Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

M.H.T. wordt ondersteund door een Agentschap voor wetenschap, technologie en onderzoek de gezamenlijke Raad Office grant (1431AFG103), een nationale Medical Research Council verlenen (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation verleent (NRF2013-THE001-046 en NRF2013-THE001-093), een Ministerie van onderwijs Tier 1 grant (RG50/17 (S)), een startup verlenen vanaf Nanyang Technological University, en fondsen voor de internationale genetisch Engineering Machine (iGEM) concurrentie van Nanyang Technological University.

1. ontwerp van sgRNAs
<ol><li>Selecteer een passend CRISPR-Cas-systeem.<ol>
<li>Eerst, Inspecteer de regio van de doelgroep voor de PAM sequenties van alle Cas9 en Cas12a nucleasen, die hebben aangetoond dat functioneel in zoogdiercellen16,21-32. Vijf veel gebruikte enzymen zijn gegeven in tabel 1 samen met hun respectieve PAMs. Opmerking: naast de enzym vermeld in tabel 1, er zijn andere minder gebruikte Cas-enzymen die met succes zijn ingezet in zoogdiercellen eveneens,...

Het CRISPR-Cas-systeem is een krachtige, revolutionaire technologie om ingenieur van het genoom en de transcriptomes van planten en dieren. Talrijke bacteriesoorten bleken te bevatten van de CRISPR-Cas systemen, die potentieel kunnen worden aangepast voor genoom en transcriptome engineering doeleinden44. Hoewel de endonuclease van de Cas9 van Streptococcus pyogenes (SpCas9) was het eerste enzym met succes worden ingezet in menselijke cellen21,<sup class=...

