Name: using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Vi tackar Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) för insiktsfull diskussion om utvecklingen av bandet analysen. M.G., Y.Z. och X.L. har finansierats genom start medel från Purdue University till Y.Z. och X.L.This arbete var stöds delvis av ett frö bidrag från Purdue University Center för växtbiologi.

1. design bandet analysen.
<ol><li>Hämta filen strukturen av den komplexa Cul1•Cand1 från Protein Data Bank (filen 1U6G).</li>
	<li>Visa strukturen för Cul1•Cand1 komplex i PyMOL.</li>
	<li>Använd funktionen mätning under menyn guiden för PyMOL för att uppskatta avståndet mellan den första aminosyran i Cand1 och den sista aminosyran i Cul1 (figur 1).</li>
	<li>Ladda online spectra betraktaren (se Tabell av material) och Visa e...

<ol>
	<li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li><li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+probing+disease+mechanisms+using+model+systems.">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).</li><li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cellular+protein-protein+interactions:+Technological+strategies+and+opportunities.">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li><li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple,+direct,+and+quantitative+in+vitro+binding+assays.">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).</li><li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+kinetic+studies+of+biological+interactions:+A+review.">Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).</li><li>Pierce, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1+promotes+assembly+of+new+SCF+complexes+through+dynamic+exchange+of+F+box+proteins.">Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins.</a> Cell. 153 (1), 206-215 (2013).</li><li>Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cand1-Mediated+Adaptive+Exchange+Mechanism+Enables+Variation+in+F-Box+Protein+Expression.">Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression.</a> Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).</li><li>Zheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cul1-Rbx1-Skp1-F+boxSkp2+SCF+ubiquitin+ligase+complex.">Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex.</a> Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).</li><li>Kleiger, G., Deshaies, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag+Team+Ubiquitin+Ligases.">Tag Team Ubiquitin Ligases.</a> Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1+binds+to+unneddylated+CUL1+and+regulates+the+formation+of+SCF+ubiquitin+E3+ligase+complex.">CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex.</a> Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).</li><li>Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+unneddylated+cullin+1+and+regulates+its+neddylation.">TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation.</a> FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).</li><li>Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP120A+associates+with+cullins+and+modulates+ubiquitin+ligase+activity.">TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).</li><li>Goldenberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Cand1-Cul1-Roc1+complex+reveals+regulatory+mechanisms+for+the+assembly+of+the+multisubunit+cullin-dependent+ubiquitin+ligases.">Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases.</a> Cell. 119 (4), 517-528 (2004).</li><li>Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ETA2,+an+apparent+ortholog+of+the+human+cullin-interacting+protein+CAND1,+is+required+for+auxin+responses+mediated+by+the+SCF(TIR1)+ubiquitin+ligase.">Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase.</a> Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CAND1,+an+Unmodified+CUL1-Interacting+Protein,+Is+Involved+in+Multiple+Developmental+Pathways+Controlled+by+Ubiquitin/Proteasome-Mediated+Protein+Degradation.">Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation.</a> the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).</li><li>Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtCAND1,+a+HEAT-repeat+protein+that+participates+in+auxin+signaling+in+Arabidopsis.">AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).</li><li>Lo, S. -. C., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAND1-Mediated+Substrate+Adaptor+Recycling+Is+Required+for+Efficient+Repression+of+Nrf2+by+Keap1.">CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).</li><li>Okamoto, K., Sako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+FRET+for+the+study+of+protein+interactions+and+dynamics.">Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).</li><li>Hussain, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET).">An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET).</a> arXiv preprint. , (2009).</li><li>Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+and+purification+of+recombinant+SCF+ubiquitin+ligases.">High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases.</a> Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).</li><li>Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortagging:+A+versatile+method+for+protein+labeling.">Sortagging: A versatile method for protein labeling.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).</li><li>Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Protein+Labeling+via+Sortase-Mediated+Transpeptidation.">Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-PAGE+of+Proteins.">SDS-PAGE of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+E2-E3+Assembly+and+Disassembly+Enable+Processive+Ubiquitylation+of+Cullin-RING+Ubiquitin+Ligase+Substrates.">Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates.</a> Cell. 139 (5), 957-968 (2009).</li><li>Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Stopped-flow+Kinetics+Methods+to+Investigate+the+Mechanism+of+Action+of+a+DNA+Repair+Protein.">Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).</li><li>Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Stopped-Flow+Fluorescence+and+Labeled+Nucleotides+to+Analyze+the+ATP+Turnover+Cycle+of+Kinesins.">Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs.">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Lin, C. T., Rorabacher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+approach+for+stopped-flow+kinetics+of+fast+second-order+reactions+involving+inhomogeneity+in+the+reaction+cell.">Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell.</a> Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).</li><li>Toseland, C. P., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Reaction+Kinetic+Techniques.">Rapid Reaction Kinetic Techniques.</a> Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Lin, C. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase-catalyzed+site-specific+conjugation+of+small-molecule+probes+to+proteins+in+vitro+and+on+the+surface+of+living+cells.">Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+short+peptide+tag+for+versatile+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).</li><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+Basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1&#945;.">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1&#945;.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+GTPase+movement+on+an+RNA+scaffold+drives+co-translational+protein+targeting.">Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting.</a> Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).</li></ol>

