Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

M.H.T. wordt ondersteund door een Agentschap voor wetenschap, technologie en onderzoek de gezamenlijke Raad Office grant (1431AFG103), een nationale Medical Research Council verlenen (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation verleent (NRF2013-THE001-046 en NRF2013-THE001-093), een Ministerie van onderwijs Tier 1 grant (RG50/17 (S)), een startup verlenen vanaf Nanyang Technological University, en fondsen voor de internationale genetisch Engineering Machine (iGEM) concurrentie van Nanyang Technological University.

1. ontwerp van sgRNAs
<ol><li>Selecteer een passend CRISPR-Cas-systeem.<ol>
<li>Eerst, Inspecteer de regio van de doelgroep voor de PAM sequenties van alle Cas9 en Cas12a nucleasen, die hebben aangetoond dat functioneel in zoogdiercellen16,21-32. Vijf veel gebruikte enzymen zijn gegeven in tabel 1 samen met hun respectieve PAMs. Opmerking: naast de enzym vermeld in tabel 1, er zijn andere minder gebruikte Cas-enzymen die met succes zijn ingezet in zoogdiercellen eveneens,...

Het CRISPR-Cas-systeem is een krachtige, revolutionaire technologie om ingenieur van het genoom en de transcriptomes van planten en dieren. Talrijke bacteriesoorten bleken te bevatten van de CRISPR-Cas systemen, die potentieel kunnen worden aangepast voor genoom en transcriptome engineering doeleinden44. Hoewel de endonuclease van de Cas9 van Streptococcus pyogenes (SpCas9) was het eerste enzym met succes worden ingezet in menselijke cellen21,<sup class=...

De mogelijkheid om ingenieur van het genoom van elk levend organisme heeft vele biomedische en biotechnologische toepassingen, zoals de correctie van de ziekte-veroorzakende mutaties, bouw van accurate cellulaire modellen voor ziekte studies of generatie van landbouw gewassen met wenselijke eigenschappen. Sinds het begin van de eeuw, verschillende technologieën zijn ontwikkeld voor genoom engineering in zoogdiercellen, met inbegrip van meganucleases1,2,3, elektrolytisch vinger nucleasen4,5, of transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs)6,7,8,9. Echter zijn deze eerdere technologieën moeilijk te programma of vervelend te monteren, waardoor hun wijdverspreide goedkeuring in onderzoek en de industrie te belemmeren.
In de afgelopen jaren de geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) - CRISPR-geassocieerde (Cas) systeem heeft ontpopt als een krachtige nieuwe genoom engineering technologie10,11. Oorspronkelijk een adaptieve immuunsysteem in bacteriën, is met succes ingezet voor het wijzigen van het genoom in planten en dieren, inclusief de mens. Een primaire reden waarom CRISPR-Cas heeft populariteit zo veel in zo'n korte tijd is dat het element dat de belangrijkste Cas-endonuclease, zoals Cas9 of Cas12a brengt (ook bekend als Cpf1), naar de juiste locatie in het genoom is gewoon een klein stukje chimeer één gids RN A (sgRNA), die is ontwerp eenvoudig en goedkoop te synthetiseren. Na wordt gerekruteerd om de doelsite, het Cas-enzym functioneert als een paar van moleculaire schaar en cleaves het afhankelijke DNA met haar RuvC, HNH of NOC domeinen12,13,14. De resulterende dubbele gestrande onderbreking (DSB) wordt later hersteld door de cellen via niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) of de homologie geleide reparatie (HDR) traject. Bij gebrek aan een reparatie-sjabloon, wordt de DSB hersteld door de vergissing-geneigd NHEJ traject, die aanleiding tot pseudo-willekeurige invoeging of schrapping van nucleotiden (microdeleties) op de gesneden site geven kan, mogelijk veroorzaakt frameshift mutaties in eiwit-codeert genen. Echter in de aanwezigheid van een donor-sjabloon die de gewenste DNA wijzigingen bevat, wordt de DSB hersteld door het traject van de HDR high fidelity. Gangbare typen van donor sjablonen zijn single-stranded oligonucleotides (ssODNs) en plasmiden. De voormalige wordt meestal gebruikt als de beoogde DNA veranderingen klein (bijvoorbeeld wijziging van een enkelvoudige basenpaar), zijn terwijl de laatste meestal gebruikt wordt als men het wil invoegen een relatief lange reeks (bijvoorbeeld de codering opeenvolging van een groen fluorescent proteïne of GFP) in de locus van het doel.
