">TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).</li><li>Goldenberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cand1-Cul1-Roc1+complex+reveals+regulatory+mechanisms+for+the+assembly+of+the+multisubunit+cullin-dependent+ubiquitin+ligases.">Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases.</a> Cell. 119 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ETA2,+an+apparent+ortholog+of+the+human+cullin-interacting+protein+CAND1,+is+required+for+auxin+responses+mediated+by+the+SCF(TIR1)+ubiquitin+ligase.">Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase.</a> Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CAND1,+an+Unmodified+CUL1-Interacting+Protein,+Is+Involved+in+Multiple+Developmental+Pathways+Controlled+by+Ubiquitin/Proteasome-Mediated+Protein+Degradation.">Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation.</a> the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).</li><li>Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtCAND1,+a+HEAT-repeat+protein+that+participates+in+auxin+signaling+in+Arabidopsis.">AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).</li><li>Lo, S. -. C., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1-Mediated+Substrate+Adaptor+Recycling+Is+Required+for+Efficient+Repression+of+Nrf2+by+Keap1.">CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).</li><li>Okamoto, K., Sako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+FRET+for+the+study+of+protein+interactions+and+dynamics.">Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).</li><li>Hussain, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET).">An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET).</a> arXiv preprint. , (2009).</li><li>Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+and+purification+of+recombinant+SCF+ubiquitin+ligases.">High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases.</a> Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).</li><li>Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortagging:+A+versatile+method+for+protein+labeling.">Sortagging: A versatile method for protein labeling.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).</li><li>Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Protein+Labeling+via+Sortase-Mediated+Transpeptidation.">Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-PAGE+of+Proteins.">SDS-PAGE of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+E2-E3+Assembly+and+Disassembly+Enable+Processive+Ubiquitylation+of+Cullin-RING+Ubiquitin+Ligase+Substrates.">Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates.</a> Cell. 139 (5), 957-968 (2009).</li><li>Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Stopped-flow+Kinetics+Methods+to+Investigate+the+Mechanism+of+Action+of+a+DNA+Repair+Protein.">Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).</li><li>Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Stopped-Flow+Fluorescence+and+Labeled+Nucleotides+to+Analyze+the+ATP+Turnover+Cycle+of+Kinesins.">Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs.">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Lin, C. T., Rorabacher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+approach+for+stopped-flow+kinetics+of+fast+second-order+reactions+involving+inhomogeneity+in+the+reaction+cell.">Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell.</a> Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).</li><li>Toseland, C. P., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Reaction+Kinetic+Techniques.">Rapid Reaction Kinetic Techniques.</a> Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Lin, C. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase-catalyzed+site-specific+conjugation+of+small-molecule+probes+to+proteins+in+vitro+and+on+the+surface+of+living+cells.">Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+short+peptide+tag+for+versatile+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).</li><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+Basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+GTPase+movement+on+an+RNA+scaffold+drives+co-translational+protein+targeting.">Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting.</a> Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).</li></ol>

Лада-это физическое явление, которое представляет большой интерес для изучения и понимания биологических систем19. Здесь мы представляем собой протокол для тестирования и использования лад для изучения кинетики привязки двух взаимодействующих белков. При проектировании ...