BANDET är ett fysiskt fenomen som är av stort intresse för att studera och förstå biologiska system19. Här presenterar vi ett protokoll för att testa och använda bandet för att studera bindande kineticsen av två samverkande proteiner. När du utformar FRET, ansåg vi tre viktiga faktorer: spektrala överlappningen mellan givare utsläpp och acceptor excitation, avståndet mellan de två fluorophores och dipol orientering i fluorophores28. Välj fluorophores för b...

Biologiska aktiviteter utförs i slutändan av proteiner, mest som interagerar med andra för korrekt biologiska funktioner. Med en tillämpad metod, den totala mängden protein-protein interaktioner i mänskliga uppskattas till ~ 650,0001, och störningar av interaktionerna ofta leder till sjukdomar2. På grund av deras viktiga roller i styr cellulära och organismers processer, har många metoder utvecklats för att studera protein-protein interaktioner, såsom jäst-två-hybrid, bimolecular fluorescens komplettering, split-luciferas komplettering och co-immunoprecipitation assay3. Medan dessa metoder är bra på att upptäcka och bekräfta protein-protein interaktioner, de är vanligtvis icke-kvantitativa och således ger begränsad information om samhörigheten mellan de samverkande partnerna som protein. Kvantitativa rullgardinsmenyerna kan användas för att mäta affinitet (t.ex. dissociationskonstant Kd), men den mäter inte kineticsen av bindningen, inte heller kan det tillämpas när den Kd är mycket låg på grund av en otillräcklig signal-brus-förhållande4. Ytan plasmon resonans (SPR) spektroskopi kvantifierar bindande kinetik, men det kräver en specifik yta och immobilisering av en reaktant på ytan, vilket potentiellt kan ändra egenskapen bindande av reaktant5. Dessutom är det svårt för SPR att mäta snabb association och dissociation priser5, och det är inte lämpligt att använda SPR för att karakterisera i händelse av utbyte av proteinsubenheter i ett proteinkomplex. Här beskriver vi en metod som möjliggör mätning av protein komplex sammansättnings- och uppdelningsorder på en millisekund tidsskala. Denna metod var nödvändigt för att fastställa Cullin -enmarknadsbedömningar -Nedd8 -dissociated protein 1 (Cand1) roll som F-låda protein exchange faktor6,7.
Cand1 reglerar dynamiken i Skp1•Cul1•F-box protein (SCF) E3 ligases, som tillhör den stora familjen av Cullin-RING ubiquitin ligases. SCFs består av den cullin Cul1, som binder proteinet RING domän Rbx1, och en utbytbar F-låda-protein, som rekryterar substrat och binder Cul1 via adapter proteinet Skp18. Som en E3-ligase, SCF katalyserar konjugationen av ubiquitin till dess substrat, och det aktiveras när substratet rekryteras av proteinet F-låda, och när Cul1 ändras av ubiquitin-liknande proteinet Nedd89. Cand1 binder oförändrad Cul1, och vid bindning, det stör både Föreningen för Skp1•F-box protein med Cul1 och konjugationen av Nedd8 till Cul110,11,12,13. Som ett resultat, Cand1 tycktes vara en hämmare av SCF aktivitet in vitro-, men Cand1 brist i organismer orsakade defekter som tyder på en positiv roll för Cand1 reglera SCF aktiviteter i vivo14,15,16 , 17. denna paradox förklarades slutligen av en kvantitativ studie som avslöjade de dynamiska samspel mellan Cul1, Cand1 och Skp1•F-box protein. Med hjälp av fluorescens resonans energi överföring (bandet) analyser som upptäcka bildandet av SCF och Cul1•Cand1 komplex, föreningen och dissociation Betygsätt konstanter (kpå och koff, respektive) var mäts individuellt. Mätningarna visade att både Cand1 och Skp1•F-box protein form extremt tight komplex med Cul1, men det koff av SCF är dramatiskt ökade Cand1 och den koff av Cul1•Cand1 är dramatiskt ökat av Skp1•F-box protein6,7. Dessa resultat ger det ursprungliga och kritiska stödet för att definiera rollen av Cand1 som en protein exchange faktor, som katalyserar bildandet av nya SCF komplex genom återvinning Cul1 från de gamla SCF-komplex.
Här presenterar vi förfarandet för att utveckla och använda bandet analysen för att studera dynamiken i den komplexa Cul1•Cand1-7, och samma princip kan användas för att studera dynamiken i olika biomolekyler. FRET uppstår när en donator är glada med lämplig våglängd och en acceptor med excitation spektrum överlappande den givaren emissionsspektrum finns inom ett avstånd av 10-100 Å. Upphetsad staten överförs till den acceptor, därmed minskar givare intensiteten och ökande intensitet acceptanten18. (E) bandet effektivitet beror på både Förster radien (R0) och avståndet mellan givaren och acceptor fluorophores (r), och definieras av: E = R06/ (R0 6 (+ r6). Förster radien (R0) beror på några faktorer, inklusive dipol kantiga orientering, spektrala överlappningen av givare-acceptor paret, och lösningen används19. För att applicera bandet analysen på en stoppad-flow fluorimeter, som övervakar ändringen av givare utsläpp i realtid och möjliggör mätningar av snabba kpå och koff, det är nödvändigt att fastställa effektiva bandet som resulterar i en betydande minskning av givare utsläpp. Därför utforma effektiva bandet genom att välja den lämpliga par fluorescerande färgämnen och platser på target proteiner att fästa färgämnena är viktigt och kommer att diskuteras i detta protokoll.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505301</td>
			<td>HiTrap Q FF anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C78-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17505401</td>
			<td>HiTrap SP Sepharose FF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (high speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J2-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge (low speed)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>J6-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroMax fluorimeter</td>
			<td>HORIBA</td>
			<td>FluoroMax-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGGGAMC peptide</td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td>custom synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-4T-2 vector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28954550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced glutathione</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta Competent Cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70953-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 10/300 GL column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopped-flow fluorimeter</td>
			<td>Hi-Tech Scientific</td>
			<td>SF-61 DX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP&#183;HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC903008</td>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro fluorescence resonance energy transfer to study the dynamics of protein complexes at a millisecond time scale