De endonuclease activiteit van het eiwit van Cas vereist de aanwezigheid van een protospacer aangrenzende motief (PAM) op de target website15. De PAM van Cas9 is aan de 3'-eind van de protospacer, terwijl de PAM van Cas12a (ook wel Cpf1 genoemd) in plaats daarvan aan het einde 5'16. Het Cas-guide RNA complex is niet in staat om een DSB als de PAM afwezig17 is. Vandaar, de PAM legt een beperking op de genomic locaties waar een bepaalde Cas nuclease vermag klieven. Gelukkig, Cas nucleasen van verschillende bacteriesoorten vertonen meestal verschillende PAM eisen. Vandaar, door de integratie van verschillende systemen van de CRISPR-Cas in onze engineering toolbox, we kunnen uit te breiden het bereik van sites die in een genoom kunnen worden gericht. Bovendien kan een natuurlijke Cas enzym worden ontworpen of geëvolueerd om te herkennen van de alternatieve opeenvolgingen van het PAM, verdere uitbreiding van het toepassingsgebied van genomic doelstellingen toegankelijk voor manipulatie18,19,20.
Hoewel meerdere CRISPR-Cas systemen beschikbaar voor technische doeleinden genoom zijn, hebben de meeste gebruikers van de technologie vertrouwd voornamelijk op de Cas9 nuclease van Streptococcus pyogenes (SpCas9) om meerdere redenen. Ten eerste, het vereist een relatief eenvoudig NGG PAM, in tegenstelling tot veel andere certificeringsinstanties eiwitten die kunnen alleen in de aanwezigheid van meer complexe PAMs klieven. Ten tweede, het is de eerste Cas endonuclease om te worden geïmplementeerd in menselijke cellen21,22,23,24. Ten derde, SpCas9 is veruit het beste gekarakteriseerd enzym tot nu toe. Als een onderzoeker wil gebruiken een ander Cas nuclease, zou hij of zij vaak onduidelijk over de beste manier om het experiment en hoe goed de andere enzymen zal presteren in verschillende biologische contexten, in vergelijking met SpCas9 te ontwerpen.
Om duidelijkheid aan de relatieve prestaties van de verschillende systemen van de CRISPR-Cas, hebben we onlangs uitgevoerd een systematische vergelijking van vijf Cas enzym-SpCas9, het Cas9-enzym van Staphylococcus aureus (SaCas9), het enzym van de Cas9 van Neisseria meningitidis (NmCas9), het Cas12a-enzym van Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), en het enzym van de Cas12a van de Lachnospiraceae bacterie ND2006 (LbCas12a)25. We geëvalueerd voor een eerlijke vergelijking, de diverse Cas nucleasen met behulp van dezelfde set doel sites en andere experimentele omstandigheden. De studie ook afgebakend ontwerpparameters voor elk CRISPR-Cas-systeem, die als een nuttige referentie voor gebruikers van de technologie dienen zou. Hier, beter in staat stellen onderzoekers gebruik te maken van de CRISPR-Cas systeem, wij bieden een stapsgewijze protocol voor optimale genoom engineering met verschillende Cas9 en Cas12a enzymen (Zie Figuur 1). Het protocol omvat niet alleen experimentele details maar ook belangrijke ontwerpoverwegingen te maximaliseren van de kans op een succesvolle genoom engineering resultaat in zoogdiercellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> Figuur 1 : Een overzicht van de workflow voor het genereren van genoom bewerkt menselijke cellijnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) systeem functioneert uiteraard in bacteriële adaptieve immuniteit, maar heeft met succes zijn voorzien voor genoom engineering in vele andere levende organismen. Meestal de wildtype CRISPR verbonden 9 (Cas9) of Cas12a endonuclease wordt gebruikt om specifieke locaties in het genoom, waarna de pauze van de double-stranded DNA is gerepareerd via het niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) traject of de homologie geleide reparatie (klieven HDR) traject afhankelijk van of een donor-sjabloon is afwezig of respectievelijk presenteren. Tot op heden, is CRISPR systemen van verschillende bacteriesoorten gebleken kunnen bewerkingen genoom toe te passen in zoogdiercellen. Ondanks de schijnbare eenvoud van de technologie moeten meerdere ontwerpparameters echter worden overwogen, waardoor vaak gebruikers verbijsterd over het beste uit hun genoom bewerken experimenten te voeren. Hier beschrijven we een complete workflow van experimenteel design tot identificatie van cel klonen die gewenste DNA wijzigingen, met het doel van het vergemakkelijken van de succesvolle uitvoering van experimenten in zoogdieren cellijnen bewerken genoom dragen. We benadrukken belangrijke overwegingen voor gebruikers nota te nemen van, met inbegrip van de keuze van het CRISPR systeem, de lengte van de spacer en het ontwerp van een sjabloon van de donor single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN). Wij voorzien dat deze werkstroom zal zitten nuttig voor gene knockout studies, ziekte modellering van inspanningen, of de generatie van verslaggever cellijnen.