В конечном счете биологическая деятельность осуществляется белков, Последнее из которых взаимодействовать с другими для надлежащего биологических функций. Используя вычислительный подход, общее количество белок белковых взаимодействий в человека оценивается в1~ 650 000, и нарушения этих взаимодействий часто приводит к заболеваниям2. Из-за их существенно важную роль в контроле процессов клеточной и научные многочисленные методы были разработаны для изучения взаимодействия протеин протеина, такие как дрожжи 2 гибрида, bimolecular флуоресценции комплементарности, Сплит Люцифераза дополнения и co иммунопреципитация пробирного3. Хотя эти методы являются хорошими на открытие и подтверждение белок белковых взаимодействий, они обычно неколичественного и таким образом предоставляют ограниченную информацию о сходство между взаимодействия партнеров белка. Количественные тянуть Даунс может использоваться для измерения сродство (например, Константа диссоциации Kd), но он не измерить кинетика привязки не могут быть применены, когда Kd очень низка из-за неадекватной Соотношение сигнал шум4. Спектроскопия резонанса (СРП) поверхностного плазмон количественно кинетики привязки, но она требует удельной поверхности и иммобилизация одной реагент на поверхности, которые потенциально могут изменить свойство привязки реагент5. Кроме того это трудно для СРП для измерения быстро ассоциации и диссоциации ставки5, и это не целесообразно использовать СРП для характеризуют событие обмена субблоков протеина в комплекс белков. Здесь мы описываем метод, который позволяет измерения количества белка сложные сборки и разборки в масштабе времени миллисекунду. Этот метод имеет важное значение для определения роли Cullin -ssociated -Nedd8 -дissociated белок 1 (Cand1) как F-box белка обмен фактор6,7.
Cand1 регулирует динамика Skp1•Cul1•F-бокс белка (SCF) E3 ligases, которые принадлежат к большой семье Каллин-кольцо убиквитин ligases. Заявок состоят из Каллин Cul1, который связывает кольцо домен белка Rbx1, и взаимозаменяемыми F-box белка, который вербует субстратов и связывает Cul1 через адаптер белок СКП18. Лигаза E3 SCF катализирует спряжение убиквитин к его основанию, а он активируется, когда субстрат завербован F-box белка, и когда Cul1 изменяется убиквитин подобных белков Nedd89. Cand1 связывает неизмененном Cul1, и после привязки, она разрушает как ассоциации белка Skp1•F-бокс с Cul1 и спряжение Nedd8 Cul110,11,12,13. В результате Cand1, по-видимому, ингибитор SCF активности в пробирке, но Cand1 дефицита в организмах причиной дефектов, которые предполагает позитивную роль Cand1 в регулировании деятельности компаний СКФ в vivo14,,1516 , 17. Этот парадокс объясняется наконец количественного исследования, которые показали динамического взаимодействия между Cul1, Cand1 и Skp1•F-бокс белка. С помощью флуоресценции резонанс энергии передачи (ЛАДА) анализов, которые обнаруживают формирования СКФ и Cul1•Cand1 комплексов, ассоциации и диссоциации оценить константы (kна и kот, соответственно) были измеряется в отдельности. Измерения показали, что Cand1 и Skp1•F-бокс белка форме крайне сжатые комплекс с Cul1, но kот SCF резко увеличивается на Cand1 и kот Cul1•Cand1 резко увеличилось Skp1•F-бокс белок6,7. Эти результаты обеспечивают поддержку первоначальных и критических для определения роли Cand1 как фактор обмена белков, который катализирует образование комплексов новых SCF путем переработки Cul1 от старых СКФ комплексами.
Здесь мы представляем процедура разработки и использования ладу assay для изучения динамики Cul1•Cand1 комплекс7, и тот же принцип может применяться для изучения динамики различных биомолекул. ЛАДУ происходит, когда донор возбужденных с соответствующей длины волны, и акцептора с перекрывающихся доноров спектр излучения спектра возбуждения присутствует на расстоянии 10-100 Å. Возбужденное состояние передается акцептор, тем самым уменьшается интенсивность доноров и увеличения интенсивности акцептора18. Эффективность ладу (E) зависит от радиуса Фёрстер (R0) и расстояние между доноров и акцепторов флуорофоров (r) и определяется: E = R06/ (R0 6 + r6). Радиус Фёрстер (R0) зависит от нескольких факторов, включая угловые ориентацию диполя, спектральные совпадения донорно акцепторной пара и решение используется19. Применять assay ладу на остановился потока fluorimeter, который отслеживает изменения выбросов доноров в режиме реального времени и обеспечивает измерение быстро kна и kот, необходимо создать эффективный ладу, приводит к значительному сокращению выбросов доноров. Таким образом проектирование эффективных ладу, выбрав соответствующие пары флуоресцентных красителей и сайтов на целевых белков прикрепить красители имеет важное значение и будут обсуждаться в настоящем Протоколе.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

Белки являются основным операторам биологических систем, и они обычно взаимодействуют с другими макро - или малых молекул выполнять свои биологические функции. Такое взаимодействие может быть высокодинамичный, означает взаимодействующих подразделений постоянно связаны и отделить некоторые ставкам. В то время как измерения сродство с использованием методов, таких как количественные выпадающем показывает силу взаимодействия, изучение кинетики привязки предоставляет информацию о том, как быстро происходит взаимодействие и как долго каждый комплекс может существовать. Кроме того, измерения кинетика взаимодействия присутствии дополнительным фактором, как фактор обмена белков или наркотиков, помогает раскрыть механизм, по которому взаимодействие регулируется другим фактором, предоставляя важные знания для улучшения биологических и медицинских исследований. Здесь мы описываем протокол для измерения кинетики привязки комплекс белков, который имеет высокое внутренне присущей ей связи скорость и может быть отделен быстро по другим белком. Этот метод использует передачи энергии резонансная флюоресценция сообщить формирования комплекса белков в пробирке, и позволяет мониторинга быстро ассоциации и диссоциация комплекса в режиме реального времени на fluorimeter остановить поток. Используя этот assay, количественно ассоциации и диссоциации константы скорости комплекс белков.

Для тестирования в ладу между Cul1КУА и FlAsHCand1, мы сначала определили интенсивности выбросов 70 нм Cul1AMC (донора) и 70 нм FlAsHCand1 (акцептор), соответственно (Рисунок 3А-C, синие линии). В каждом анализе только один пик выбросов был п?...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Белок белковых взаимодействий являются критическими для биологических систем, и исследования кинетики привязки обеспечивают понимание динамики и функции белковых комплексов. Мы описываем метод, который дает количественную оценку кинетических параметров белкового комплекса, с помощью передачи энергии резонансной флюоресценции и остановить поток техники.

