Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

M.H.T. נתמך על ידי סוכנות מענק משרד המועצה המשותפת של מדע טכנולוגיה ומחקר (1431AFG103), המועצה הלאומית למחקר רפואי גרנט (OFIRG 0017 2016), קרן מחקר לאומי מעניק (NRF2013-THE001-046, NRF2013-THE001-093), משרד החינוך Tier 1 גרנט (RG50/17 (S)), סטארט-אפ הענק Nanyang הטכנולוגי מהאוניברסיטה, ו כספים עבור התחרות הבינלאומית גנטית הנדסת מכונות (iGEM) מאוניברסיטת Nanyang הטכנולוגי.

1. עיצוב של sgRNAs
<ol><li>בחר מערכת CRISPR-Cas המתאים.<ol>
<li>תחילה, בדוק את אזור היעד עבור רצפי פאם nucleases Cas9 ו Cas12a כל זה הוכחו להיות פונקציונלי ב בתרבית של תאים16,21-32. חמישה אנזימים הנמצאים בשימוש לעתים תכופות ניתנת טבלה 1 יחד עם PAMs המתאימים שלהם. הערה: חוץ endonucleases המפורטים בטבלה1, ...

מערכת CRISPR-Cas היא טכנולוגיה חזקה, מהפכני להנדס את הגנום ואת transcriptomes של צמחים ובעלי חיים. זנים חיידקיים רבים נמצאו יכילו מערכות CRISPR-Cas, אשר פוטנציאל עשוי להיות מותאם הגנום, transcriptome הנדסה למטרות44. למרות Cas9 endonuclease של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת (SpCas9) היה האנזים הראשון כדי לפ?...