Voor het uitvoeren van een experiment, een CRISPR-plasmide uiting geven aan een sgRNA gericht op die de locus-of-interest moet worden gekloond bewerken genoom. Ten eerste, de plasmide wordt verteerd met een restrictie-enzym (meestal een type IIs enzym) aan het linearize. Het is raadzaam om op te lossen het verteerd product op een 1% agarose gel naast een onverteerd plasmide onderscheid maken tussen een volledige en gedeeltelijke vertering. Zoals onverteerd plasmiden supercoiled, ze de neiging om sneller dan hun gelineari...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

CRISPR-Cas is een krachtige technologie om ingenieur van het complex genoom van planten en dieren. Hier, detail we een protocol bij het menselijk genoom met behulp van verschillende Cas enzym efficiënt te bewerken. We benadrukken belangrijke overwegingen en ontwerpparameters bewerken efficiëntie te optimaliseren.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Dit protocol maakt gebruik van CRISPR-Cas9 om knock-out- of knock-inlijnen te maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en efficiënt te volgen vooral voor beginnende onderzoekers. Voor celdoorgang behandel u 's nachts gekweekte cellen met twee milliliters van 0,25% trypsine EDTA per plaat bij 37 graden Celsius gedurende twee minuten.Wanneer de cellen van de plaatbodems zijn opgeheven, neutraliseert u de enzymatische reactie met twee milliliter celkweekmedium en breng de celsuspensie over naar een conische buis. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in vijf milliliter van verse cel cultuur medium voor het tellen. Dan zaad 1,8 keer 10 tot de vijfde cellen in een put van een 24-well weefsel cultuur plaat voor 's nachts cultuur op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Voor de transfectie van de cellen moet, volgens het experimentele ontwerp en de instructies van de fabrikant, een passend volume van de transfectiemix met de juiste concentratie CRISPR-plasmid worden toegevoegd aan het juiste volume van het transfectiereagemiddel. Na het uitbroeden van de transfectie mix bij kamertemperatuur voor de aanbevolen periode, voeg de oplossing aan de cellen in een druppel-wise manier. Draai vervolgens voorzichtig de plaat om te mengen en plaats de plaat in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator met 5%kooldioxide.Voeg aan het einde van de transfectie 150 microliters trypsin-EDTA toe om de cellen te scheiden zoals net is aangetoond en verzamel de losgemaakte cellen door centrifugatie. Resuspend de pellet in 2%foetale runderserum in PBS en filter de cellen door een 30 micrometer mesh zeef in een vijf milliliter fluorescentie-geactiveerde celsorteren, of FACS buis. Gebruik vervolgens de niet-doorgesneden cellen om een negatieve controlepoort op de stroomcytometer in te stellen en de doorgesneden cellen te sorteren op basis van de fluorescerende marker op de CRISPR-plasmide die voor de doorfectie wordt gebruikt in een buis met 100 microliters celkweekmedium.Wanneer alle transfected cellen zijn verzameld, pellet de cellen door centrifugatie op maximale snelheid en resuspend de pellet in 300 microliters van celkweek medium. Zaad 200 microliter cellen in een put van een 24-well weefsel kweekplaat en laat de cellen om te herstellen voor een paar dagen in een 37 graden Celsius incubator. Pellet de resterende 100 microliters van gesorteerde cellen op maximale snelheid gedurende vijf minuten en haal het genomische DNA uit de resulterende pellet volgens de standaard DNA-extractieprotocollen.Voeg vervolgens 10 microliter polymerase kettingreactiebuffer, een microliter deoxynucleotidemix, 2,5 microliter van door de gebruiker gedefinieerde reverse primer, 0,5 microliter DNA polymerase, twee tot vijf microliter van de geëxtraheerde genomic DNA-sjabloon en genoeg dubbel gedestilleerd water toe om de reactie naar een uiteindelijk volume van 50 microliter te brengen. Voer het mengsel op een thermische cycler en los de reactie op een 2%agarose gel met behulp van 1X TAE buffer volgens de standaard protocollen. Gebruik een schone, scherpe scalpel om de polymerase keten