Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

M.H.T. נתמך על ידי סוכנות מענק משרד המועצה המשותפת של מדע טכנולוגיה ומחקר (1431AFG103), המועצה הלאומית למחקר רפואי גרנט (OFIRG 0017 2016), קרן מחקר לאומי מעניק (NRF2013-THE001-046, NRF2013-THE001-093), משרד החינוך Tier 1 גרנט (RG50/17 (S)), סטארט-אפ הענק Nanyang הטכנולוגי מהאוניברסיטה, ו כספים עבור התחרות הבינלאומית גנטית הנדסת מכונות (iGEM) מאוניברסיטת Nanyang הטכנולוגי.

1. עיצוב של sgRNAs
<ol><li>בחר מערכת CRISPR-Cas המתאים.<ol>
<li>תחילה, בדוק את אזור היעד עבור רצפי פאם nucleases Cas9 ו Cas12a כל זה הוכחו להיות פונקציונלי ב בתרבית של תאים16,21-32. חמישה אנזימים הנמצאים בשימוש לעתים תכופות ניתנת טבלה 1 יחד עם PAMs המתאימים שלהם. הערה: חוץ endonucleases המפורטים בטבלה1, ...

מערכת CRISPR-Cas היא טכנולוגיה חזקה, מהפכני להנדס את הגנום ואת transcriptomes של צמחים ובעלי חיים. זנים חיידקיים רבים נמצאו יכילו מערכות CRISPR-Cas, אשר פוטנציאל עשוי להיות מותאם הגנום, transcriptome הנדסה למטרות44. למרות Cas9 endonuclease של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת (SpCas9) היה האנזים הראשון כדי לפ?...

