Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

M.H.T. معتمد من قبل وكالة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث في "مكتب مشترك لمجلس" المنح (1431AFG103)، منح "مجلس وطني للبحوث الطبية" (أوفيرج/0017/2016)، تمنح "المؤسسة الوطنية للأبحاث" (NRF2013-THE001-046) و (NRF2013-THE001-093 منح وزارة "التعليم المستوى" 1 (RG50/17 (ق))، بدء تشغيل منحة من جامعة نانيانغ التكنولوجية، والأموال للمنافسة "الدولية وراثيا الهندسة آلة" (الحكومي) من جامعة نانيانغ التكنولوجية.

1-تصميم سجرناس
<ol><li>حدد نظام كريسبر Cas مناسب.<ol>
<li>أولاً، تفقد المنطقة المستهدفة لمتواليات بام من جميع نوكليسيس Cas9 و Cas12a التي أظهرت أن يكون متوفراً في خلايا الثدييات16,21-32. خمسة الإنزيمات المستخدمة بشكل متكرر ترد في الجدول 1 جنبا إلى جنب مع PAMs الخاصة بهم. ملاحظة: بالإضافة إلى ?...

نظام كريسبر Cas تقنية قوية وثورية هندسة الجينوم وترانسكريبتوميس من النباتات والحيوانات. قد تم العثور على العديد من الأنواع البكتيرية تحتوي على نظم كريسبر-الأكاديمية الصينية للعلوم، التي يحتمل أن تكون قد تكون مناسبة للجينوم والترنسكربيتوم الهندسية أغراض44. على الرغم من أن اند?...