היכולת מהנדס הגנום של כל אורגניזם חי יש לא מעט אפליקציות ביו, הביו-טכנולוגיה, כגון התיקון של גורמי מחלות מוטציות, בניית דגמי הסלולר מדויק לחקר המחלה, או דור של החקלאי יבולים עם תכונות רצויות. מאז המאה ה, טכנולוגיות שונות פותחו עבור גנום הנדסה בתאי יונקים, כולל meganucleases1,2,3, אבץ אצבע nucleases4,5, או תמלול אפקטור activator דמוי nucleases (TALENs)6,7,8,9. עם זאת, טכנולוגיות קודמות אלה הם קשה לתוכנית או מייגע להרכיב, ובכך פוגעות שלהם אימוץ נרחב מחקר ובתעשייה.
בשנים האחרונות, באופן קבוע באשכולות interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR) - מערכת CRISPR-הקשורים (Ca) התפתחה גנום חדש חזק הנדסה טכנולוגיה10,11. במקור מערכת חיסונית אדפטיבית בחיידקים, עבר בהצלחה לפריסה הגנום שינוי בצמחים ובעלי חיים, כולל האדם. הסיבות העיקריות מדוע CRISPR-Cas צברה פופולריות רבה בזמן כל כך קצר זה הרכיב המביאה את endonuclease Cas מפתח, כגון Cas9 או Cas12a (ידוע גם בשם Cpf1), על המיקום הנכון הגנום הוא פשוט חתיכת קצר מדריך בודד chimeric RN (SgRNA), אשר היא פעולה פשוטה עיצוב וזול לסנתז. לאחר לאתר היעד האנזים Cas מתפקד בתור זוג מספריים מולקולרית ודבק ה-DNA מאוגד עם שלו RuvC, HNH או Nuc תחומים12,13,14. מעבר נטושים כפול וכתוצאה מכך (DSB) לאחר מכן תיקון על ידי התאים באמצעות קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) או מסלול תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). בהיעדרו של תבנית תיקון, DSB יתוקן על ידי השביל NHEJ לשגיאות, אשר יכולים להצמיח אקראיים מדומים ההוספה או המחיקה של נוקלאוטידים (indels) באתר לחתוך, ובכך לגרום frameshift מוטציות בגנים חלבונים. עם זאת, בנוכחות התורם תבנית המכילה את השינויים הרצויים של הדנ א, DSB יתוקן על ידי השביל HDR דיוק גבוה. סוגים נפוצים של תבניות התורם כוללים חד גדילי oligonucleotides (ssODNs), פלסמידים. לשעבר משמש בדרך כלל אם השינויים DNA המיועד קטנות (לדוגמה, שינוי של בסיס יחיד זוג רשימות), בזמן האחרון זה משמש בדרך כלל אם אנחנו רוצים להוסיף רצף ארוך יחסית (לדוגמה, רצף קידוד של חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP) לתוך מיקומה היעד.
הפעילות endonuclease של החלבון Cas דורש הנוכחות של protospacer הסמוך מוטיב (פאם) ב אתר היעד15. פאם של Cas9 נמצא בקצה 3' של protospacer, פאם Cas12a (הנקראת גם Cpf1) נמצאת בקצה 5' במקום16. Cas-המדריך RNA מורכב אין אפשרות להציג DSB אם פאם הוא נעדר17. לפיכך, פאם המקומות אילוץ על המיקומים גנומית איפה מסוגל לבקע נוקלאז Cas מסוים. למרבה המזל, nucleases Cas של מינים שונים של חיידקים בדרך כלל התערוכה פאם דרישות שונות. לפיכך, על ידי שילוב של המערכות CRISPR-Cas השונות שלנו ארגז כלים הנדסיים, אפשר להרחיב את מגוון אתרים אשר עשוי להיות ממוקד הגנום. יתר על כן, אנזים Cas טבעי שניתן הנדסה לאחור או התפתחו כדי לזהות רצפים פאם חלופיים, שמפרידה את היקף נגיש מניפולציה18,19,20גנומית מטרות.
למרות מספר מערכות CRISPR-Cas זמינים למטרות הנדסה הגנום, רוב המשתמשים של הטכנולוגיה יש הסתמך בעיקר על נוקלאז Cas9 מ הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס (SpCas9) מסיבות רבות. קודם כל, זה דורש יחסית פשוט הגולה פאם, בניגוד רבים לחלבונים אחרים-Cas זה יכול לבקע רק בנוכחות PAMs מורכבים יותר. שנית, זה endonuclease Cas הראשון כדי לפרוס בהצלחה תאים אנושיים21,22,23,24. שלישית, SpCas9 הוא האנזים מאופיין בצורה הטובה ביותר עד כה. אם חוקר מבקש להשתמש נוקלאז Cas אחר, הוא או היא לעתים קרובות יהיה ברור על הדרך הטובה ביותר לעצב את הניסוי ותבצע כמה אנזימים אחרים בהקשרים ביולוגיים שונים, בהשוואה ל- SpCas9.
כדי להוסיף הבהרות לגבי את הביצועים היחסיים של מערכות CRISPR-Cas שונות, לאחרונה ערכנו השוואה שיטתית של חמש רשויות אישורים endonucleases – SpCas9, האנזים Cas9 מ Staphylococcus aureus (SaCas9), האנזים Cas9 מ- מנינגוקוקוס (NmCas9), האנזים Cas12a מן Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), האנזים Cas12a של החיידק Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. להשוואה הוגן, הערכנו את nucleases רשויות אישורים שונים באמצעות אותה קבוצה של אתרי יעד ותנאים אחרים ניסיוני. המחקר גם מאפשרת עיצוב הפרמטרים עבור כל מערכת CRISPR-Cas, אשר ישמש כהפניה שימושי עבור משתמשים של הטכנולוגיה. . הנה, טוב יותר לאפשר לחוקרים לנצל CRISPR-Cas מערכת, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הנדסה הגנום אופטימלית עם אנזימים שונים Cas9 ו- Cas12a (ראה איור 1). הפרוטוקול כוללת לא רק פרטים ניסיוני אבל שיקולי התכנון חשוב גם כדי להגדיל את הסבירות של תוצאה הנדסה מוצלחת הגנום בתאים בתרבית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> איור 1 : סקירה כללית של זרימת העבודה כדי ליצור הגנום נערך שורות תאים אנושיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

המערכת חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) באשכולות מתפקד באופן טבעי של חיידקי החסינות אדפטיבית, אך יש כבר בהצלחה לשנות את ייעודו הגנום הנדסה רבים אורגניזמים שונים. בדרך כלל, wildtype CRISPR הקשורים 9 (Cas9) או Cas12a endonuclease משמשת כדי לדבוק אתרים ספציפיים בגנום, אחרי אשר יתוקן מעבר כפול גדילי הדנ א באמצעות הסוף שאינם הומולוגיים הצטרפות לשביל (NHEJ) או את (תיקון מכוון הומולוגיה HDR) מסלול בהתאם תבנית התורם נעדרים או להציג בהתאמה. עד כה, CRISPR מערכות ממינים שונים חיידקי הוכחו להיות מסוגל לבצע עריכה הגנום בתאים בתרבית. עם זאת, למרות הפשטות לכאורה של הטכנולוגיה, מספר פרמטרים צריכים לקחת בחשבון, אשר לעיתים קרובות להשאיר משתמשים מבולבלים אודות הטוב ביותר לבצע את הגנום שלהם עריכת ניסויים. כאן, אנו מתארים שזרימת עבודה מלאה של הנבחנים: זיהוי של שיבוטים תא שנושאים שינויים DNA הרצוי, במטרה להקל על ביצוע מוצלח של הגנום עריכת ניסויים בקווים בתרבית של תאים. אנחנו האר שיקולים מרכזיים עבור משתמשים כדי לשים לב, כולל הבחירה של מערכת CRISPR, אורך מרווח, את העיצוב של תבנית התורם חד גדילי oligodeoxynucleotide (ssODN). נוכל לדמות כי זרימת עבודה זו תהיה שימושית ללימודים נוקאאוט גנטי, מחלת מידול המאמצים, או הדור של הכתב תא קווים.