Proteiner är de primära aktörerna av biologiska system, och de interagerar oftast med andra makro- eller små molekyler att utföra deras biologiska funktioner. Sådana interaktioner kan vara mycket dynamisk, vilket innebär samverkande subunitsna ständigt associerade och dissocierade på vissa priser. Medan mäta det affinitet med tekniker såsom kvantitativa nedrullningsbara avslöjar styrkan i interaktionen, studera bindande kinetik ger insikter om hur snabba de inträffar och hur länge varje komplex kan existera. Dessutom mäta kineticsen av en interaktion i närvaro av ytterligare en faktor, såsom en protein exchange faktor eller en drog, hjälper till att avslöja den mekanism genom vilken samverkan regleras i den andra faktorn, som ger viktig kunskap för de befordran av biologisk och medicinsk forskning. Här beskriver vi ett protokoll för mätning av bindande kineticsen av ett proteinkomplex som har en hög inneboende association och snabbt kan särskiljas genom ett annat protein. Metoden använder fluorescens resonans energiöverföring för att rapportera bildandet av protein komplex in vitro-, och det möjliggör övervakning snabb föreningen och dissociation av anläggningen i realtid på en stoppad-flow fluorimeter. Med denna analys, är i föreningen och dissociation konstanter av protein komplex kvantifierade.

Att testa bandet mellan Cul1AMC och FlAsHCand1, vi först bestäms utsläpp intensiteten av 70 nM Cul1AMC (givaren) och 70 nM FlAsHCand1 (acceptorn), respektive (figur 3A-C, blå linjer). I varje analys bara ett utsläpp peak var närvarande, och utsläppen av FlAsHCand1 var (acceptorn) låg. När 70 nM varje Cul1AMC och FlAsHCand1 blandades för att generera FRET, t...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale at JoVE.com

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein-protein interaktioner är avgörande för biologiska system, och studier av den bindande kineticsen tillföra insikter och dynamik och funktion av proteinkomplex. Vi beskriver en metod som kvantifierar de kinetiska parametrarna i ett proteinkomplex med fluorescens resonans energiöverföring och slutat-flow teknik.