القدرة على هندسة الجينوم من أي كائن حي لديه العديد من التطبيقات الطبية الحيوية والتكنولوجيا الحيوية، مثل تصحيح الأمراض المسببة للطفرات، وبناء النماذج الخلوية الدقيقة لدراسات الأمراض، أو توليد الزراعية المحاصيل مع الصفات المرغوب فيه. منذ مطلع هذا القرن، تم استحداث تكنولوجيات مختلفة لهندسة الجينوم في خلايا الثدييات، بما في ذلك ميجانوكليسيس1،2،3، زنك إصبع نوكليسيس4،5، أو النسخ المستجيب المنشط--مثل نوكليسيس (تالينس)6،7،،من89. هذه التكنولوجيات السابقة غير صعبة للبرنامج أو شاقة التجمع، مما يعوق اعتمادها على نطاق واسع في البحوث والصناعة.
في السنوات الأخيرة، بشكل منتظم مجمع إينتيرسباسيد في يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)-برز نظام المرتبطة كريسبر (Cas) جينوم جديدة قوية هندسة تكنولوجيا10،11. أصلاً نظام المناعة تكيفية في البكتيريا، قد تم بنجاح نشر لتعديل الجينوم في النباتات والحيوانات، بما فيها البشر. سبب الرئيسي لماذا كريسبر Cas قد اكتسب شعبية الكثير في وقت قصير كهذا هو أن العنصر الذي يجلب endonuclease الأكاديمية الرئيسية، مثل Cas9 أو Cas12a (المعروفة أيضا باسم Cpf1)، إلى الموقع الصحيح في الجينوم هو مجرد قطعة قصيرة من دليل واحد تشيميريك RN (سجرنا)، وهي واضحة للتصميم ورخيصة توليف. بعد تجنيدهم إلى الموقع المستهدف، تعمل مقص الجزيئية الإنزيم Cas وكليافيس الحمض النووي المرتبطة مع به روفك، HNH، أو نشاط المجالات12،،من1314. بعد ذلك يتم إصلاح كسر الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة الناتجة (جهاز تسوية المنازعات) بالخلايا عن طريق نهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج) أو مسار الإصلاح الموجه من التماثل (HDR). في غياب إصلاح قالب، يتم إصلاح جهاز تسوية المنازعات بالمسار نهيج عرضه للخطأ، ويمكن أن يؤدي إلى شبه عشوائي الإدراج أو الحذف من النيوكليوتيدات (إينديلس) في موقع قص، يحتمل أن تسبب فراميشيفت الطفرات في الجينات ترميز البروتين. ومع ذلك، حضور الجهات مانحة قالب يحتوي على الحمض النووي التغييرات المطلوبة، يتم إصلاح جهاز تسوية المنازعات بالمسار HDR عالية الدقة. وتشمل الأنواع الشائعة من قوالب المانحة النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل (سودنس) ووالبلازميدات. عادة ما تستخدم في السابق إذا كانت التغييرات الحمض النووي المقصود صغيرة (على سبيل المثال، تغيير زوج قاعدة واحدة)، في حين أن هذا الأخير يستخدم عادة إذا كان أحد يرغب في إدراج تسلسل طويلة نسبيا (على سبيل المثال، تسلسل ترميز بروتين فلوري أخضر أو التجارة والنقل) إلى المكان المستهدف.
النشاط اندونوكليسي من البروتين Cas يتطلب وجود بروتوسباسير عزر المتاخمة (بام) في الموقع المستهدف15. بام Cas9 في نهاية 3 'بروتوسباسير، بينما بام Cas12a (وتسمى أيضا Cpf1) في النهاية 5' بدلاً من16. Cas-دليل الحمض النووي الريبي المعقدة غير قادر على عرض جهاز تسوية المنازعات إذا تغيب17بام. ومن ثم، بام يضع قيداً على مواقع الجينوم قادرة على تنشق فيه نوكلاس Cas خاصة. لحسن الحظ، يحمل nucleases الأكاديمية الصينية للعلوم من مختلف الأنواع البكتيرية عادة متطلبات مختلفة بام. ومن ثم، بإدماج مختلف Cas كريسبر نظم لدينا الأدوات الهندسية، نحن توسيع نطاق المواقع التي قد تكون مستهدفة في جينوم. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء هندسة عكسية إنزيم الأكاديمية الصينية للعلوم طبيعية أو تطورت إلى الاعتراف بتسلسل بام بديلة، مزيد من توسيع نطاق أهداف الجينوم موجوداً للتلاعب18،،من1920.
على الرغم من أن تتوفر أنظمة كريسبر Cas متعددة الأغراض الهندسية الجينوم، اعتمدت معظم المستخدمين لهذه التكنولوجيا أساسا على نوكلاس Cas9 من العقدية المقيّحة (SpCas9) لأسباب متعددة. أولاً، فإنه يتطلب أم نج نسبيا ببساطة، خلافا للعديد من البروتينات Cas الأخرى التي يمكن أن تهزم سوى حضور PAMs أكثر تعقيداً. وثانيا، أنها endonuclease الأكاديمية الأولى التي سيتم نشرها بنجاح في الخلايا البشرية21،22،،من2324. وثالثاً، SpCas9 هو إلى حد بعيد أفضل الإنزيم تتسم حتى الآن. إذا لم يرغب باحث في استخدام آخر Cas نوكلاس، أنه أو أنها غالباً ما ستكون واضحة بشأن أفضل السبل لتصميم التجربة وجيدا كيف سوف تؤدي الإنزيمات الأخرى في مختلف السياقات البيولوجي مقارنة SpCas9.
توفير الوضوح لأداء مختلف Cas كريسبر النظم النسبية، قد أجرينا مؤخرا مقارنة منهجية لخمسة Cas اندونوكليسيس-SpCas9، الإنزيم Cas9 من المكوّرات العنقودية الذهبية (SaCas9)، الإنزيم Cas9 من وجود النيسرية السحائية (NmCas9)، الإنزيم Cas12a من أسيدامينوكوككوس sp. BV3L6 (AsCas12a)، والانزيم Cas12a من بكتيريا لاتشنوسبيراسيي ND2006 (LbCas12a)25. لمقارنة منصفة، يمكننا تقييم nucleases Cas مختلفة باستخدام نفس مجموعة من المواقع المستهدفة وغيرها من الشروط التجريبية. الدراسة أيضا تحديد معايير التصميم لكل نظام كريسبر-الأكاديمية الصينية للعلوم، الذي سيكون بمثابة مرجع مفيد للمستخدمين للتكنولوجيا. هنا، على نحو أفضل تمكن الباحثين من الاستفادة من كريسبر-الأكاديمية الصينية للعلوم نظام، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لهندسة الجينوم الأمثل مع مختلف الإنزيمات Cas9 و Cas12a (انظر الشكل 1). ليس فقط يتضمن البروتوكول التجريبي من التفاصيل لكن الاعتبارات الخاصة بالتصميم أيضا أقصى حد احتمال نتيجة هندسة الجينوم ناجحة في خلايا الثدييات.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> الشكل 1 : لمحة عامة عن سير العمل لتوليد الجينوم تحرير خطوط الخلايا البشرية- <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

