여기서 우리는 1 차적인 신경 배양 준비와 호환되는 높은 함량 수용체 인신 매매 분석서를 보여줍니다. 이 방법은 표면을 고정 뉴런의 인터 셀러 수용체 풀에 별도로 라벨을 부착합니다. 그 수용체의 전반적인 밀도에 정규화된 표면 또는 내부화된 수용체 밀도의 비율로 데이터의 프리젠테이션을 가능하게 한다.
높은 함량및 수용체 인신 매매 분석법은 다양한 요인에 대응하여 신경망 내의 수용체 인신 매매 프로파일의 대량 변화를 측정하는 데 효과적 인 수단을 제공합니다. 다른 방법보다 시간과 재료가 훨씬 적게 소모됩니다. 중단 및 preceptors 인신 매매는 다중 신경 장애에 연결되었습니다, 약물 치료에 대한 매력적인 대상으로 간주됩니다.
예를 들면 연구 결과는 알츠하이머 병의 초기 표시 중 하나가 시냅스 손실및 감소 시냅스 및 preceptor 풀인 것으로 나타났습니다. 이 기술은 다양한 난이도의 많은 다른 단계를 필요로한다. 특히 96 웰 플레이트를 처리하고 우물을 조작하는 것은 경험이없는 사람에게 는 어려운 증명할 수 있기 때문입니다.
그리고 실험의 결과는 부적절한 취급에 매우 민감하기 때문에 수행되는 다양한 단계를 보는 것이 유용합니다. 강사는 96 웰 플레이트에서 각 우물에서 기존 미디어의 100 마이크로리터를 제거하여 뉴런을 공급합니다. 그리고 37섭씨까지 미리 따뜻하게 된 100마이크로리터의 미디어로 교체합니다.
3~4일마다. 시험관 14에서 하루, 멀티 파이프를 사용하여 각 우물에서 100 마이크로 리터의 미디어를 제거하고 미디어를 풀. TTX 스톡 솔루션 2개를 풀컨디셔닝 된 미디어의 1 밀리리터에 추가하여 TTX의 4 개의 마이크로 몰라 솔루션을 만듭니다.
4개의 마이크로몰러 TTX 용액의 100 마이크로리터로 각 우물의 뉴런을 치료하십시오. 풀이 된 조건 미디어가 충분하지 않으면 이전에 저장된 미디어의 일부를 추가합니다. 4시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 CO2 인큐베이터로 인큐베이터로 배양합니다.
이 후 기존의 TTX를 제거하여 미디어를 포함하고 200마이크로리터의 미리 데운 신경 매체를 추가하고, 15분 동안 실온에서 마이크로 플레이트를 배양한다. 먼저 마이크로 플레이트에서 신경 매체를 제거합니다. 마이크로 플레이트의 해당 웰에 항 글루A1 또는 항 글루A2 항체 용액의 50 마이크로리터를 추가합니다.
이차 항체전용 조절웰에 뉴런 미디어의 50 마이크로리터를 추가합니다. 항체 결합을 허용하기 위해 20 분 동안 실온에서 배양하십시오. 이 후 우물에서 기존 미디어를 제거합니다.
마이크로 플레이트를 100 마이크로리터의 실온 뉴런 미디어로 세 번 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 DHPG 스톡 솔루션 100 마이크로리터 100 마이크로몰라를 추가합니다. 10분 동안 섭씨 37도에서 이산화탄소 인큐베이터 5%를 배양합니다.
다음으로 DHPG 용액을 제거하고 각 웰에 100 마이크로 리터의 신경 매체를 추가합니다. 이 프로세스를 두 번째로 반복합니다. 그런 다음 5분간 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터에 배양합니다.
실험 당일 4%의 파라포름알데히드와 4%의 자당 NPBS용액을 준비한다. 각 우물에서 미디어를 제거하고 파라포름알데히드 및 자당 용액의 100 마이크로 리터로 대체하십시오. 각 추가 시간 점에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
마이크로 플레이트를 섭씨 4도에서 20분간 배양합니다. 그런 다음 고정을 제거하고 각 우물에 DPBS의 100 마이크로 리터를 추가합니다. DPBS를 제거하고 각 웰에 150 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다.
실온에서 90분 동안 배양하세요. 차단 버퍼를 제거하고 각 웰에 이차 항체 용액의 50 마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 빛으로부터 보호하면서 60분 동안 실온에서 배양합니다.
항체 용액을 제거하고 각 웰에 100 마이크로리터의 TBS를 추가합니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 이 과정을 반복하여 TBS를 추가하는 우물에서 미디어를 제거하고 실온에서 4번 추가로 배양합니다.
이 후 마이크로 플레이트에서 TBS를 제거합니다. 각 웰에 PBS에 4%의 파라포름알데히드와 4%의 자당용 100마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양하세요.
파라포름알데히드 용액을 제거하고 각 우물에 100 마이크로리터의 TBS를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 먼저 2% 사포닌을 함유한 TBS용 액액을 준비하고 용액을 잠시 소용돌이어 사포닌 분말을 완전히 용해시다.
