Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
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M.H.T. est pris en charge par un organisme de délivrance de bureau conseil commun Science Technology and Research (1431AFG103), un Conseil National de la recherche médicale accorde (OFIRG/0017/2016), accorde à la National Research Foundation (NRF2013-THE001-046 et NRF2013-THE001-093), un Subvention du ministère de l’éducation niveau 1 (RG50/17 (S)), une startup subvention de Nanyang Technological University et les fonds pour le concours International génétiquement ingénierie Machine (iGEM) de Nanyang Technological University.

1. conception de sgRNAs
<ol><li>Sélectionnez un système CRISPR-Cas approprié.<ol>
<li>Tout d’abord, examinez la région cible pour les séquences de PAM de tous les nucléases Cas9 et Cas12a qui sont sont révélées être fonctionnel dans les cellules de mammifères16,21-32. Cinq enzymes fréquemment utilisés sont donnés dans le tableau 1 ainsi que de leurs respectifs PAMs. Remarque : outre les endonucléases énumérés au tableau 1, il existe d’autres enzymes...

Le système CRISPR-Cas est une puissante technologie révolutionnaire à l’ingénieur les génomes et les transcriptions des plantes et des animaux. De nombreuses espèces bactériennes ont été trouvés pour contenir les systèmes CRISPR-Cas, qui peuvent éventuellement être adaptées pour le génome et transcriptome fins44d’ingénierie. Bien que l’endonucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) a été la première enzyme qui seront déployés avec succès dans les cellule...