النظام يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) متفاوت المسافات يعمل بطبيعة الحال في مناعة التكيفية البكتيرية، ولكن قد تم بنجاح إعادة توجيه الغرض منه لهندسة الجينوم في العديد من الكائنات الحية المختلفة. الأكثر شيوعاً، المرتبطة wildtype كريسبر 9 (Cas9) أو اندونوكليسي Cas12a ويستخدم تهزم مواقع محددة في الجينوم، بعدها يتم إصلاح كسر مزدوج تقطعت الحمض النووي عن طريق النهاية غير المتجانسة الانضمام إلى مسار (نج) أو (إصلاح الموجه من التماثل مسار HDR) تبعاً لما إذا كان قالب المانحين غائبة أو الموجودة على التوالي. وحتى الآن، أظهرت نظم كريسبر من الأنواع البكتيرية المختلفة لتكون قادرة على أداء التحرير الجينوم في خلايا الثدييات. ومع ذلك، على الرغم من بساطة الظاهر للتكنولوجيا، عدة بارامترات التصميم يلزم النظر، التي غالباً ما تترك المستخدمين في حيرة حول كيفية أفضل الاضطلاع بالجينوم تحرير التجارب. وهنا يصف لنا سير عمل كاملة من التصميم التجريبي لتحديد الهوية لاستنساخ الخلايا التي تحمل المرجوة من تعديلات الحمض النووي، بهدف تيسير التنفيذ الناجح للجينوم تحرير تجارب في خطوط خلايا الثدييات. نؤكد على الاعتبارات الرئيسية للمستخدمين أن تحيط علما، بما في ذلك اختيار نظام كريسبر وطول فاصل وتصميم قالب المانحين الذين تقطعت بهم السبل-واحد أوليجوديوكسينوكليوتيدي (سودن). ونحن نتصور أن سير العمل هذا سيكون مفيداً لدراسات الجينات خروج المغلوب، المرض النمذجة الجهود، أو توليد مراسل خلية خطوط.

أداء جينوم تحرير التجربة بلازميد كريسبر الإعراب عن استهداف سجرنا محور المصالح تحتاج إلى استنساخ. أولاً، بلازميد يهضم مع إنزيم التقييد (عادة نوع الإنزيم IIs) لينيريزي عليه. من المستحسن لحل المنتج هضمها على 1% [اغروس] هلام جنبا إلى جنب مع بلازميد عسر الهضم للتمييز بين هضم الكامل والجزئي. وكما س?...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

تحرير الجينوم في "خطوط خلايا الثدييات" استخدام Cas كريسبر

كريسبر Cas تقنية قوية هندسة الجينوم معقدة من النباتات والحيوانات. هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لكفاءة تحرير الجينوم البشري باستخدام مختلف Cas اندونوكليسيس. نسلط الضوء على الاعتبارات الهامة ومعايير التصميم لتحسين كفاءة التحرير.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