2 마이크로미터 필터를 사용하여 용액을 필터링하여 자동 불발성을 유발할 수 있는 입자를 제거합니다. 이 2% 사포닌 용액의 150 마이크로리터를 각 우물에 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 사포닌 용액을 제거하고 각 웰에 150 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다.
실온에서 90분 동안 배양하세요. 이 후 차단 버퍼를 제거하고 각각의 웰에 이차 항체 용액의 50 마이크로리터를 추가한다. 실온에서 60분 동안 배양하세요.
그런 다음 각 우물에 100 마이크로리터의 TBS를 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 이 과정을 반복하면 TBS를 추가하고 실온에서 4회 추가로 인큐베이팅합니다. 적외선 레이저 이미징 시스템 이미지를 사용하여 제조업체 지침에 따라 96 개의 마이크로 플레이트가 잘 어울리합니다.
스캔 해상도를 84 마이크로미터로 설정합니다. 사용되는 96웰 마이크로 플레이트의 기본 높이에 따라 중간 및 초점 오프셋까지의 스캔 품질. 이미지 스튜디오 메뉴 버튼을 클릭하고 디지털 미디어에 대한 이미지를 내보내고 TIFF 형식으로 300 dpi해상도로 이미지를 내보냅니다.
ImageJ 피지에서 이미지를 엽니다. 이미지 메뉴를 클릭하여 색상 채널을 분할한 다음 채널을 분할하는 색상을 클릭합니다. 그런 다음 분석, 도구에서 ROI 관리자를 엽니다.
숫자로 원을 분류하려면 ROI 관리자의 레이블 확인란을 선택합니다. 6 80 또는 빨간색 채널에서는 원 도구를 선택하고 첫 번째 웰에 정확하게 맞는 원을 그리는 방식으로 관심 영역을 선택합니다. 그런 다음 Ctrl +T를 눌러 원을 다음 우물로 드래그합니다.
모든 우물이 동그라미가 될 때까지 이 과정을 반복합니다. ROI 관리자 클릭 측정값에서. 표시되는 값을 선택하고 스프레드 시트에 복사합니다.
다음 녹색 채널을 클릭하고 선택한 ROI를 이미지로 변환합니다. ROI 관리자 클릭 측정값에서. 표시되는 값을 선택하고 스프레드 시트에 복사합니다.
이 후에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 변경 된 표면 수용체 발현을 계산합니다. 이 절차에서 ampa 수용체 인신 매매를 조절하는 아크의 지속성은 높은 함량의 ampa 수용체 인신 매매 및 분석을 사용하여 검사된다. 뉴런은 작용 잠재력을 억제하고 아크 레벨을 감소시키는 나트륨 이온 채널 차단제 TTX로 치료됩니다.
아크 번역 및 유비쿼터션을 유도하는 DHPG가 그 뒤를 따릅니다. 표면 및 내재화 접합체 a1 및 gluA2의 풀은 DHPG 세척 후 5 분 과 15 분에서 측정되었다. ArcKR 뉴런은 DHPG로 치료할 때 글루A1 내시경증이 증가하여 뉴런 유형에 비해 증가된 것을 보여줍니다.
이 효과는 뉴런이 TTX로만 치료될 때 볼 수 없습니다. gluA2 서브유닛의 표면 발현은 wile 형 뉴런에 비해 짧은 시간에 크게 증가한다. 잠재적인 하위 단위 교체를 나타냅니다.
세포가 비유동성 고정 파라포름알데히드임을 보장하는 것은 실험 당일 신선하게 준비되어야 한다. 세포는 표면 수용체에 대한 라벨링 후 다시 고정되어야 합니다. 공초점 현미경 검사법과 같은 다른 방법은 뉴런 구조 및 수용체 국소화에서 관련된 변화를 더욱 특성화하기 위해 단일 세포 분해능을 제공할 수 있을 것이다.
아크의 시간역학을 방해하는 것은 MgluR 중재 LTD.에 대한 응답으로 ampa 수용체 인신 매매를 변경합니다. 이 분석은 아마도 다른 세포 유형에 적응, 치료 및 수용 체, 절차가 신중 하 게 조정 하 고 적절 하 게 유효성을 검사 하는 제공.
세포 밀도, 치료 시간, 고정 단계, 투과 단계 및 시약 선택이 관심 시스템을 최적화되도록 주의를 기울여야 합니다. 분석의 성공적이고 효율적인 완료를 위해 실험 당일 DHPG 솔루션과 4% 파라포름알데히드, 4% 자당 용액을 준비하는 것이 중요합니다. 관찰된 효과가 치료에 특정되도록 vakeel 또는 TTX로 잘 처리된 제어가 필요합니다.
비특이적 결합에 의해 생성된 배경 형광을 제어하기 위해 이차 항체로만 처리된 우물을 포함하는 것이 중요합니다.