reageren product accijns en zuiveren van het DNA met behulp van een gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.Meet de concentratie van het product met behulp van een spectrofotometer op 260 nanometer absorptie. Bereid een testmix met 200 nanogram van het geïsoleerde DNA, twee microliters van T7 endonuclease I reactiebuffer en genoeg dubbel gedestilleerd water om het uiteindelijke volume van het mengsel op 19 microliter te brengen. Reanneal het polymerase kettingreactieproduct in een thermische cycler op de aangegeven parameters en meng vijf eenheden T7 endonuclease I met het gereannealeerde product voor een 50 minuten durende incubatie bij 37 graden Celsius.Los aan het einde van de incubatie het verteerde DNA op een 2,5%agarosegel op met behulp van 1X TAE-buffer en beeld de gel op een geschikt gelbeeldvormingssysteem. Open de gelafbeelding in ImageJ en teken een rechthoekig vak rond de band zo dicht mogelijk bij de grens. Klik op Analyseren en Metingen instellen, controleer of het gebied, de gemiddelde grijze waarde en de opties voor geïntegreerde dichtheid zijn ingeschakeld.Klik op OK en selecteer Analyseren en Meten. De gemiddelde, of ruwe intensiteit dichtheid waarde, is indicatief voor de band intensiteit. Wanneer de cultuur-transfected cellen beginnen steeds vloeiend, los ze met trypsin-EDTA, zoals aangetoond, en zaad van de cellen schaars in een 100 millimeter weefsel cultuur schotel om voldoende ruimte voor individuele kolonies om te groeien voordat de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator.Wanneer de kolonies beginnen te vormen, gebruik dan een microscoop met een 4 X vergroting om de individuele kolonies te halen voor overdracht in individuele putten van een 24-bron plaat met 500 microliter van celcultuur medium per goed. Zorg ervoor dat uw tip niet de omliggende kolonies raakt om te voorkomen dat het mengen van kolonies binnen individuele putten of kies uit een gebied van schaarse kolonie groei. Wanneer alle klonen zijn geplukt, plaats de plaat in de celcultuur incubator totdat de culturen worden confluent.Omdat onverteerde plasmiden supergerold zijn, lopen ze meestal sneller dan hun gelinelineiseerde tegenhangers. Om te bepalen of de oligonucleotiden met succes zijn gekloond in de CRISPR plasmid backbone, wordt kolonie PCR uitgevoerd en worden de positieve klonen ingeënt voordat de plasmiden worden geëxtraheerd en verzonden voor Sanger sequencing. Het fluorescerende signaal kan gemakkelijk worden gevisualiseerd onder een microscoop bij een succesvolle levering van de plasmiden, waardoor de doorfecteerde cellen kunnen worden gesorteerd op stroomcytometrie.Een T7 endonuclease I test wordt uitgevoerd om de decolleté efficiëntie van het genomische DNA te controleren, zoals berekend op basis van de intensiteit van de banden waargenomen op een agarose gel. Bovendien, als een homo-gestuurde reparatie-gebaseerde experiment is ontworpen om een beperking site op te nemen op de doel locus, een beperking fragment lengte polymorfisme test kan worden uitgevoerd met een overeenkomstige beperking enzym. Om verder te valideren dat een eiwitcompederend gen met succes is geïnactiveerd, kan een westerse vlek worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen gericht eiwit aanwezig is.Het sorteren van de cellen na transfectie elimineert de cellen zonder opgenomen plasmiden, waardoor het percentage cellen dat in latere stadia wordt gescreend, toeneemt als een knock-out- of knock-in gen. Met de ontwikkeling van deze techniek zijn we nu in staat om knock-out cellijnen te produceren om de genfunctie en knock-in cellijnen te bestuderen om specifieke ziekten te modelleren om hun mechanisme te begrijpen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-gemedieerde genoom uitgeven van het menselijke schimmel pathogeen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformeren, genoom bewerking en Fenotyping de stikstoffixatie tropische Cannabaceae boom Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Gemedieerd Genoombewerking in de filamenteuze Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...