يستخدم هذا البروتوكول CRISPR-Cas9 لإنشاء خطوط خروج المغلوب أو خروج المغلوب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه من السهل والكفاءة لمتابعة خاصة بالنسبة للباحثين المبتدئين. بالنسبة لـ الخلايا، قم بمعالجة الخلايا المستزرعة بين عشية وضحاها بمليلترين بنسبة 0.25٪ لتربيتين EDTA لكل صفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.عندما تكون الخلايا قد رفعت من قيعان لوحة، تحييد رد فعل انزيمي مع ملليلتر اثنين من خلية ثقافة المتوسطة، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت بيليه في خمسة ملليلتر من خلية جديدة ثقافة المتوسطة للعد. ثم البذور 1.8 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في بئر واحد من 24 بئرا لوحة ثقافة الأنسجة لثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بالنسبة لtransfection من الخلايا، إضافة حجم مناسب من المزيج transfection التي تحتوي على التركيز المناسب من البلازميد CRISPR إلى الحجم المناسب من كاشف transfection، وفقا للتصميم التجريبي وتعليمات الشركة المصنعة. بعد احتضان مزيج transfection في درجة حرارة الغرفة لفترة الموصى بها من الزمن، إضافة الحل إلى الخلايا بطريقة قطرة الحكمة. ثم تدور بلطف لوحة لخلط ووضع لوحة في حاضنة درجة مئوية مرطبة 37 مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في نهاية transfection، إضافة 150 ميكرولترات من تريبسين-EDTA لفصل الخلايا كما أظهرت للتو وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في مصل البقر 2٪ الجنين في PBS وتصفية الخلايا من خلال 30 ميكرومتر شبكة مصفاة في خلية خمس ملليلتر تنشيط الفلورانس الفرز، أو أنبوب FACS. ثم استخدام الخلايا غير المُزوَّرة لتعيين بوابة تحكم سلبية على مقياس التدفق وفرز الخلايا المُزوّرة وفقاً لعلامة الفلورسنت على الـ CRISPR plasmid المستخدم في عملية نقل العدوى إلى أنبوب يحتوي على 100 ميكرولترات من خلية متوسطة.عندما تم جمع جميع الخلايا المصابة، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في السرعة القصوى وإعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولترات من خلية ثقافة المتوسطة. بذور 200 ميكرولتر من الخلايا في بئر واحد من لوحة ثقافة الأنسجة 24 جيدا والسماح للخلايا لاسترداد لبضعة أيام في حاضنة 37 درجة مئوية. بيليه المتبقية 100 ميكرولترات من الخلايا فرزها في السرعة القصوى لمدة خمس دقائق واستخراج الحمض النووي الجينومي من بيليه الناتجة وفقا لبروتوكولات استخراج الحمض النووي القياسية.بعد ذلك ، إضافة 10 ميكرولترات من البوليميراز العازلة تفاعل سلسلة ، وميكر واحد من مزيج ديوكسينويكليوتيد ، 2.5 microliters من التمهيدي العكسي المحدد من قبل المستخدم ، 0.5 ميكرولترات من بوليميراز الحمض النووي ، واثنين إلى خمسة ميكرولترات من قالب الحمض النووي الجينوم المستخرج وكميات كافية من المياه المقطرة المزدوجة لتحقيق التفاعل إلى حجم النهائي من 50 ميكرولتر. تشغيل الخليط على دورة حرارية وحل التفاعل على هلام agarose 2٪ باستخدام 1X TAE العازلة وفقا للبروتوكولات القياسية. استخدام مشرط نظيفة، حادة لاستخلاص من سلسلة البوليميراز رد فعل المنتج وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.قياس تركيز المنتج باستخدام مقياس الطيفي في امتصاص 260 نانومتر. إعداد مزيج تحليلي يحتوي على 200 نانوغرام من الحمض النووي المعزول، واثنين من ميكرولترات من T7 endonuclease I العازلة رد فعل، وكميات كافية من المياه المقطرة المزدوجة لتحقيق الحجم النهائي للخليط إلى 19 ميكرولترات. Reanneal تفاعل البوليميراز سلسلة المنتج في دورة حرارية في المعلمات المشار إليها وخلط خمس وحدات من T7 endonuclease الأول مع المنتج reannealed لاحتضان 50 دقيقة في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، حل الحمض النووي هضم على هلام agarose 2.5٪ باستخدام 1X TAE العازلة، وصورة الجل على نظام التصوير هلام المناسبة. افتح صورة الجل في ImageJ وارسم مربع مستطيل حول النطاق أقرب إلى حده قدر الإمكان. انقر فوق تحليل، ثم قم بتعيين القياسات، مع التأكيد على أن المساحة، والقيمة الرمادية المتوسطة، وخيارات الكثافة المتكاملة قد تم تحديدها.