De mogelijkheid om ingenieur van het genoom van elk levend organisme heeft vele biomedische en biotechnologische toepassingen, zoals de correctie van de ziekte-veroorzakende mutaties, bouw van accurate cellulaire modellen voor ziekte studies of generatie van landbouw gewassen met wenselijke eigenschappen. Sinds het begin van de eeuw, verschillende technologieën zijn ontwikkeld voor genoom engineering in zoogdiercellen, met inbegrip van meganucleases1,2,3, elektrolytisch vinger nucleasen4,5, of transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs)6,7,8,9. Echter zijn deze eerdere technologieën moeilijk te programma of vervelend te monteren, waardoor hun wijdverspreide goedkeuring in onderzoek en de industrie te belemmeren.
In de afgelopen jaren de geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) - CRISPR-geassocieerde (Cas) systeem heeft ontpopt als een krachtige nieuwe genoom engineering technologie10,11. Oorspronkelijk een adaptieve immuunsysteem in bacteriën, is met succes ingezet voor het wijzigen van het genoom in planten en dieren, inclusief de mens. Een primaire reden waarom CRISPR-Cas heeft populariteit zo veel in zo'n korte tijd is dat het element dat de belangrijkste Cas-endonuclease, zoals Cas9 of Cas12a brengt (ook bekend als Cpf1), naar de juiste locatie in het genoom is gewoon een klein stukje chimeer één gids RN A (sgRNA), die is ontwerp eenvoudig en goedkoop te synthetiseren. Na wordt gerekruteerd om de doelsite, het Cas-enzym functioneert als een paar van moleculaire schaar en cleaves het afhankelijke DNA met haar RuvC, HNH of NOC domeinen12,13,14. De resulterende dubbele gestrande onderbreking (DSB) wordt later hersteld door de cellen via niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) of de homologie geleide reparatie (HDR) traject. Bij gebrek aan een reparatie-sjabloon, wordt de DSB hersteld door de vergissing-geneigd NHEJ traject, die aanleiding tot pseudo-willekeurige invoeging of schrapping van nucleotiden (microdeleties) op de gesneden site geven kan, mogelijk veroorzaakt frameshift mutaties in eiwit-codeert genen. Echter in de aanwezigheid van een donor-sjabloon die de gewenste DNA wijzigingen bevat, wordt de DSB hersteld door het traject van de HDR high fidelity. Gangbare typen van donor sjablonen zijn single-stranded oligonucleotides (ssODNs) en plasmiden. De voormalige wordt meestal gebruikt als de beoogde DNA veranderingen klein (bijvoorbeeld wijziging van een enkelvoudige basenpaar), zijn terwijl de laatste meestal gebruikt wordt als men het wil invoegen een relatief lange reeks (bijvoorbeeld de codering opeenvolging van een groen fluorescent proteïne of GFP) in de locus van het doel.
De endonuclease activiteit van het eiwit van Cas vereist de aanwezigheid van een protospacer aangrenzende motief (PAM) op de target website15. De PAM van Cas9 is aan de 3'-eind van de protospacer, terwijl de PAM van Cas12a (ook wel Cpf1 genoemd) in plaats daarvan aan het einde 5'16. Het Cas-guide RNA complex is niet in staat om een DSB als de PAM afwezig17 is. Vandaar, de PAM legt een beperking op de genomic locaties waar een bepaalde Cas nuclease vermag klieven. Gelukkig, Cas nucleasen van verschillende bacteriesoorten vertonen meestal verschillende PAM eisen. Vandaar, door de integratie van verschillende systemen van de CRISPR-Cas in onze engineering toolbox, we kunnen uit te breiden het bereik van sites die in een genoom kunnen worden gericht. Bovendien kan een natuurlijke Cas enzym worden ontworpen of geëvolueerd om te herkennen van de alternatieve opeenvolgingen van het PAM, verdere uitbreiding van het toepassingsgebied van genomic doelstellingen toegankelijk voor manipulatie18,19,20.
Hoewel meerdere CRISPR-Cas systemen beschikbaar voor technische doeleinden genoom zijn, hebben de meeste gebruikers van de technologie vertrouwd voornamelijk op de Cas9 nuclease van Streptococcus pyogenes (SpCas9) om meerdere redenen. Ten eerste, het vereist een relatief eenvoudig NGG PAM, in tegenstelling tot veel andere certificeringsinstanties eiwitten die kunnen alleen in de aanwezigheid van meer complexe PAMs klieven. Ten tweede, het is de eerste Cas endonuclease om te worden geïmplementeerd in menselijke cellen21,22,23,24. Ten derde, SpCas9 is veruit het beste gekarakteriseerd enzym tot nu toe. Als een onderzoeker wil gebruiken een ander Cas nuclease, zou hij of zij vaak onduidelijk over de beste manier om het experiment en hoe goed de andere enzymen zal presteren in verschillende biologische contexten, in vergelijking met SpCas9 te ontwerpen.
Om duidelijkheid aan de relatieve prestaties van de verschillende systemen van de CRISPR-Cas, hebben we onlangs uitgevoerd een systematische vergelijking van vijf Cas enzym-SpCas9, het Cas9-enzym van Staphylococcus aureus (SaCas9), het enzym van de Cas9 van Neisseria meningitidis (NmCas9), het Cas12a-enzym van Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), en het enzym van de Cas12a van de Lachnospiraceae bacterie ND2006 (LbCas12a)25. We geëvalueerd voor een eerlijke vergelijking, de diverse Cas nucleasen met behulp van dezelfde set doel sites en andere experimentele omstandigheden. De studie ook afgebakend ontwerpparameters voor elk CRISPR-Cas-systeem, die als een nuttige referentie voor gebruikers van de technologie dienen zou. Hier, beter in staat stellen onderzoekers gebruik te maken van de CRISPR-Cas systeem, wij bieden een stapsgewijze protocol voor optimale genoom engineering met verschillende Cas9 en Cas12a enzymen (Zie Figuur 1). Het protocol omvat niet alleen experimentele details maar ook belangrijke ontwerpoverwegingen te maximaliseren van de kans op een succesvolle genoom engineering resultaat in zoogdiercellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> Figuur 1 : Een overzicht van de workflow voor het genereren van genoom bewerkt menselijke cellijnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) systeem functioneert uiteraard in bacteriële adaptieve immuniteit, maar heeft met succes zijn voorzien voor genoom engineering in vele andere levende organismen. Meestal de wildtype CRISPR verbonden 9 (Cas9) of Cas12a endonuclease wordt gebruikt om specifieke locaties in het genoom, waarna de pauze van de double-stranded DNA is gerepareerd via het niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) traject of de homologie geleide reparatie (klieven HDR) traject afhankelijk van of een donor-sjabloon is afwezig of respectievelijk presenteren. Tot op heden, is CRISPR systemen van verschillende bacteriesoorten gebleken kunnen bewerkingen genoom toe te passen in zoogdiercellen. Ondanks de schijnbare eenvoud van de technologie moeten meerdere ontwerpparameters echter worden overwogen, waardoor vaak gebruikers verbijsterd over het beste uit hun genoom bewerken experimenten te voeren. Hier beschrijven we een complete workflow van experimenteel design tot identificatie van cel klonen die gewenste DNA wijzigingen, met het doel van het vergemakkelijken van de succesvolle uitvoering van experimenten in zoogdieren cellijnen bewerken genoom dragen. We benadrukken belangrijke overwegingen voor gebruikers nota te nemen van, met inbegrip van de keuze van het CRISPR systeem, de lengte van de spacer en het ontwerp van een sjabloon van de donor single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN). Wij voorzien dat deze werkstroom zal zitten nuttig voor gene knockout studies, ziekte modellering van inspanningen, of de generatie van verslaggever cellijnen.

