Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
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M.H.T. è supportato da un'agenzia per concessione congiunta Consiglio ufficio di ricerca e di scienza e tecnologia (1431AFG103), un Consiglio nazionale delle ricerche mediche concedere (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation concede (NRF2013-THE001-046 e NRF2013-THE001-093), un Concessione del Ministero di educazione Tier 1 (RG50/17 (S)), una startup grant, Nanyang Technological University e fondi per il concorso International Genetically Engineering Machine (iGEM) da Nanyang Technological University.

1. design di sgRNAs
<ol><li>Selezionare un appropriato sistema di CRISPR-Cas.<ol>
<li>In primo luogo, esaminare la regione di destinazione per le sequenze di PAM di tutte le nucleasi Cas9 e Cas12a che sono state indicate per essere funzionali in cellule di mammifero16,21-32. Cinque enzimi utilizzati di frequente sono riportati nella tabella 1 , insieme ai loro rispettive PAMs. Nota: oltre l'endonucleasi elencati nella tabella 1, ci sono altri enzimi Cas meno comunemente u...

Il sistema CRISPR-Cas è una potente, rivoluzionaria tecnologia per progettare i genomi e trascrittomi delle piante e degli animali. Numerose specie batteriche sono state trovate per contenere sistemi CRISPR-Cas, che potenzialmente possono essere adattati per genoma e del trascrittoma fini44di ingegneria. Anche se l'endonucleasi Cas9 da Streptococcus pyogenes (SpCas9) era il primo enzima per essere distribuito con successo in cellule umane21,<sup class="...