כדי לבצע גנום עריכת ניסוי, פלסמיד CRISPR לבטא sgRNA מיקוד שלוקוס-של-הריבית צריכה להיות משובטים. קודם כל, פלסמיד מתעכלת עם אנזים ההגבלה (בדרך כלל סוג של IIs אנזים) כדי linearize זה. מומלץ לפתור את המוצר מתעכל על ג'ל agarose 1% לצד פלסמיד מעוכל להבחין בין עיכול מלאה או חלקית. כמו פלסמידים מעוכל הם supercoiled, הם נוטי...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

פרוטוקול זה משתמש ב- CRISPR-Cas9 כדי ליצור קווי נוקאאוט או נוקאאוט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה פשוט ויעיל לעקוב במיוחד עבור חוקרים טירון. עבור מעבר תאים, לטפל בתאים מתורבתים לילה עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לכל צלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.כאשר התאים התרוממים מתחתית הלוח, לנטרל את התגובה האנזימטית עם שני מיליליטר של מדיום תרבות התא, ולהעביר את ההשעיה התא צינור חרוט. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום תרבות תאים טריים לספירה. ואז לזרוע 1.8 פעמים 10 לתאים החמישיים לתוך באר אחת של צלחת תרבות רקמה 24 באר לתרבות הלילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.עבור transfection של התאים, להוסיף נפח מתאים של תערובת transfection המכיל את הריכוז המתאים של CRISPR פלסמיד לנפח המתאים של reagent transfection, על פי העיצוב הניסיוני ואת הוראות היצרן. לאחר דגירה תערובת transfection בטמפרטורת החדר לתקופה המומלצת של זמן, להוסיף את הפתרון לתאים בצורה טיפה חכם. לאחר מכן מערבבים בעדינות את הצלחת כדי לערבב ולה מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.בסוף ההמרה, להוסיף 150 microliters של טריפסין-EDTA לנתק את התאים כפי שהוכח רק ולאסוף את התאים מנותקים על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר את גלולה בסרום בקר עוברי 2% ב- PBS ולסנן את התאים דרך מסננת רשת 30 מיקרומטר לתוך מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות חמישה מיליליטר, או צינור FACS. לאחר מכן השתמש בתאים שאינם מנופים כדי להגדיר שער בקרה שלילי על ציטומטר הזרימה ולמיין את התאים המותכים על פי סמן הפלואורסצנט בפלסמיד CRISPR המשמש להתהוות לצינור המכיל 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבות התא.כאשר כל התאים שהונפו נאספו, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית ו resuspend את גלולה ב 300 microliters של מדיום תרבות התא. זרעים 200 microliters של תאים לתוך באר אחת של צלחת תרבות רקמות 24-well ולאפשר לתאים להתאושש במשך כמה ימים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. גלולה הנותרים 100 microliters של תאים ממוינים במהירות מקסימלית במשך חמש דקות ולחלץ את ה-DNA הגנומי מן גלולה וכתוצאה מכך על פי פרוטוקולי מיצוי DNA סטנדרטיים.לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר תגובת שרשרת פולימראז, מיקרוליטר אחד של תערובת deoxynucleotide, 2.5 מיקרוליטרים של פריימר הפוך המוגדר על ידי המשתמש, 0.5 מיקרוליטרים של פולימראז DNA, שניים עד חמישה מיקרוליטרים של תבנית ה- DNA הגנומית שחולצו ומספיק מים מזוקקים כפולים כדי להביא את התגובה לנפח סופי של 50 מיקרוליטרים. הפעל את התערובת על רוכב אופניים תרמי ולפתור את התגובה על ג'ל 2%agarose באמצעות מאגר TAE 1X על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. השתמש באזמל נקי וחד כדי להפוך את מוצר תגובת שרשרת הפולימראז ולטהר את ה- DNA באמצעות ערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.