היכולת מהנדס הגנום של כל אורגניזם חי יש לא מעט אפליקציות ביו, הביו-טכנולוגיה, כגון התיקון של גורמי מחלות מוטציות, בניית דגמי הסלולר מדויק לחקר המחלה, או דור של החקלאי יבולים עם תכונות רצויות. מאז המאה ה, טכנולוגיות שונות פותחו עבור גנום הנדסה בתאי יונקים, כולל meganucleases1,2,3, אבץ אצבע nucleases4,5, או תמלול אפקטור activator דמוי nucleases (TALENs)6,7,8,9. עם זאת, טכנולוגיות קודמות אלה הם קשה לתוכנית או מייגע להרכיב, ובכך פוגעות שלהם אימוץ נרחב מחקר ובתעשייה.
בשנים האחרונות, באופן קבוע באשכולות interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR) - מערכת CRISPR-הקשורים (Ca) התפתחה גנום חדש חזק הנדסה טכנולוגיה10,11. במקור מערכת חיסונית אדפטיבית בחיידקים, עבר בהצלחה לפריסה הגנום שינוי בצמחים ובעלי חיים, כולל האדם. הסיבות העיקריות מדוע CRISPR-Cas צברה פופולריות רבה בזמן כל כך קצר זה הרכיב המביאה את endonuclease Cas מפתח, כגון Cas9 או Cas12a (ידוע גם בשם Cpf1), על המיקום הנכון הגנום הוא פשוט חתיכת קצר מדריך בודד chimeric RN (SgRNA), אשר היא פעולה פשוטה עיצוב וזול לסנתז. לאחר לאתר היעד האנזים Cas מתפקד בתור זוג מספריים מולקולרית ודבק ה-DNA מאוגד עם שלו RuvC, HNH או Nuc תחומים12,13,14. מעבר נטושים כפול וכתוצאה מכך (DSB) לאחר מכן תיקון על ידי התאים באמצעות קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) או מסלול תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). בהיעדרו של תבנית תיקון, DSB יתוקן על ידי השביל NHEJ לשגיאות, אשר יכולים להצמיח אקראיים מדומים ההוספה או המחיקה של נוקלאוטידים (indels) באתר לחתוך, ובכך לגרום frameshift מוטציות בגנים חלבונים. עם זאת, בנוכחות התורם תבנית המכילה את השינויים הרצויים של הדנ א, DSB יתוקן על ידי השביל HDR דיוק גבוה. סוגים נפוצים של תבניות התורם כוללים חד גדילי oligonucleotides (ssODNs), פלסמידים. לשעבר משמש בדרך כלל אם השינויים DNA המיועד קטנות (לדוגמה, שינוי של בסיס יחיד זוג רשימות), בזמן האחרון זה משמש בדרך כלל אם אנחנו רוצים להוסיף רצף ארוך יחסית (לדוגמה, רצף קידוד של חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP) לתוך מיקומה היעד.
הפעילות endonuclease של החלבון Cas דורש הנוכחות של protospacer הסמוך מוטיב (פאם) ב אתר היעד15. פאם של Cas9 נמצא בקצה 3' של protospacer, פאם Cas12a (הנקראת גם Cpf1) נמצאת בקצה 5' במקום16. Cas-המדריך RNA מורכב אין אפשרות להציג DSB אם פאם הוא נעדר17. לפיכך, פאם המקומות אילוץ על המיקומים גנומית איפה מסוגל לבקע נוקלאז Cas מסוים. למרבה המזל, nucleases Cas של מינים שונים של חיידקים בדרך כלל התערוכה פאם דרישות שונות. לפיכך, על ידי שילוב של המערכות CRISPR-Cas השונות שלנו ארגז כלים הנדסיים, אפשר להרחיב את מגוון אתרים אשר עשוי להיות ממוקד הגנום. יתר על כן, אנזים Cas טבעי שניתן הנדסה לאחור או התפתחו כדי לזהות רצפים פאם חלופיים, שמפרידה את היקף נגיש מניפולציה18,19,20גנומית מטרות.
למרות מספר מערכות CRISPR-Cas זמינים למטרות הנדסה הגנום, רוב המשתמשים של הטכנולוגיה יש הסתמך בעיקר על נוקלאז Cas9 מ הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס (SpCas9) מסיבות רבות. קודם כל, זה דורש יחסית פשוט הגולה פאם, בניגוד רבים לחלבונים אחרים-Cas זה יכול לבקע רק בנוכחות PAMs מורכבים יותר. שנית, זה endonuclease Cas הראשון כדי לפרוס בהצלחה תאים אנושיים21,22,23,24. שלישית, SpCas9 הוא האנזים מאופיין בצורה הטובה ביותר עד כה. אם חוקר מבקש להשתמש נוקלאז Cas אחר, הוא או היא לעתים קרובות יהיה ברור על הדרך הטובה ביותר לעצב את הניסוי ותבצע כמה אנזימים אחרים בהקשרים ביולוגיים שונים, בהשוואה ל- SpCas9.
כדי להוסיף הבהרות לגבי את הביצועים היחסיים של מערכות CRISPR-Cas שונות, לאחרונה ערכנו השוואה שיטתית של חמש רשויות אישורים endonucleases – SpCas9, האנזים Cas9 מ Staphylococcus aureus (SaCas9), האנזים Cas9 מ- מנינגוקוקוס (NmCas9), האנזים Cas12a מן Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), האנזים Cas12a של החיידק Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. להשוואה הוגן, הערכנו את nucleases רשויות אישורים שונים באמצעות אותה קבוצה של אתרי יעד ותנאים אחרים ניסיוני. המחקר גם מאפשרת עיצוב הפרמטרים עבור כל מערכת CRISPR-Cas, אשר ישמש כהפניה שימושי עבור משתמשים של הטכנולוגיה. . הנה, טוב יותר לאפשר לחוקרים לנצל CRISPR-Cas מערכת, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הנדסה הגנום אופטימלית עם אנזימים שונים Cas9 ו- Cas12a (ראה איור 1). הפרוטוקול כוללת לא רק פרטים ניסיוני אבל שיקולי התכנון חשוב גם כדי להגדיל את הסבירות של תוצאה הנדסה מוצלחת הגנום בתאים בתרבית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> איור 1 : סקירה כללית של זרימת העבודה כדי ליצור הגנום נערך שורות תאים אנושיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

המערכת חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) באשכולות מתפקד באופן טבעי של חיידקי החסינות אדפטיבית, אך יש כבר בהצלחה לשנות את ייעודו הגנום הנדסה רבים אורגניזמים שונים. בדרך כלל, wildtype CRISPR הקשורים 9 (Cas9) או Cas12a endonuclease משמשת כדי לדבוק אתרים ספציפיים בגנום, אחרי אשר יתוקן מעבר כפול גדילי הדנ א באמצעות הסוף שאינם הומולוגיים הצטרפות לשביל (NHEJ) או את (תיקון מכוון הומולוגיה HDR) מסלול בהתאם תבנית התורם נעדרים או להציג בהתאמה. עד כה, CRISPR מערכות ממינים שונים חיידקי הוכחו להיות מסוגל לבצע עריכה הגנום בתאים בתרבית. עם זאת, למרות הפשטות לכאורה של הטכנולוגיה, מספר פרמטרים צריכים לקחת בחשבון, אשר לעיתים קרובות להשאיר משתמשים מבולבלים אודות הטוב ביותר לבצע את הגנום שלהם עריכת ניסויים. כאן, אנו מתארים שזרימת עבודה מלאה של הנבחנים: זיהוי של שיבוטים תא שנושאים שינויים DNA הרצוי, במטרה להקל על ביצוע מוצלח של הגנום עריכת ניסויים בקווים בתרבית של תאים. אנחנו האר שיקולים מרכזיים עבור משתמשים כדי לשים לב, כולל הבחירה של מערכת CRISPR, אורך מרווח, את העיצוב של תבנית התורם חד גדילי oligodeoxynucleotide (ssODN). נוכל לדמות כי זרימת עבודה זו תהיה שימושית ללימודים נוקאאוט גנטי, מחלת מידול המאמצים, או הדור של הכתב תא קווים.