La capacità di progettare il genoma di ogni organismo vivente ha molte applicazioni biomediche e biotecnologiche, come la correzione di malattia-causare mutazioni, costruzione di accurati modelli cellulari per lo studio di malattia, o la generazione di agricolo colture con caratteristiche desiderabili. Poiché la girata del secolo, diverse tecnologie sono state sviluppate per l'ingegneria del genoma in cellule di mammiferi, tra cui meganucleases1,2,3, zinco dito nucleasi4,5, o trascrizione dell'effettore attivatore-come nucleasi (TALENs)6,7,8,9. Tuttavia, queste tecnologie precedenti sono difficili da programma o noioso da montare, quindi che ostacolano l'adozione diffusa nella ricerca e nell'industria.
Negli ultimi anni, il cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) - sistema di CRISPR-collegata (Cas) è emerso come un potente nuovo genoma ingegneria tecnologia10,11. Originariamente un sistema immunitario adattativo nei batteri, è stato correttamente distribuito per la modificazione del genoma in piante e animali, compreso gli esseri umani. Un motivo principale perché CRISPR-Cas ha guadagnato popolarità così tanto in così poco tempo che è l'elemento che porta la chiave dell'endonucleasi di Cas, ad esempio Cas9 o Cas12a (noto anche come Cpf1), nella posizione corretta nel genoma è semplicemente un breve pezzo di guida singola chimerico RN A (sgRNA), che è al design semplice ed economico per sintetizzare. Dopo essere reclutato nel sito di destinazione, l'enzima Cas funziona come un paio di forbici molecolari e si unirà il DNA associato con relativi RuvC, HNH o Nuc domini12,13,14. La risultante doppia interruzione incagliato (DSB) è più riparato dalle cellule via via regia di omologia repair (HDR) o non-omologo fine unirsi (NHEJ). In assenza di un modello di riparazione, il DSB è riparato dalla via NHEJ errori, che possa dar luogo a pseudo-caso inserimento o l'eliminazione di nucleotidi (indels) presso il sito di taglio, causando potenzialmente frameshift mutazioni in geni di proteina-codificazione. Tuttavia, in presenza di un modello di donatore che contiene le modifiche desiderate di DNA, il DSB è riparato dal pathway HDR ad alta fedeltà. Comuni tipi di modelli di donatore includono oligonucleotidi a singolo filamento (ssODNs) e plasmidi. Il primo viene in genere utilizzato se i previsti cambiamenti del DNA sono piccoli (per esempio, alterazione di un singolo paio di base), mentre quest'ultimo viene in genere utilizzato se si vuole inserire una sequenza relativamente lunga (ad esempio, la sequenza di codificazione di una proteina fluorescente verde o GFP) in luogo del bersaglio.
L'attività endonucleasica della proteina Cas richiede la presenza di un motivo di protospacer adiacenti (PAM) presso il sito di destinazione15. Il PAM di Cas9 è all'estremità 3' del protospacer, mentre il PAM di Cas12a (chiamato anche Cpf1) è invece all'estremità 5'16. La Cas-guida RNA complesso è in grado di introdurre un DSB se il PAM è assente17. Da qui, il PAM luoghi un vincolo sulle posizioni genomiche dove una particolare nucleasi di Cas è in grado di fendere. Fortunatamente, nucleasi Cas da diverse specie batteriche in genere presentano diversi requisiti di PAM. Quindi, integrando i vari sistemi di CRISPR-Cas nel nostro toolbox di ingegneria, possiamo espandere la gamma di siti che possono essere mirati in un genoma. Inoltre, un enzima naturale Cas possa essere progettato o si è evoluto per riconoscere sequenze alternative di PAM, ampliando ulteriormente l'ambito di target genomici accessibile a manipolazione18,19,20.
Anche se più sistemi CRISPR-Cas sono disponibili per scopi di ingegneria del genoma, maggior parte degli utenti della tecnologia si affidano principalmente le nucleasi Cas9 da Streptococcus pyogenes (SpCas9) per molteplici ragioni. Innanzitutto, richiede un PAM relativamente semplicemente NGG, a differenza di molte altre proteine di Cas possono fendere solo in presenza di più complesse PAMs. In secondo luogo, è il primo endonucleasi di Cas per essere impiegati con successo in cellule umane21,22,23,24. In terzo luogo, la SpCas9 è di gran lunga l'enzima meglio caratterizzato fino ad oggi. Se un ricercatore vuole utilizzare un altro nucleasi di Cas, è possibile che lui o lei spesso sarebbe poco chiara sul modo migliore per progettare l'esperimento e come ben altri enzimi si esibiranno in diversi contesti biologici rispetto ai SpCas9.
Per fornire chiarezza per le prestazioni relative dei differenti sistemi di CRISPR-Cas, recentemente abbiamo effettuato un confronto sistematico delle cinque endonucleasi Cas – SpCas9, l'enzima Cas9 da Staphylococcus aureus (SaCas9), l'enzima di Cas9 da Neisseria meningitidis (NmCas9), l'enzima di Cas12a da Thermoanaerobacter SP. BV3L6 (AsCas12a) e l'enzima Cas12a dal batterio Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. Per un confronto equo, abbiamo valutato le varie nucleasi Cas utilizzando lo stesso set di siti di destinazione e le altre condizioni sperimentali. I parametri di progettazione di studio anche delineato per ciascun sistema CRISPR-Cas, che dovrebbe servire come un utile riferimento per gli utenti della tecnologia. Qui, per meglio consentire ai ricercatori di fare uso della CRISPR-Cas sistema, forniamo un protocollo dettagliato per l'ingegneria di genoma ottimale con differenti enzimi Cas9 e Cas12a (Vedi Figura 1). Il protocollo comprende non solo i dettagli sperimentali ma anche importanti considerazioni di progettazione per massimizzare la probabilità di un risultato di successo genoma Ingegneria in cellule di mammifero.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> Figura 1 : Una panoramica del flusso di lavoro per generare genoma modificato linee cellulari umane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

Il sistema regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster funziona naturalmente nell'immunità adattiva batterica, ma è stato reimpiegato con successo per l'ingegneria del genoma in molti organismi differenti. Più comunemente, il wildtype CRISPR associato 9 (Cas9) o dell'endonucleasi Cas12a sono usato per fendere siti specifici nel genoma, dopo che la rottura del doppio filamento di DNA è riparata tramite l'estremità non-omologo adesione via (NHEJ) o la riparazione di omologia-diretto ( Via di HDR) a seconda che sia un modello di donatore assenti o presenti rispettivamente. Ad oggi, sistemi CRISPR da diverse specie batteriche sono stati indicati per essere in grado di eseguire l'editing genomico in cellule di mammifero. Tuttavia, nonostante l'apparente semplicità della tecnologia, più parametri di progettazione devono essere considerati, che spesso lasciano gli utenti perplessi su come meglio per svolgere il loro genoma esperimenti di editing. Qui, descriviamo un flusso di lavoro completo dal disegno sperimentale identificazione di cloni di cellule che trasportano desiderati modificazioni del DNA, con l'obiettivo di facilitare la corretta esecuzione di esperimenti in linee cellulari di mammifero di editing genomico. Evidenziamo le considerazioni chiave per gli utenti di prendere nota, tra cui la scelta del sistema CRISPR, la lunghezza del distanziale e la progettazione di un modello di donatore singolo filamento oligodeoxynucleotide (ssODN). Immaginiamo che questo flusso di lavoro sarà utile per gli studi di gene knockout, modellazione di sforzi, la malattia o la generazione di reporter linee cellulari.