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Vår metod hjälper till att studera kinetiken hos en proteinkomplexbildning. Den beskriver hur tätt ett proteinkomplex är, och om proteinkomplexbildningen störs av andra proteiner. Denna teknik möjliggör studier protein-protein interaktion på kvantitativt sätt med hjälp av fluorescens som reporter, vår analys kan övervaka association och disassociation av ett proteinkomplex i realtid.Till att börja med utforma FRET-analysen som börjar med data för COL1 CAND1-komplexet från proteindatabasen. Ladda strukturen i PyMOL, och gå sedan till guiden menyn och använda mätfunktionen för att uppskatta avståndet mellan den första aminosyran av CAND1 och den sista aminosyran av COL1. Sedan, ladda online spektra viewer och visa excitation och utsläpp spektra av 7-amino-4-methylcoumarin och FlASH samtidigt.AMC är FRET-donatorn och FlASH är FRET-acceptorn. Förbered celler med FRET-givarproteinet genom att följa med i det medföljande textprotokollet. Sedan, rena COL1 sortase RBX1 komplex genom att först lägga till 50 milliliter av lysbuffert till en pellet av E.Coli celler uttrycker COL1 sortase RBX1 komplex.Is cellerna på is med ultraljudsbehandling vid 50%amplitud. Växla in strömmen i tre minuter så att den är på en sekund och sedan en sekunds av för att förhindra överhettning av provet. Överför den resulterande cellen lysate i en 50 milliliter centrifuger röret och avlägsna cellen skräp genom centrifugeringen vid 25, 000 gånger g i 45 minuter.Tillsätt sedan supernatanten till fem milliliter glutationpärlor och inkubera dem i fyra grader Celsius för att rensa cellen lysate. Efter inkubation, centrifug pärlan lysate blandningen vid 1, 500 gånger g i två minuter vid fyra grader Celsius. Ta sedan bort supernatanten.Därefter tvätta pärlorna med 5 milliliter av lysbuffert som inte har någon proteashämmare. Efter centrifugering av lösningen, ta bort supernatanten. Nu, tillsätt tre milliliter av lysbuffert till de tvättade pärlorna och överför pärlans slurry till en tom kolonn.Till den nya kolumnen, också lägga till fem milliliter eluer buffert och sedan inkubera kolumnen i 10 minuter och samla eluat. Därefter lägger du till 200 mikroliter trombin vid fem milligram per milliliter till eluatet från glutationpärlorna. Efter en inkubation över natten vid fyra grader späder Celsius ut proteinprovet tre gånger med buffert A.Ladda proteinprovet till en buffert A-ekvilotisk katjonekrografikolumn vid nollpunkt fem milliliter per minut.Lägg sedan till en gradient på noll till 50%av buffert B i buffert A för att elera proteinet med en flödeshastighet på 1 milliliter per minut. Därefter poola eluat fraktioner som innehåller FRET givaren protein och koncentrera den ner till två punkt fem milliliter med hjälp av en ultrafiltrering membran med en 30 kilodalton cutoff. Nu, tillsätt 7-amino-4-methylcoumarin till c-ändstationen col1 genom sortase medierad transpeptidation genom att först ändra bufferten i FRET givaren proteinprovet i sortas buffert med hjälp av en desalting kolumn.För att åstadkomma detta, först jämvikt en desaltning kolumn med 25 milliliter av sortase buffert. Sedan, ladda två punkt fem milliliter av FRET givaren proteinlösning i kolumnen och kasta flödet igenom. Därefter elute provet med tre punkt fem milliliter av sortas buffert och samla flödet genom.I 900 mikroliter av eluatet, tillsätt 100 mikroliter av 600 mikromolar renad sortas A-lösning och 10 mikroliter av en 25 millimolar GGGG-AMC peptid. Inkubera reaktionsblandningen vid 30 grader Celsius i mörkret över natten för att generera COL1-AMC-RBX1. Nu, ladda alla av provet på storlek uteslutningskromatografi kolumn och elute den med en punkt fem gånger kolumnvolymen av buffert.I slutändan poola eluat fraktioner som innehåller COL1-AMC-RBX1. Följ med i textprotokollet för att förbereda FRET-acceptorproteinet. Många av stegen liknar FRET givaren protein preparat.När du är klar, förbereda FlASH CAND1 lösning. Lägg först till en mikroliter av FlASH-lösningen till 50 mikroliter av den nyberedda tetra-cys-CAND1-lösningen. Blanda de kombinerade lösningarna väl och inkubera blandningen i rumstemperatur i mörker i en till två timmar för att bilda FlASH CAND1-lösningen.I 300 mikroliter av FRET-buffert, tillsätt COL1-AMC-RBX1 till en slutlig koncentration av 70 nanomolar och överför lösningen till en cuvette. Placera cuvette i provhållaren av en fluoriometer. Excitera provet med 350 