Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel

Hier tonen we een hoge inhoud receptor handel test die compatibel is met primaire neuronale cultuur voorbereiding. Deze methode labelt afzonderlijk het oppervlak een inter kelder receptor zwembaden van vaste neuronen. Het mogelijk maken van de presentatie van gegevens als een verhouding van genormaliseerd oppervlak of geïnternaliseerde receptordichtheid tot de totale dichtheid van die receptor.

De hoge inhoud en receptor handel test biedt een uitgevoerde middelen voor het meten van bulk veranderingen in receptoren handel profielen binnen een neuraal netwerk in reactie op verschillende factoren. Het verbruiken veel minder tijd en materialen dan alternatieve methoden. Verstoringen en in preceptors handel zijn gekoppeld aan meerdere neurologische aandoeningen, en worden beschouwd als een aantrekkelijk doelwit voor medicamenteuze therapie.

Voor voorbeelden studies hebben aangetoond dat een van de vroegste tekenen van de ziekte van Alzheimer is synaptisch verlies en verminderde synaptische en preceptor zwembaden. Deze techniek vereist veel verschillende stappen van verschillende moeilijkheidsgraad. Vooral omdat het hanteren van de 96 goed plaat en het manipuleren van de putten kan moeilijk blijken voor iemand zonder ervaring.

En omdat de resultaten van het experiment zeer gevoelig zijn voor onjuiste behandeling, is het handig om de verschillende stappen die worden uitgevoerd te bekijken. Instructeur Om te beginnen, voeden de neuronen in de 96 put plaat door het verwijderen van 100 microliters van de reeds bestaande media uit elke put. En het vervangen door 100 microliters van media voorverwarmd tot 37 graden Celsius.

Elke drie tot vier dagen. Een dag in vitro 14, gebruik een multi-pipet om 100 microliters van de media te verwijderen uit elke put en de media te bundelen. Voeg twee microliters TTX Stock-oplossing toe aan een milliliter van de gepoolde geconditioneerde media om een vier micromolaroplossing van TTX te creëren.

Behandel de neuronen in elke put met 100 microliters van vier micromolar TTX-oplossing. Als er niet genoeg gepoolde conditie media voeg een aantal van de eerder opgeslagen media. Incubeer in een 5%CO2 incubator bij 37 graden Celsius gedurende vier uur.

Verwijder hierna de bestaande TTX met media en voeg 200 microliter voorverwarmde neuronale media toe en broed de microplaat vijftien minuten lang bij kamertemperatuur uit. Verwijder eerst de neuronale media van de microplaat. Voeg vijftig microliter van de anti gluA1 of anti gluA2 antilichaam oplossing toe aan de overeenkomstige putten van de microplaat.

Voeg vijftig microliters van neuronale media toe aan het secundaire antilichaam alleen controle putten. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende twintig minuten om antilichaam binding mogelijk te maken. Verwijder hierna de bestaande media uit putten.

Was de microplaat drie keer met 100 microliters van kamertemperatuur neuronale media per put om niet-gebonden antilichamen te verwijderen. Voeg vervolgens 100 microliters 100 micromolar van DHPG voorraad oplossing aan elke put. Incubeer in een 5%koolstofdioxide incubator bij 37 graden Celsius gedurende tien minuten.

Verwijder vervolgens de DHPG-oplossing en voeg 100 microliters van neuronale media toe aan elke put. Herhaal dit proces een tweede keer. Dan incubeer in de 5%koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Op de dag van het experiment een oplossing van 4% paraformaldehyde en 4% sacharose NPBS. Verwijder de media uit elke put en vervang deze door 100 microliters van de paraformaldehyde en sacharoseoplossing. Herhaal dit proces voor elk optellingstijdpunt.

Incubeer de microplaat op 4 graden Celsius gedurende twintig minuten. Verwijder vervolgens de fixatieve en voeg 100 microliters van DPBS aan elke put. Verwijder de DPBS en voeg 150 microliters van het blokkeren buffer aan elke put.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende negentig minuten. Verwijder de blokkeringsbuffer en voeg 50 microliters van de secundaire antilichaamoplossing toe aan elke put. Broed zestig minuten op kamertemperatuur terwijl de plaat beschermd blijft tegen licht.

Verwijder de antilichaamoplossing en voeg 100 microliter tbs toe aan elke put. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Herhaal dit proces, het verwijderen van de media uit de putten toe te voegen TBS, en uitbroeden bij kamertemperatuur vier extra keren.

Verwijder hierna de tbs van de microplaat. Voeg 100 microliter van een oplossing van 4% paraformaldehyde en 4% sacharose in PBS toe aan elke put. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijftien minuten.

Verwijder de paraformaldehydeoplossing en voeg 100 microliter tbs in elke put toe en broed vijf minuten bij kamertemperatuur uit. Herhaal deze stap twee keer extra. Bereid eerst een oplossing van TBS met 2% saponine en vortex de oplossing kort om volledig te lossen de saponine poeder.