Per eseguire un esperimento, un plasmide CRISPR esprimendo un sgRNA con destinazione che il locus di interesse deve essere clonato di editing di genoma. In primo luogo, il plasmide si digerisce con un enzima di limitazione (in genere un tipo di enzima di IIs) per linearizzare esso. Si consiglia di risolvere il prodotto digerito su gel di agarosio 1% a fianco di un plasmide non digerito per distinguere tra una digestione completa e parziale. Come non digeriti plasmidi sono supercoiled, tendono a correre più velocemente r...

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Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

CRISPR-Cas è una potente tecnologia per progettare i complessi genomi delle piante e degli animali. Qui, dettagliamo un protocollo efficiente modificare il genoma umano usando diverse endonucleasi di Cas. Evidenziamo considerazioni importanti e parametri di progettazione per ottimizzare l'efficienza di editing.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Questo protocollo utilizza CRISPR-Cas9 per creare linee knock-out o knock-in. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice ed efficiente da seguire soprattutto per i ricercatori alle prime armi. Per il passaging cellulare, trattare le cellule coltivate durante la notte con due millilitri dello 0,25% di EDTA di tripina per piastra a 37 gradi Celsius per due minuti.Quando le cellule si sono alzate dai fondi della piastra, neutralizzare la reazione enzimatica con due millilitri di terreno di coltura cellulare e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico. Raccogliere le cellule per centrifugazione e rimosogliere il pellet in cinque millilitri di mezzo di coltura cellulare fresco per il conteggio. Quindi semina 1,8 volte 10 alla quinta parte delle cellule in un pozzo di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi per la coltura notturna a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Per la trasfezione delle cellule, aggiungere un volume appropriato di miscela di trasfezione contenente l'appropriata concentrazione di plasmide CRISPR al volume appropriato di reagente di trasfezione, secondo il progetto sperimentale e le istruzioni del produttore. Dopo aver incubato il mix di trasfezione a temperatura ambiente per il periodo di tempo consigliato, aggiungere la soluzione alle cellule in modo drop-wise. Quindi ruotare delicatamente la piastra per mescolare e posizionare la piastra in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.Al termine della trasfezione, aggiungere 150 microlitri di tripside-EDTA per dissociare le cellule come appena dimostrato e raccogliere le cellule staccate per centrifugazione. Risospendare il pellet nel siero bovino fetale al 2% in PBS e filtrare le cellule attraverso un colino a rete da 30 micrometri in uno smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza a cinque millilitri o in un tubo FACS. Quindi utilizzare le cellule non trasfette per impostare un cancello di controllo negativo sul citometro di flusso e ordinare le cellule trasfette in base al marcatore fluorescente sul plasmide CRISPR utilizzato per la trasfezione in un tubo contenente 100 microlitri di terreno di coltura cellulare.Una volta raccolte tutte le cellule trasfette, pellet le cellule mediante centrifugazione alla massima velocità e rimorsi il pellet in 300 microlitri di mezzo di coltura cellulare. Semina 200 microlitri di cellule in un pozzo di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi e consente alle cellule di riprendersi per alcuni giorni in un'incubatrice di 37 gradi Celsius. Pellet i restanti 100 microlitri di cellule smistate alla massima velocità per cinque minuti ed estrarre il DNA genomico dal pellet risultante secondo protocolli standard di estrazione del DNA.Successivamente, aggiungere 10 microlitri di tampone di reazione a catena della polimerasi, un microlitro di miscela di deossinucleotide, 2,5 microlitri di primer inverso definito dall'utente, 0,5 microlitri di DNA polimerasi, da due a cinque microlitri del modello di DNA genomico estratto e abbastanza acqua doppia distillata per portare la reazione a un volume finale di 50 microlitri. Eseguire la miscela su un ciclore termico e risolvere la reazione su un gel di agarosio al 2% utilizzando un buffer TAE 1X secondo protocolli standard. Utilizzare un bisturi pulito e affilato per asportare la catena della polimerasi reagire prodotto