Voor het uitvoeren van een experiment, een CRISPR-plasmide uiting geven aan een sgRNA gericht op die de locus-of-interest moet worden gekloond bewerken genoom. Ten eerste, de plasmide wordt verteerd met een restrictie-enzym (meestal een type IIs enzym) aan het linearize. Het is raadzaam om op te lossen het verteerd product op een 1% agarose gel naast een onverteerd plasmide onderscheid maken tussen een volledige en gedeeltelijke vertering. Zoals onverteerd plasmiden supercoiled, ze de neiging om sneller dan hun gelineari...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

CRISPR-Cas is een krachtige technologie om ingenieur van het complex genoom van planten en dieren. Hier, detail we een protocol bij het menselijk genoom met behulp van verschillende Cas enzym efficiënt te bewerken. We benadrukken belangrijke overwegingen en ontwerpparameters bewerken efficiëntie te optimaliseren.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Dit protocol maakt gebruik van CRISPR-Cas9 om knock-out- of knock-inlijnen te maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en efficiënt te volgen vooral voor beginnende onderzoekers. Voor celdoorgang behandel u 's nachts gekweekte cellen met twee milliliters van 0,25% trypsine EDTA per plaat bij 37 graden Celsius gedurende twee minuten.Wanneer de cellen van de plaatbodems zijn opgeheven, neutraliseert u de enzymatische reactie met twee milliliter celkweekmedium en breng de celsuspensie over naar een conische buis. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in vijf milliliter van verse cel cultuur medium voor het tellen. Dan zaad 1,8 keer 10 tot de vijfde cellen in een put van een 24-well weefsel cultuur plaat voor 's nachts cultuur op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Voor de transfectie van de cellen moet, volgens het experimentele ontwerp en de instructies van de fabrikant, een passend volume van de transfectiemix met de juiste concentratie CRISPR-plasmid worden toegevoegd aan het juiste volume van het transfectiereagemiddel. Na het uitbroeden van de transfectie mix bij kamertemperatuur voor de aanbevolen periode, voeg de oplossing aan de cellen in een druppel-wise manier. Draai vervolgens voorzichtig de plaat om te mengen en plaats de plaat in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator met 5%kooldioxide.Voeg aan het einde van de transfectie 150 microliters trypsin-EDTA toe om de cellen te scheiden zoals net is aangetoond en verzamel de losgemaakte cellen door centrifugatie. Resuspend de pellet in 2%foetale runderserum in PBS en filter de cellen door een 30 micrometer mesh zeef in een vijf milliliter fluorescentie-geactiveerde celsorteren, of FACS buis. Gebruik vervolgens de niet-doorgesneden cellen om een negatieve controlepoort op de stroomcytometer in te stellen en de doorgesneden cellen te sorteren op basis van de fluorescerende marker op de CRISPR-plasmide die voor de doorfectie wordt gebruikt in een buis met 100 microliters celkweekmedium.Wanneer alle transfected cellen zijn verzameld, pellet de cellen door centrifugatie op maximale snelheid en resuspend de pellet in 300 microliters van celkweek medium. Zaad 200 microliter cellen in een put van een 24-well weefsel kweekplaat en laat de cellen om te herstellen voor een paar dagen in een 37 graden Celsius incubator. Pellet de resterende 100 microliters van gesorteerde cellen op maximale snelheid gedurende vijf minuten en haal het genomische DNA uit de resulterende pellet volgens de standaard DNA-extractieprotocollen.Voeg vervolgens 10 microliter polymerase kettingreactiebuffer, een microliter deoxynucleotidemix, 2,5 microliter van door de gebruiker gedefinieerde reverse primer, 0,5 microliter DNA polymerase, twee tot vijf microliter van de geëxtraheerde genomic DNA-sjabloon en genoeg dubbel gedestilleerd water toe om de reactie naar een uiteindelijk volume van 50 microliter te brengen. Voer het mengsel op een thermische cycler en los de reactie op een 2%agarose gel met behulp van 1X TAE buffer volgens de standaard protocollen. Gebruik een schone, scherpe scalpel om de polymerase keten reageren