כדי לבצע גנום עריכת ניסוי, פלסמיד CRISPR לבטא sgRNA מיקוד שלוקוס-של-הריבית צריכה להיות משובטים. קודם כל, פלסמיד מתעכלת עם אנזים ההגבלה (בדרך כלל סוג של IIs אנזים) כדי linearize זה. מומלץ לפתור את המוצר מתעכל על ג'ל agarose 1% לצד פלסמיד מעוכל להבחין בין עיכול מלאה או חלקית. כמו פלסמידים מעוכל הם supercoiled, הם נוטי...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

פרוטוקול זה משתמש ב- CRISPR-Cas9 כדי ליצור קווי נוקאאוט או נוקאאוט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה פשוט ויעיל לעקוב במיוחד עבור חוקרים טירון. עבור מעבר תאים, לטפל בתאים מתורבתים לילה עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לכל צלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.כאשר התאים התרוממים מתחתית הלוח, לנטרל את התגובה האנזימטית עם שני מיליליטר של מדיום תרבות התא, ולהעביר את ההשעיה התא צינור חרוט. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום תרבות תאים טריים לספירה. ואז לזרוע 1.8 פעמים 10 לתאים החמישיים לתוך באר אחת של צלחת תרבות רקמה 24 באר לתרבות הלילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.עבור transfection של התאים, להוסיף נפח מתאים של תערובת transfection המכיל את הריכוז המתאים של CRISPR פלסמיד לנפח המתאים של reagent transfection, על פי העיצוב הניסיוני ואת הוראות היצרן. לאחר דגירה תערובת transfection בטמפרטורת החדר לתקופה המומלצת של זמן, להוסיף את הפתרון לתאים בצורה טיפה חכם. לאחר מכן מערבבים בעדינות את הצלחת כדי לערבב ולה מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.בסוף ההמרה, להוסיף 150 microliters של טריפסין-EDTA לנתק את התאים כפי שהוכח רק ולאסוף את התאים מנותקים על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר את גלולה בסרום בקר עוברי 2% ב- PBS ולסנן את התאים דרך מסננת רשת 30 מיקרומטר לתוך מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות חמישה מיליליטר, או צינור FACS. לאחר מכן השתמש בתאים שאינם מנופים כדי להגדיר שער בקרה שלילי על ציטומטר הזרימה ולמיין את התאים המותכים על פי סמן הפלואורסצנט בפלסמיד CRISPR המשמש להתהוות לצינור המכיל 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבות התא.כאשר כל התאים שהונפו נאספו, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית ו resuspend את גלולה ב 300 microliters של מדיום תרבות התא. זרעים 200 microliters של תאים לתוך באר אחת של צלחת תרבות רקמות 24-well ולאפשר לתאים להתאושש במשך כמה ימים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. גלולה הנותרים 100 microliters של תאים ממוינים במהירות מקסימלית במשך חמש דקות ולחלץ את ה-DNA הגנומי מן גלולה וכתוצאה מכך על פי פרוטוקולי מיצוי DNA סטנדרטיים.לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר תגובת שרשרת פולימראז, מיקרוליטר אחד של תערובת deoxynucleotide, 2.5 מיקרוליטרים של פריימר הפוך המוגדר על ידי המשתמש, 0.5 מיקרוליטרים של פולימראז DNA, שניים עד חמישה מיקרוליטרים של תבנית ה- DNA הגנומית שחולצו ומספיק מים מזוקקים כפולים כדי להביא את התגובה לנפח סופי של 50 מיקרוליטרים. הפעל את התערובת על רוכב אופניים תרמי ולפתור את התגובה על ג'ל 2%agarose באמצעות מאגר TAE 1X על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. השתמש באזמל נקי וחד כדי להפוך את מוצר תגובת שרשרת הפולימראז ולטהר את ה- DNA באמצעות ערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.