La capacité à l’ingénieur le génome de tout organisme vivant a beaucoup d’applications biomédicales et biotechnologiques, telles que la correction des pathogènes mutations, construction de modèles cellulaires précis pour les études de la maladie, ou génération d’agricoles cultures avec traits désirables. Depuis le tournant du siècle, plusieurs technologies ont été développées pour le génie du génome dans les cellules de mammifères, y compris les méganucléases1,2,3, zinc finger nucleases4,5, ou transcription activator comme effecteur nucléases (TAPS)6,7,8,9. Cependant, ces technologies antérieures sont difficiles à programmer ou fastidieux à monter, ce qui entrave leur adoption généralisée dans la recherche et l’industrie.
Ces dernières années, le cluster régulièrement ponctuées de courtes répétitions palindromiques (CRISPR) - système associées à CRISPR (Cas) a émergé comme un puissant génome nouvel ingénierie technologie10,11. Initialement un système immunitaire adaptatif chez les bactéries, il a été correctement déployé pour la modification du génome chez les plantes et les animaux, y compris les humains. Des principales raisons pourquoi CRISPR-Cas a gagné en popularité autant en si peu de temps qui est l’élément qui apporte l’endonucléase de Cas clé, tels que Cas9 ou Cas12a (également connu comme Cpf1), à l’emplacement correct dans le génome est simplement un petit morceau de guide unique chimérique RN A (sgRNA), qui est simple de conception et pas cher à synthétiser. Après recrutement vers le site cible, l’enzyme Cas fonctionne comme une paire de ciseaux moléculaires et fend l’ADN lié avec son RuvC, HNH ou Nuc domaines12,13,14. La rupture de brin double (DSB) qui en résulte est réparée par la suite par les cellules via la fin non homologue rejoindre (NHEJ) ou voie de réparation axés sur l’homologie (HDR). En l’absence d’un modèle de la réparation, l’ORD est réparé par la voie NHEJ erreurs, qui peut donner lieu à pseudo-aléatoire d’insertion ou de suppression de nucléotides (indels) sur le site de la coupe, causant potentiellement déphasage des mutations dans les gènes codant pour des protéines. Toutefois, en présence d’un modèle de donateurs qui contient les modifications souhaitées de l’ADN, l’ORD est réparé par la voie du HDR haute fidélité. Types communs de modèles de donateurs comprennent des oligonucléotides monocaténaires (ssODNs) et plasmides. Le premier est généralement utilisé si les changements prévus de l’ADN sont de petite taille (par exemple, modification d’un seul nucléotide), alors que ce dernier est généralement utilisé si l'on veut introduire une séquence relativement longue (par exemple, la séquence codante d’une protéine fluorescente verte ou GFP) dans le locus de la cible.
L’activité endonucléasique de la protéine Cas nécessite la présence d’un motif adjacent de protospacer (PAM) à la cible site15. Le PAM de Cas9 est à l’extrémité 3' de la protospacer, tandis que le PAM de Cas12a (également appelé Cpf1) est à l’extrémité 5' à la place16. Le Cas-guide RNA complexe ne peut pas introduire un ORD si la PAM est absente17. Par conséquent, la PAM place une contrainte sur les génomiques emplacements où une nucléase de Cas particulier est capable de cliver. Heureusement, nucléases Cas de différentes espèces de bactéries présentent généralement des exigences différentes de PAM. Par conséquent, en intégrant différents systèmes CRISPR-Cas dans notre boîte à outils technique, nous pouvons élargir l’éventail des sites qui peuvent être ciblés dans un génome. En outre, une enzyme naturelle de Cas peut être conçue ou évoluée pour reconnaître les alternatives des séquences de PAM, encore élargir la portée de génomiques cibles accessibles aux manipulations18,19,20.
Bien que plusieurs systèmes CRISPR-Cas soient disponibles pour fins d’ingénierie du génome, la plupart des utilisateurs de la technologie sont appuient principalement sur la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) pour de multiples raisons. Tout d’abord, il faut un PAM relativement simplement NGG, contrairement à plusieurs autres protéines de Cas qui peuvent s’attacher uniquement en présence de SDS plus complexes. Deuxièmement, il est le premier endonucléase de Cas qui seront déployés avec succès dans les cellules humaines21,22,23,24. En troisième lieu, le SpCas9 est de loin la meilleure enzyme caractérisé à ce jour. Si un chercheur souhaite utiliser la nucléase un autre Cas, il ou elle serait souvent peu claire sur la meilleure façon de concevoir l’expérience et comment bien les autres enzymes seront produira dans différents contextes biologiques par rapport à SpCas9.
Pour fournir la clarté à la performance relative des différents systèmes CRISPR-Cas, nous avons récemment effectué une comparaison systématique des cinq endonucléases de Cas – SpCas9, l’enzyme Cas9 Staphylococcus aureus (SaCas9), l’enzyme Cas9 de Neisseria meningitidis (NmCas9), l’enzyme Cas12a de Acidaminococcus SP. BV3L6 (AsCas12a) et l’enzyme Cas12a de bactérie Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. Pour une comparaison équitable, nous avons évalué les nucléases de Cas différents, en utilisant le même ensemble de sites cibles et autres conditions expérimentales. Les paramètres de conception d’étude aussi délimité pour chaque système de SAE-CRISPR, qui servirait de référence utile pour les utilisateurs de la technologie. Ici, pour mieux permettre aux chercheurs de faire usage de la SAE-CRISPR système, nous fournissons un protocole étape par étape pour le génie de génome optimale avec des enzymes de Cas9 et Cas12a différentes (voir Figure 1). Le protocole inclut non seulement les détails expérimentaux, mais les considérations de conception aussi important pour maximiser la probabilité d’un résultat technique génome réussie dans les cellules de mammifères.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> Figure 1 : Une vue d’ensemble du flux de travail pour générer du génome édité des lignées cellulaires humaines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

Le système régulièrement dois‑je courts palindromes répétitions (CRISPR) en cluster fonctionne naturellement dans l’immunité adaptative bactérienne, mais a été réorienté avec succès pour le génie du génome chez de nombreux organismes de vie différents. Le plus souvent, le type sauvage CRISPR associés 9 (Cas9) ou endonucléase de Cas12a est utilisé en conjonction avec des sites spécifiques dans le génome, après quoi la rupture d’ADN double brin est réparée par l’intermédiaire de la fin non homologue, rejoindre la voie (NHEJ) ou le (réparation axés sur l’homologie Voie HDR) selon si un modèle de donneur est absent ou présentent respectivement. A ce jour, systèmes CRISPR provenant de différentes espèces bactériennes ont démontré être capable d’effectuer le montage de génome dans les cellules de mammifères. Toutefois, malgré l’apparente simplicité de la technologie, plusieurs paramètres de conception doivent être prises en considération qui laissent souvent perplexes sur la façon de mieux pour réaliser leur génome édition expériences les utilisateurs. Nous décrivons ici un workflow complet de conception expérimentale à l’identification des clones de cellules qui transportent les adaptations ADN désirées, dans le but de faciliter l’exécution réussie du génome édition des expériences dans des lignées cellulaires de mammifères. Nous mettons en évidence les considérations clés pour les utilisateurs de prendre note du, y compris le choix du système CRISPR, la longueur de l’entretoise et la conception d’un modèle de donateurs monocaténaire ODN (ssODN). Nous prévoyons que ce flux de travail vous sera utile pour les études de gènes knockout, modélisation des efforts, la maladie ou la génération de reporter des lignées cellulaires.