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Наш метод помогает изучить кинетику формирования белкового комплекса. В нем описывается, насколько плотным является белковый комплекс, и если образованию белкового комплекса мешают другие белки. Этот метод позволяет изучать белково-белковое взаимодействие в количественном выражении, используя флуоресценцию в качестве репортера, наш анализ может контролировать ассоциацию и диссоциацию белкового комплекса в режиме реального времени.Для начала спроектировать анализ FRET, начиная с данных для комплекса COL1 CAND1 из базы данных белков. Загрузите структуру в PyMOL, а затем перейдите в меню мастера и используйте функцию измерения для оценки расстояния между первой аминокислотой CAND1 и последней аминокислотой COL1. Затем загрузите онлайн-зрителя спектра и просматривать возбуждение и выброс спектры 7-амино-4-метилкумарин и FlASH одновременно.AMC является донором FRET, а FlASH является принимаеттелем FRET. Подготовка клеток с донорским белком FRET, следуя вместе в сопроводительном текстовом протоколе. Затем очистите комплекс сортазы COL1 RBX1, сначала добавив 50 миллилитров буфера лиза в гранулы клеток E.Coli, выражаюющих комплекс сортазы COL1 RBX1.Лед клеток на льду с sonication на 50%амплитуды. Чередуйте питание в течение трех минут, чтобы он был на одну секунду, а затем одну секунду, чтобы предотвратить перегрев образца. Перенесите полученный лисат клетки в 50-миллилитровую центрифугирующую трубку и удалите клеточный мусор путем центрифугации при 25 000 раз г в течение 45 минут.Затем добавьте супернатант в пять миллилитров глутатиона и инкубировать их при четырех градусах по Цельсию, чтобы очистить клетку лизатом. После инкубации центрифуга бисерной лисной смеси при 1500 раз г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Затем удалите супернатант.Затем вымойте бусинки 5 миллилитров буфера лиза, не имеющих ингибитора протеазы. После центрифугирования раствора удалите супернатант. Теперь добавьте три миллилитров буфера лиза в вымытые бусы и перенесите суспензию из бисера в пустую колонку.К новому столбецу также добавьте пять миллилитров буфера elution, а затем инкубировать столбец в течение 10 минут и соберите элуат. Затем добавьте 200 микролитров тромбина по пять миллиграммов на миллилитр в элуат из глутатиона. После ночной инкубации при четырех градусах цельсия разбавляют образец белка в три раза буфером A.Load образец белка в буфер равновесный катионный столб обмена хроматографии в нулевой точке пять миллилитров в минуту.Затем добавьте градиент от нуля до 50% буфера B в буферЕ А, чтобы утоить белок со скоростью потока 1 миллилитр в минуту. Затем объединить элуатные фракции, содержащие донорский белок FRET, и сконцентрировать его до двух точки пять миллилитров с помощью ультрафильтрационной мембраны с 30 килодальтон отсечения. Теперь добавьте 7-амино-4-метилкумарин в c-терминус COL1 через сортированную опосредованную транспептидуцию, сначала изменив буфер в образце донорского белка FRET в буфер сорта с помощью демаркации колонки.Для этого сначала обвясть десалирование столбца с 25 миллилитров буфера сортировки. Затем загрузите две точки пять миллилитров раствора белка донора FRET в столбец и отбросьте поток через. Далее, elute образец с тремя точками пять миллилитров буфера сортировки и собирать поток через.В 900 микролитров элуата добавьте 100 микролитров 600 микромоляров очищенного раствора сорта А и 10 микролитров пептида 25 миллимолярной GGGG-AMC. Инкубировать реакционной смеси при 30 градусах по Цельсию в темное время суток для создания COL1-AMC-RBX1. Теперь загрузите весь образец на столбец хроматографии исключения размера и уроните его одной точкой, в пять раз больше объема буфера столбца.В конце концов, объединить eluate фракций, содержащих COL1-AMC-RBX1. Следуйте вместе в текстовом протоколе, чтобы подготовить белок-приемник FRET. Многие из этих шагов аналогичны препарату белка донора FRET.После завершения подготовки решения FlASH CAND1. Во-первых, добавьте один микролитр раствора FlASH в 50 микролитров свежеприготовленного раствора tetra-cys-CAND1. Смешайте комбинированные растворы хорошо и инкубировать смесь при комнатной температуре в темноте в течение одного-двух часов, чтобы сформировать раствор FlASH CAND1.В 300 микролитров буфера FRET добавьте COL1-AMC-RBX1 в окончательную концентрацию 70 наномоляров и перенесите раствор в кюветт. Поместите кювет в образец держателя фторометра. Возбуждайте образец 350 нанометровый свет возбуждения и сканируйте сигналы излучения от 400 до 600 нанометров с шагом в один нанометр.