product accijns en zuiveren van het DNA met behulp van een gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.Meet de concentratie van het product met behulp van een spectrofotometer op 260 nanometer absorptie. Bereid een testmix met 200 nanogram van het geïsoleerde DNA, twee microliters van T7 endonuclease I reactiebuffer en genoeg dubbel gedestilleerd water om het uiteindelijke volume van het mengsel op 19 microliter te brengen. Reanneal het polymerase kettingreactieproduct in een thermische cycler op de aangegeven parameters en meng vijf eenheden T7 endonuclease I met het gereannealeerde product voor een 50 minuten durende incubatie bij 37 graden Celsius.Los aan het einde van de incubatie het verteerde DNA op een 2,5%agarosegel op met behulp van 1X TAE-buffer en beeld de gel op een geschikt gelbeeldvormingssysteem. Open de gelafbeelding in ImageJ en teken een rechthoekig vak rond de band zo dicht mogelijk bij de grens. Klik op Analyseren en Metingen instellen, controleer of het gebied, de gemiddelde grijze waarde en de opties voor geïntegreerde dichtheid zijn ingeschakeld.Klik op OK en selecteer Analyseren en Meten. De gemiddelde, of ruwe intensiteit dichtheid waarde, is indicatief voor de band intensiteit. Wanneer de cultuur-transfected cellen beginnen steeds vloeiend, los ze met trypsin-EDTA, zoals aangetoond, en zaad van de cellen schaars in een 100 millimeter weefsel cultuur schotel om voldoende ruimte voor individuele kolonies om te groeien voordat de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator.Wanneer de kolonies beginnen te vormen, gebruik dan een microscoop met een 4 X vergroting om de individuele kolonies te halen voor overdracht in individuele putten van een 24-bron plaat met 500 microliter van celcultuur medium per goed. Zorg ervoor dat uw tip niet de omliggende kolonies raakt om te voorkomen dat het mengen van kolonies binnen individuele putten of kies uit een gebied van schaarse kolonie groei. Wanneer alle klonen zijn geplukt, plaats de plaat in de celcultuur incubator totdat de culturen worden confluent.Omdat onverteerde plasmiden supergerold zijn, lopen ze meestal sneller dan hun gelinelineiseerde tegenhangers. Om te bepalen of de oligonucleotiden met succes zijn gekloond in de CRISPR plasmid backbone, wordt kolonie PCR uitgevoerd en worden de positieve klonen ingeënt voordat de plasmiden worden geëxtraheerd en verzonden voor Sanger sequencing. Het fluorescerende signaal kan gemakkelijk worden gevisualiseerd onder een microscoop bij een succesvolle levering van de plasmiden, waardoor de doorfecteerde cellen kunnen worden gesorteerd op stroomcytometrie.Een T7 endonuclease I test wordt uitgevoerd om de decolleté efficiëntie van het genomische DNA te controleren, zoals berekend op basis van de intensiteit van de banden waargenomen op een agarose gel. Bovendien, als een homo-gestuurde reparatie-gebaseerde experiment is ontworpen om een beperking site op te nemen op de doel locus, een beperking fragment lengte polymorfisme test kan worden uitgevoerd met een overeenkomstige beperking enzym. Om verder te valideren dat een eiwitcompederend gen met succes is geïnactiveerd, kan een westerse vlek worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen gericht eiwit aanwezig is.Het sorteren van de cellen na transfectie elimineert de cellen zonder opgenomen plasmiden, waardoor het percentage cellen dat in latere stadia wordt gescreend, toeneemt als een knock-out- of knock-in gen. Met de ontwikkeling van deze techniek zijn we nu in staat om knock-out cellijnen te produceren om de genfunctie en knock-in cellijnen te bestuderen om specifieke ziekten te modelleren om hun mechanisme te begrijpen.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

CRISPR-gemedieerde genoom uitgeven van het menselijke schimmel pathogeen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

Transformeren, genoom bewerking en Fenotyping de stikstoffixatie tropische Cannabaceae boom Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-Gemedieerd Genoombewerking in de filamenteuze Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...