انقر فوق موافق، وحدد تحليل، وقياس. متوسط، أو قيمة كثافة كثافة الخام، يدل على كثافة الفرقة. عندما تبدأ الخلايا المُعدة للثقافة في أن تصبح اُكتبسة، افصلها بالتريبسين-EDTA، كما هو موضح، وبذّر الخلايا بشكل متفرق في طبق ثقافة الأنسجة 100 ملليمتر للسماح بمساحة كافية للمستعمرات الفردية للنمو قبل إعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية.عندما تبدأ المستعمرات في التشكل، استخدم المجهر مع التكبير 4 X لاختيار المستعمرات الفردية لنقلها إلى آبار فردية من لوحة 24-well تحتوي على 500 ميكرولترات من خلية ثقافة المتوسطة في بئر. الحرص على أن تلميح الخاص بك لا تلمس المستعمرات المحيطة بها لمنع خلط المستعمرات داخل الآبار الفردية أو اختيار من منطقة من نمو مستعمرة متفرق. عندما تم اختيار جميع المستنسخين ، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية حتى تصبح الثقافات التقاء.كما البلازميدات غير المهضومة هي فائقة ملفوف، فإنها تميل إلى تشغيل أسرع من نظرائهم خطي. لتحديد ما إذا كان قد تم استنساخ oligonucleotides بنجاح في العمود الفقري كريسبر plasmid، يتم تنفيذ PCR مستعمرة ويتم تلقيح المستنسخات الإيجابية قبل استخراج البلازميدات وإرسالها لتسلسل سانجر. يمكن تصور إشارة الفلورسنت بسهولة تحت المجهر عند التسليم الناجح للـ بلازميدات ، مما يسمح للخلايا المصابة بالعدوى أن يتم فرزها حسب قياس التدفق.يتم إجراء فحص T7 endonuclease I للتحقق من كفاءة الانقسام من الحمض النووي الجينومي ، كما تم حسابه من شدة الفرق الملاحظة على هلام agarose. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم تصميم تجربة مستندة إلى إصلاح موجهة من homology لدمج موقع تقييد في موضع الهدف، يمكن إجراء تحليل تعدد أشكال طول جزء القيد مع إنزيم تقييد المقابلة. لمزيد من التحقق من صحة أن جين ترميز البروتين قد تم تعطيل بنجاح، يمكن تنفيذ لطخة الغربية لضمان عدم وجود البروتين المستهدف.فرز الخلايا بعد transfection يزيل الخلايا دون البلازميدات المدمجة، وبالتالي زيادة النسبة المئوية للخلايا فحص في مراحل لاحقة كما وجود خروج المغلوب أو ضرب في الجينات. مع تطور هذه التقنية ، ونحن الآن قادرون على إنتاج خطوط الخلايا خروج التدريجي لدراسة وظيفة الجينات وخطوط الخلايا ضرب في نموذج أمراض معينة لفهم آلياتها.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا T- خطوط

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

تعزيز الجينوم التحرير مع ريبونوكليوبروتين Cas9 في مختلف الخلايا والكائنات الحية

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

تشريح للدالة محسن باستخدام محسن متعدد المستندة إلى كريسبر التدخل في خطوط الخلايا

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

كريسبر بوساطة "تحرير الجينوم" "البشري مسببات الأمراض الفطرية" المبيضات البيض

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

تحويل، تحرير الجينوم والفينولات في نتروجين تحديد شجرة كاناباسيا الاستوائية Parasponia أندرسوني

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

التعرف على مستقبلات سطح الخلية باستخدام شاشات CRISPR/Cas9 الجينية على مقياس الجينوم

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

إدخال طفرات نقطية في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام تحرير الجينوم السلس

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-بوساطة الجينوم التحرير في الأحرف ال الخيطية هانتييلا omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...