Затем, в 300 микролитров буфера FRET, добавьте COL1-AMC-RBX1 и FlASH-CAND1 к окончательной концентрации 70 наномоляров. Возбуждайте образец 350 нанометровый свет возбуждения и сканируйте сигналы излучения с 400-600 нанометров с шагом в один нанометр. Установите свет возбуждения на 350 нанометров и используйте фильтр пропуска полосы, который позволяет 450 нанометров излучения света пройти и блокирует от 500 до 650 нанометров излучения света.С образцом клапанов в положении заполнения подключите трехми миллилитровый шприц, наполненный водой. Затем, мыть два образца шприцев с водой, перемещая образец шприца диск вверх и вниз несколько раз, отбрасывая воду, когда закончите. Затем соедините трехмилитрный шприц, наполненный буфером FRET.Вымойте два образца шприцев с буфером FRET, перемещая образец шприца диск вверх и вниз несколько раз, отбрасывая воду, когда закончил. Теперь подключите трехмилитрный шприц и загрузите первый образец шприца, шприц А, со 100 наномолярными COL1-AMC-RBX1 в буфере FRET. Затем поверните образец клапана в положение привода Также, подключите трехми миллилитровый шприц к шприцу B и загрузите шприц B со 100 наномоляром FlASH CAND1 в буфере FRET и поверните его клапан в положение привода.Откройте панель управления под приобрести в программном обеспечении и записывать выбросы COL1-AMC в течение 60 секунд. Затем сделай один выстрел. Fit снижение и флуоресцентные сигналы, измеренные с течением времени от каждого выстрела до одной экспоненциальной кривой.Вымойте систему, как показано ранее, а затем добавить раствор из 100 наномолярных COL1-AMC-RBX1 и 100 наномолярных FlASH CAND1 в буфере FRET в шприц A.Connect его к системе, пока он находится в положении заполнения Нагрузка шприц, а затем превратить образец клапана в положение привода. Затем загрузите раствор Skp1-Skp2 в шприц B.Connect его к системе, пока он находится в положении заполнения. Загрузите шприц B, а затем поверните образец в положение привода.В программном обеспечении, перейдите на приобретение и открыть панель управления. Настройка программы для записи выбросов COL1-AMC в течение 30 секунд. Тогда сделай один выстрел.Сигналы флуоресценции увеличиваются с течением времени после смешивания растворов из шприца А и шприца B.When 70 наномолярных каждый из COL1-AMC и FlASH CAND1 были смешаны для генерации FRET, два пика выбросов присутствовали в спектрах выбросов. И пик COL1-AMC стал ниже, и пик FlASH CAND1 стал выше. Когда полная длина CAND1 была использована для FRET пик доноров показал 10%-ное снижение интенсивности.Однако, когда CAND1 с его первой усеченной спирали был использован снижение пиковой интенсивности донора было увеличено до 30%, предполагая более высокую эффективность FRET Чтобы подтвердить, что изменения сигнала были результатом FRET между COL1-AMC и FlASH CAND1, донор FRET был смешан с избытком необнаменных CAND1 известный как Чейз в приемщике. В результате пик доноров был полностью восстановлен, а пик принятия был снижен. Здесь показан график среднего наблюдаемого значения K с концентрацией CAND1 после линейного регрессионного анализа.Для измерения на постоянной основе комплекса, 50 наномолярных COL1-AMC был использован в серии наблюдаемых констант скорости диссоциации были измерены путем смешивания 50 наномолярных COL1-AMC с увеличением концентрации FlASH CAND1. Как и при измерении на постоянной, наблюдаемая диссоциация константы COL1 и CAND1 была обнаружена путем мониторинга восстановления донорского сигнала с течением времени на остановленном потоке флюорометра. Здесь сигнал донора быстро увеличился, и он показал наблюдаемое значение K нулевой точки четыре в секунду.В отличие от этого, когда буфер был добавлен в предварительно собранный комплекс, не было отмечено увеличения сигнала, предполагая, что быстрая диссоциация COL1 CAND1 была вызвана Skp1 Skp2. Убедитесь в том, чтобы свести к минимуму количество света донора и принимает белка подвергаются воздействию. Старайтесь держать фторфоры в темноте как можно больше.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Мониторинг динамики взаимодействия белок-РНК in vivo при высоком временном разрешении с использованием χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Использование флуоресценции с временным разрешением, вызванного белком, для идентификации стабильных локальных конформаций по одному мономеру синуклеина α за раз

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Исследование переноса энергии флуоресценции одной молекулы синтеза белка рибосомы

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...