למדוד את הריכוז של המוצר באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 סופג ננומטר. הכינו תערובת בדיקה המכילה 200 ננוגרם של הדנ"א המבודד, שני מיקרוליטרים של חיץ התגובה T7 endonuclease I, ומספיק מים מזוקקים כפולים כדי להביא את הנפח הסופי של התערובת ל -19 מיקרוליטרים. Reanneal מוצר תגובת שרשרת פולימראז במחזור תרמי בפרמטרים שצוינו ומערבבים חמש יחידות של T7 אנדונוקלאז אני עם המוצר reannealed עבור דגירה 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, פתור את הדנ"א המתעכל על ג'ל 2.5% agarose באמצעות חיץ 1X TAE, ודמיין את הג'ל על מערכת דימות ג'ל מתאימה. פתח את תמונת הג'ל ב- ImageJ וצייר תיבה מלבנית סביב הרצועה קרוב ככל האפשר לגבול שלה. לחצו על 'נתח' ו'קבע מידות', המאשרות שהאזור, הערך האפור הממוצע ואפשרויות הצפיפות המשולבת נבדקים.לחצו על הלחצן 'אשר' ובחרו 'נתח' ו'מידה'. הערך הממוצע, או ערך צפיפות העוצמה הגולמית, מעיד על עוצמת הרצועה. כאשר התאים המרובים בתרבות מתחילים להיות confluent, לנתק אותם עם טריפסין-EDTA, כפי שהוכח, ולזרע את התאים בדלילות בצלחת 100 מילימטר רקמות תרבות כדי לאפשר מספיק מקום למושבות בודדות לגדול לפני החזרת התאים אינקובטור תרבות התא.כאשר המושבות מתחילות להיווצר, השתמש במיקרוסקופ עם הגדלה של X ארבע כדי לבחור את המושבות הבודדות להעברה לתוך בארות בודדות של צלחת 24 באר המכילה 500 microliters של מדיום תרבות התא ל הבאר. יש לדאוג כי הטיפ שלך לא לגעת במושבות שמסביב כדי למנוע ערבוב של מושבות בתוך בארות בודדות או לבחור מאזור של צמיחה מושבה דליל. כאשר כל השיבוטים נבחרו, מניחים את הצלחת בחמה לתרבות התאים עד שהתרבויות הופכות למלוונטות.מכיוון שפלסמידים לא מעוכלים הם סופר-סלילים, הם נוטים לרוץ מהר יותר מעמיתיהם ליניאריים. כדי לקבוע אם האוליגונוקלאוטידים שובטו בהצלחה לתוך עמוד השדרה של CRISPR פלסמיד, PCR המושבה מבוצעת ואת השיבוטים החיוביים מחוסנים לפני הפלסמידים מופצים ונשלחים עבור רצף סנגר. האות הפלואורסצנטי יכול להיות חזותי בקלות תחת מיקרוסקופ על מסירה מוצלחת של הפלסמידים, המאפשר לתאים המעודפים להיות ממוינים על ידי ציטומטריית זרימה.T7 אנדונוקלאז אני מסמן מבוצע כדי לבדוק את יעילות המחשוף של ה-DNA הגנומי, כפי שחושב מן התעצמות של הלהקות שנצפו על ג'ל אגרוז. בנוסף, אם ניסוי מבוסס תיקון מכוון הומולוגיה נועד לשלב אתר הגבלה על לוקוס היעד, ניתן לבצע בדיקת פולימורפיזם באורך קטע הגבלה עם אנזים הגבלה מתאים. כדי לאמת עוד יותר כי גן קידוד חלבון הושבת בהצלחה, כתם מערבי יכול להתבצע כדי להבטיח כי אין חלבון ממוקד קיים.מיון התאים לאחר ההטעה מבטל את התאים ללא פלסמידים משולבים, ובכך מגדיל את אחוז התאים המוקרנים בשלבים מאוחרים יותר כבעלי גן נוקאאוט או חיקוי. עם התפתחות טכניקה זו, אנו מסוגלים כעת לייצר קווי תאים נוקאאוט ללמוד תפקוד גנים וקווי תאים לדפוק במודל מחלות ספציפיות כדי להבין את המנגנון שלהם.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

בתיווך CRISPR הגנום עריכה של פטריות פתוגניות קנדידה אלביקנס

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

שינוי צורה, הגנום עריכת ופנוהקלדת החנקן-תיקון טרופי קנאביציים עץ Parasponia אנדרסונii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-מתווכת עריכת גנום ב- Ascomycete ההאנטילה אומנסיס נימה

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...