Pour effectuer un génome édition experiment, un plasmide CRISPR exprimant un sgRNA ciblant que le locus d’intérêt doit être cloné. Tout d’abord, le plasmide est digéré par une enzyme de restriction (généralement de type IIs enzyme) de linéariser il. Il est recommandé de régler le produit digéré sur un gel d’agarose de 1 % aux côtés d’un plasmide non digéré de distinguer une digestion complète ou partielle. Comme les plasmides non digérés sont surenroulés, ils ont tendance à courir plus vit...

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Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Modification du génome dans des lignées de cellules mammifères à l’aide de CRISPR-Cas

SAE-CRISPR est une technologie puissante à l’ingénieur les génomes complexes de plantes et d’animaux. Ici, nous détaillons un protocole pour modifier efficacement le génome humain endonucléases de Cas différents. Nous mettons en évidence les considérations importantes et des paramètres de conception pour optimiser l’efficacité édition.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Ce protocole utilise CRISPR-Cas9 pour créer des lignes knock-out ou knock-in. Le principal avantage de cette technique est qu’il est simple et efficace à suivre en particulier pour les chercheurs novices. Pour le passage cellulaire, traiter les cellules de culture pendant la nuit avec deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA par plaque à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.Lorsque les cellules se sont levées du fond de la plaque, neutraliser la réaction enzymatique avec deux millilitres de milieu de culture cellulaire, et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre la pastille en cinq millilitres de milieu de culture cellulaire fraîche pour le comptage. Puis semer 1,8 fois 10 à la cinquième cellule dans un puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits pour la culture du jour au lendemain à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Pour la transfection des cellules, ajouter un volume approprié de mélange de transfection contenant la concentration appropriée de plasmide CRISPR au volume approprié de réaccente de transfection, selon la conception expérimentale et les instructions du fabricant. Après avoir incubé le mélange de transfection à température ambiante pendant la période recommandée, ajoutez la solution aux cellules d’une manière goutte-sage. Puis faites pivoter doucement la plaque pour mélanger et placer la plaque dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.À la fin de la transfection, ajouter 150 microlitres de trypsine-EDTA pour dissocier les cellules comme vient de le démontrer et recueillir les cellules détachées par centrifugation. Resuspendez la pastille dans 2% sérum bovin fœtal dans PBS et filtrez les cellules à travers une passoire en maille de 30 micromètres dans un tri cellulaire activé par fluorescence de cinq millilitres, ou tube FACS. Ensuite, utilisez les cellules non transfected pour définir une barrière de contrôle négative sur le cytomètre d’écoulement et trier les cellules transfected selon le marqueur fluorescent sur le plasmide CRISPR utilisé pour la transfection dans un tube contenant 100 microlitres de milieu de culture cellulaire.Lorsque toutes les cellules transfectées ont été collectées, pelleter les cellules par centrifugation à vitesse maximale et résuspendre la pastille dans 300 microlitres de milieu de culture cellulaire. Ensemencer 200 microlitres de cellules dans un puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits et permettre aux cellules de récupérer pendant quelques jours dans un incubateur de 37 degrés Celsius. Pelleter les 100 microlitres restants des cellules triées à vitesse maximale pendant cinq minutes et extraire l’ADN génomique de la pastille résultante selon les protocoles standard d’extraction de l’ADN.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de tampon de réaction en chaîne de polymésase, un microlitre de mélange de désoxynucléotide, 2,5 microlitres d’amorce inverse définie par l’utilisateur, 0,5 microlitres de polyméthère d’ADN, deux à cinq microlitres du modèle d’ADN génomique extrait et suffisamment d’eau double-distillée pour apporter la réaction à un volume final de 50 microlitres. Exécutez le mélange sur un cycleur thermique et résolvez la réaction sur un gel d’agarose de 2% utilisant le tampon 1X TAE selon les protocoles standard. Utilisez un scalpel propre et pointu pour exciser le produit réagir à la chaîne de polymésase et purifier l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon les instructions du fabricant.Mesurer la concentration du produit à l’aide d’un spectrophotomètre à 260 nanomètres d’absorption. Préparez un mélange d’analyse contenant 200 nanogrammes de l’ADN isolé, deux microlitres de tampon de réaction T7 endonuclease I, et suffisamment d’eau double-distillée pour porter le volume final du mélange à 19 microlitres. Reanneal le produit de réaction en chaîne de polymése dans un cycleur thermique aux paramètres