nanometeruppgärningsljus och skanna utsläppssignalerna från 400 till 600 nanometer vid en nanometersteg.Sedan, i 300 mikroliter av FRET buffert, lägga till både COL1-AMC-RBX1 och FlASH-CAND1 till en slutlig koncentration av 70 nanomolar. Excitera provet med 350 nanometeruppytande ljus och skanna utsläppssignalerna från 400-600 nanometer vid en nanometersteg. Ställ excitationsljuset på 350 nanometer och använd ett bandpassfilter som gör att 450 nanometers utsläppsljus kan passera och blockerar 500 till 650 nanometereemissionsljus.Med provventilerna vid påfyllningspositionen anslut en tre milliliterspruta fylld med vatten. Sedan, tvätta de två provsprutorna med vatten genom att flytta provsprutan köra upp och ner flera gånger, kasta vattnet när det är klart. Därefter ansluter du en tre milliliter spruta fylld med FRET buffert.Tvätta de två provsprutorna med FRET-bufferten genom att flytta provsprutan upp och ner flera gånger, kasta vattnet när det är klart. Nu, anslut en tre milliliter spruta och ladda den första provsprutan, spruta A, med 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 i FRET-bufferten. Vrid sedan provventilen till drivläget Också, anslut en tre milliliterspruta till spruta B och ladda spruta B med 100 nanomolar av FlASH CAND1 i FRET-bufferten och vrid dess ventil till drivpositionen.Öppna kontrollpanelen under förvärva i programvaran och registrera utsläpp av COL1-AMC under loppet av 60 sekunder. Ta sedan ett enda skott. Montera minskningen och de fluorescerande signalerna som mättes över tiden från varje skott till en enda exponentiell kurva.Tvätta systemet som tidigare visats och lägg sedan till en lösning på 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 och 100 nanomolar FlASH CAND1 i FRET-bufferten till spruta A.Anslut den till systemet medan den är i påfyllningsläge Ladda spruta A och vrid sedan provventilen till drivläget. Därefter laddar du en lösning av Skp1-Skp2 i spruta B.Anslut den till systemet medan den är i påfyllningspositionen. Ladda spruta B och vrid sedan provet till drivläget.I programvaran, gå att förvärva och öppna kontrollpanelen. Ställ in programmet för att registrera utsläpp av COL1-AMC under 30 sekunder. Ta ett enda skott då.Fluorescenssignalerna ökar med tiden efter blandningslösningar från spruta A och spruta B.När 70 nanomolar vardera av COL1-AMC och FlASH CAND1 blandades för att generera FRET, fanns två utsläppstoppar i emissionsspektra. Och toppen av COL1-AMC blev lägre, och toppen av FlASH CAND1 blev högre. När den fulla längden CAND1 användes för FRET givaren topp visade en 10%minskning av intensitet.Men när CAND1 med sin första helix trunkerade användes minskningen av givaren topp intensitet ökades till 30%tyder på högre FRET effektivitet För att bekräfta att signalen förändringar var resulterat från FRET mellan COL1-AMC och FlASH CAND1, givaren FRET blandades med överskott omärkta CAND1 känd som Chase i acceptor. Som ett resultat av givaren topp var helt återställd och acceptor topp minskades. Visas här är en tomt av det genomsnittliga observerade K-värdet med CAND1 koncentrationen efter linjär regressionsanalys.För att mäta den på konstanten av komplexet, 50 nanomolar COL1-AMC användes i en serie observerade dissociation hastighet konstanter mättes genom att blanda 50 nanomolar COL1-AMC med ökande koncentrationer av FlASH CAND1. Liknar mätningen av den på konstant, konstaterades den observerade dissociation konstanten av COL1 och CAND1 genom att övervaka återställandet av givaren signal över tiden på den stoppade flödet fluorometer. Här givaren signalen ökat snabbt och det visade en observerad K värdet av noll punkt fyra per sekund.Däremot, när buffert lades till den pre monterade komplexa, observerades ingen signal ökning tyder på snabb dissociation av COL1 CAND1 utlöstes av Skp1 Skp2. Se till att minimera mängden ljus givaren och acceptor proteiner utsätts för. Försök att hålla fluoroforer i mörker så mycket som möjligt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescensanisotropi som ett verktyg för att studera protein-proteininteraktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Använda tidsupplöst proteininducerad fluorescensförbättring för att identifiera stabila lokala konformationer en α-synukleinmonomer i taget

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enmolekyl fluorescens energiöverföringsstudie av ribosomproteinsyntes

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...