למדוד את הריכוז של המוצר באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 סופג ננומטר. הכינו תערובת בדיקה המכילה 200 ננוגרם של הדנ"א המבודד, שני מיקרוליטרים של חיץ התגובה T7 endonuclease I, ומספיק מים מזוקקים כפולים כדי להביא את הנפח הסופי של התערובת ל -19 מיקרוליטרים. Reanneal מוצר תגובת שרשרת פולימראז במחזור תרמי בפרמטרים שצוינו ומערבבים חמש יחידות של T7 אנדונוקלאז אני עם המוצר reannealed עבור דגירה 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, פתור את הדנ"א המתעכל על ג'ל 2.5% agarose באמצעות חיץ 1X TAE, ודמיין את הג'ל על מערכת דימות ג'ל מתאימה. פתח את תמונת הג'ל ב- ImageJ וצייר תיבה מלבנית סביב הרצועה קרוב ככל האפשר לגבול שלה. לחצו על 'נתח' ו'קבע מידות', המאשרות שהאזור, הערך האפור הממוצע ואפשרויות הצפיפות המשולבת נבדקים.לחצו על הלחצן 'אשר' ובחרו 'נתח' ו'מידה'. הערך הממוצע, או ערך צפיפות העוצמה הגולמית, מעיד על עוצמת הרצועה. כאשר התאים המרובים בתרבות מתחילים להיות confluent, לנתק אותם עם טריפסין-EDTA, כפי שהוכח, ולזרע את התאים בדלילות בצלחת 100 מילימטר רקמות תרבות כדי לאפשר מספיק מקום למושבות בודדות לגדול לפני החזרת התאים אינקובטור תרבות התא.כאשר המושבות מתחילות להיווצר, השתמש במיקרוסקופ עם הגדלה של X ארבע כדי לבחור את המושבות הבודדות להעברה לתוך בארות בודדות של צלחת 24 באר המכילה 500 microliters של מדיום תרבות התא ל הבאר. יש לדאוג כי הטיפ שלך לא לגעת במושבות שמסביב כדי למנוע ערבוב של מושבות בתוך בארות בודדות או לבחור מאזור של צמיחה מושבה דליל. כאשר כל השיבוטים נבחרו, מניחים את הצלחת בחמה לתרבות התאים עד שהתרבויות הופכות למלוונטות.מכיוון שפלסמידים לא מעוכלים הם סופר-סלילים, הם נוטים לרוץ מהר יותר מעמיתיהם ליניאריים. כדי לקבוע אם האוליגונוקלאוטידים שובטו בהצלחה לתוך עמוד השדרה של CRISPR פלסמיד, PCR המושבה מבוצעת ואת השיבוטים החיוביים מחוסנים לפני הפלסמידים מופצים ונשלחים עבור רצף סנגר. האות הפלואורסצנטי יכול להיות חזותי בקלות תחת מיקרוסקופ על מסירה מוצלחת של הפלסמידים, המאפשר לתאים המעודפים להיות ממוינים על ידי ציטומטריית זרימה.T7 אנדונוקלאז אני מסמן מבוצע כדי לבדוק את יעילות המחשוף של ה-DNA הגנומי, כפי שחושב מן התעצמות של הלהקות שנצפו על ג'ל אגרוז. בנוסף, אם ניסוי מבוסס תיקון מכוון הומולוגיה נועד לשלב אתר הגבלה על לוקוס היעד, ניתן לבצע בדיקת פולימורפיזם באורך קטע הגבלה עם אנזים הגבלה מתאים. כדי לאמת עוד יותר כי גן קידוד חלבון הושבת בהצלחה, כתם מערבי יכול להתבצע כדי להבטיח כי אין חלבון ממוקד קיים.מיון התאים לאחר ההטעה מבטל את התאים ללא פלסמידים משולבים, ובכך מגדיל את אחוז התאים המוקרנים בשלבים מאוחרים יותר כבעלי גן נוקאאוט או חיקוי. עם התפתחות טכניקה זו, אנו מסוגלים כעת לייצר קווי תאים נוקאאוט ללמוד תפקוד גנים וקווי תאים לדפוק במודל מחלות ספציפיות כדי להבין את המנגנון שלהם.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

בתיווך CRISPR הגנום עריכה של פטריות פתוגניות קנדידה אלביקנס

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

שינוי צורה, הגנום עריכת ופנוהקלדת החנקן-תיקון טרופי קנאביציים עץ Parasponia אנדרסונii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-מתווכת עריכת גנום ב- Ascomycete ההאנטילה אומנסיס נימה

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...