indiqués et mélanger cinq unités d’endonuclease I de T7 avec le produit réannealed pour une incubation de 50 minutes à 37 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, résoudre l’ADN digéré sur un gel agarose de 2,5% à l’aide du tampon 1X TAE, et l’image du gel sur un système d’imagerie gel approprié. Ouvrez l’image de gel dans ImageJ et dessinez une boîte rectangulaire autour de la bande aussi près que possible de sa limite. Cliquez sur Analyser et définir les mesures, confirmant que la zone, la valeur grise moyenne et les options de densité intégrées sont vérifiées.Cliquez sur OK, et sélectionnez Analyser et mesurer. La valeur moyenne, ou valeur de densité d’intensité brute, est indicative de l’intensité de la bande. Lorsque les cellules transfectées par la culture commencent à devenir confluentes, détachez-les avec de la trypsine-EDTA, comme démontré, et ensemencez les cellules de façon clairsemée dans un plat de culture tissulaire de 100 millimètres pour permettre aux colonies individuelles de croître avant de retourner les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire.Lorsque les colonies commencent à se former, utilisez un microscope avec un grossissement de quatre X pour choisir les colonies individuelles pour le transfert dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de milieu de culture cellulaire par puits. Faites en sorte que votre pointe ne touche pas les colonies environnantes pour empêcher le mélange des colonies à l’intérieur de puits individuels ou de cueillir dans une zone de croissance de colonie clairsemée. Lorsque tous les clones ont été cueillis, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les cultures deviennent confluentes.Comme les plasmides non digérés sont super-bobines, ils ont tendance à courir plus vite que leurs homologues linéarisés. Pour déterminer si les oligonucléotides ont été clonés avec succès dans l’épine dorsale plasmide CRISPR, la PCR de la colonie est effectuée et les clones positifs sont inoculés avant que les plasmides ne soient extraits et envoyés pour le séquençage sanger. Le signal fluorescent peut être facilement visualisé au microscope lors d’une livraison réussie des plasmides, permettant aux cellules transfectées d’être triées par cytométrie d’écoulement.Un test T7 endonuclease I est effectué pour vérifier l’efficacité du clivage de l’ADN génomique, tel que calculé à partir des intensités des bandes observées sur un gel d’agarose. En outre, si une expérience basée sur la réparation dirigée par homologie est conçue pour incorporer un site de restriction au locus cible, un test de polymorphisme de longueur de fragment de restriction peut être exécuté avec une enzyme de restriction correspondante. Pour valider davantage qu’un gène codant protéique a été inactivé avec succès, une tache occidentale peut être effectuée pour s’assurer qu’aucune protéine ciblée n’est présente.Le tri des cellules après la transfection élimine les cellules sans plasmides incorporés, augmentant ainsi le pourcentage de cellules examinées à des stades ultérieurs comme ayant un gène knock-out ou knock-in. Avec le développement de cette technique, nous sommes maintenant en mesure de produire des lignées cellulaires knock-out pour étudier la fonction génétique et knock-in lignes cellulaires pour modéliser des maladies spécifiques pour comprendre leur mécanisme.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Détermination de l&#39;échelle du génome de Timing de réplication mammalienne par l&#39;ADN Mesure Contenu

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Recherche

Génétique

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Cartographie des interactions ARN-ARN à l&#39;échelle mondiale à l&#39;aide de psoralène biotinylé

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) dans les lignes de cellules T de souris

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Génome améliorée d’édition avec Cas9 ribonucléoprotéique dans diverses cellules et des organismes

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

Dissection de la fonction de Enhancer utilisant le Multiplex Enhancer CRISPR axée sur les interférences dans les lignées cellulaires

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

CRISPR-mediated génome édition du champignon pathogène humain Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

Transforming, Genome Editing and Phenoty the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii (en plus de la transformation, de l'édition du génome et du phénotypage de l'arbre tropical de Cannabaceae parasponia andersonii)

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

Identification des récepteurs de surface cellulaire à l’aide d’écrans génétiques CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Introduction de mutations ponctuelles dans des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide d’une édition transparente du génome

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascoycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...