Met behulp van een filter van 2 micrometer filtert u de oplossing om eventuele deeltjes te verwijderen die autofluorescentie kunnen veroorzaken. Voeg 150 microliter van deze 2%saponine oplossing toe aan elke put en broed vijftien minuten lang in op kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de saponineoplossing en voeg 150 microliter blokkeringsbuffer toe aan elke put.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende negentig minuten. Verwijder hierna de blokkeerbuffer en voeg vijftig microliters van de secundaire antilichaamoplossing toe aan elke put. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende zestig minuten.

Voeg vervolgens 100 microliter tbs toe aan elke put en broed vijf minuten lang bij kamertemperatuur uit. Herhaal dit proces het toevoegen van TBS en incubatie bij kamertemperatuur vier keer. Met behulp van een infrarood laser imaging systeem beeld van de 96 goed microplaat volgens de instructies van de fabrikanten.

Stel de scanresolutie in op 84 micrometer. De scankwaliteit tot medium en de focus offset volgens de basishoogte van de 96 goed micro plaat gebruikt. Klik op de menuknop van Image Studio, exporteer afbeelding voor digitale media en exporteer de afbeeldingen met een resolutie van 300 dpi in TIFF-formaat.

Open de afbeelding in ImageJ Fiji. Splits de kleurkanalen door op het afbeeldingsmenu te klikken en vervolgens kanalen te splitsen. Open vervolgens de ROI-manager van analyse, tools.

Schakel het selectievakje in voor labels in de ROI-manager om de kringen te classificeren met getallen. Selecteer in de 6 80, of rode kanaal, het interessegebied door het cirkelgereedschap te selecteren en een cirkel te tekenen die nauwkeurig bij de eerste put past. Druk vervolgens op Ctrl plus T en sleep de cirkel naar de volgende put.

Herhaal dit proces totdat alle putten zijn omcirkeld. Klik van de ROI-manager op meting. Selecteer de waarden die worden weergegeven en kopieer ze naar een spreadsheet.

Klik vervolgens op het groene kanaal en zet de geselecteerde ROI's om naar de afbeelding. Klik van de ROI-manager op meting. Selecteer de waarden die worden weergegeven en kopieer ze naar een spreadsheet.

Hierna berekenen de veranderingen van de oppervlaktereceptorexpressie zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze procedure wordt de persistentie van boog bij het reguleren van ampa receptor trafficking onderzocht met behulp van de hoge ampa receptor handel en test. Neuronen worden behandeld met de natrium-ion kanaalblokker TTX die actie potentialen remt en vermindert boogniveaus.

Gevolgd door DHPG die boogvertaling en alomtegenwoordigheid induceert. Zowel oppervlakte- als internaliserende zwembaden van gluA1 en gluA2 met apa receptor subeenheden werden gemeten op vijf en vijftien minuten na DHPG washout. ArcKR neuronen tonen verhoogde gluA1 endosese wanneer behandeld met DHPG, in vergelijking met terwijl type neuronen.

Dit effect wordt niet gezien wanneer neuronen alleen met TTX worden behandeld. Oppervlakte expressie van de gluA2 subunit wordt aanzienlijk verhoogd op korte tijdstippen in vergelijking met wile type neuronen. Met vermelding van een mogelijke subunit vervanging.

Zorg ervoor dat de cellen illiquide vaste paraformaldehyde moeten worden bereid vers op de dag van het experiment. Cellen moeten opnieuw worden vastgesteld na het labelen voor de oppervlaktereceptoren. Andere methoden zoals confocale microscopie in staat zal zijn om eencellige resolutie te bieden om verder te karakteriseren gerelateerde veranderd in neuronale structuur en receptor lokalisatie.

Het verstoren van de temporele dynamiek van boog verandert ampa receptoren handel in reactie op MgluR bemiddelde LTD. Toekomstige richtingen zullen zijn om ampa receptoren handel te meten in reactie op andere stimuli. Deze test misschien aanpasbaar aan andere celtypes, behandelingen en receptoren, op voorwaarde dat de procedure zorgvuldig wordt aangepast en op de juiste wijze gevalideerd.

Er moet voor worden gezorgd dat celdichtheden, behandelingstijden, fixatiestappen, permeabilisatiestappen en reagensselecties uw systeem van interesse optimaliseren. Voor een succesvolle en efficiënte voltooiing van de test is het belangrijk om de DHPG-oplossing en de 4%-paraformaldehyde, 4% sacharoseoplossing op de dag van het experiment voor te bereiden. Controle goed behandeld met vakeel of TTX zijn nodig om ervoor te zorgen dat de waargenomen effecten specifiek zijn voor de behandeling.

Het is ook van cruciaal belang om putten behandeld met alleen de secundaire antilichamen te controleren voor achtergrond fluorescentie geproduceerd door niet-specifieke binding.