e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.Misurare la concentrazione del prodotto utilizzando uno spettrofotometro ad assorbanza di 260 nanometri. Preparare una miscela di test contenente 200 nanogrammi del DNA isolato, due microlitri di tampone di reazione di Endonucleasi I T7 e abbastanza acqua doppia distillata per portare il volume finale della miscela a 19 microlitri. Reanneal il prodotto di reazione a catena della polimerasi in un ciclore termico ai parametri indicati e mescolare cinque unità di Endonucleasi I T7 con il prodotto rinnealizzato per un'incubazione di 50 minuti a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, risolvere il DNA digerito su un gel di agarosio al 2,5% utilizzando un tampone TAE 1X e imageare il gel su un appropriato sistema di imaging in gel. Aprite l'immagine gel in ImageJ e disegnate una casella rettangolare attorno alla banda il più vicino possibile al suo limite. Fate clic su Analizza (Analyze) e impostate misurazioni (Set Measurements), a conferma dell'area, del valore grigio medio e delle opzioni di densità integrate.Fare clic su OK e selezionare Analizza e Misura. Il valore medio, o densità di intensità grezza, è indicativo dell'intensità della banda. Quando le cellule trasfette da coltura iniziano a diventare confluenti, staccarle con tripina-EDTA, come dimostrato, e seminare le cellule in modo sparso in un piatto di coltura tissutale di 100 millimetri per consentire alle singole colonie di crescere prima di restituire le cellule all'incubatore di coltura cellulare.Quando le colonie iniziano a formarsi, usa un microscopio con un ingrandimento di quattro X per raccogliere le singole colonie per il trasferimento in singoli pozzi di una piastra da 24 porri contenente 500 microlitri di mezzo di coltura cellulare per pozzo. Fai attenzione che il tuo consiglio non tocchi le colonie circostanti per evitare la miscelazione di colonie all'interno di singoli pozzi o scegli da un'area di scarsa crescita della colonia. Quando tutti i cloni sono stati raccolti, posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare fino a quando le colture diventano confluenti.Poiché i plasmidi non digeriti sono super-arrotolato, tendono a funzionare più velocemente delle loro controparti linearizzate. Per determinare se gli oligonucleotidi sono stati clonati con successo nella spina dorsale plasmide CRISPR, viene eseguita la PCR della colonia e i cloni positivi vengono inoculati prima che i plasmidi siano estratti e inviati per il sequenziamento sanger. Il segnale fluorescente può essere facilmente visualizzato al microscopio dopo una consegna riuscita dei plasmidi, permettendo alle cellule trasfette di essere ordinate per citometria a flusso.Viene eseguito un saggio di endonucleasi I T7 per verificare l'efficienza di scissione del DNA genomico, calcolata dalle intensità delle bande osservate su un gel di agarosio. Inoltre, se un esperimento basato sulla riparazione diretto dall'omologia è progettato per incorporare un sito di restrizione nel locus bersaglio, un saggio di polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione può essere eseguito con un corrispondente enzima di restrizione. Per convalidare ulteriormente che un gene codificante proteico sia stato inattivato con successo, è possibile eseguire una macchia occidentale per garantire che non sia presente alcuna proteina mirata.Lo smistamento delle cellule dopo la trasfezione elimina le cellule senza plasmidi incorporati, aumentando così la percentuale di cellule schermate nelle fasi successive come aventi un gene knock-out o knock-in. Con lo sviluppo di questa tecnica, siamo ora in grado di produrre linee cellulari knock-out per studiare la funzione genica e le linee cellulari knock-in per modellare malattie specifiche per comprenderne il meccanismo.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Ricerca

Genetica

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

Dissezione della funzione Enhancer usando Multiplex basati su CRISPR Enhancer interferenze nelle linee cellulari

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

CRISPR-mediata Editing genomico agente patogeno fungoso umano Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

Trasformazione, editing del genoma e fenotipizzazione dell'azoto-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

Identificazione del recettore della superficie cellulare utilizzando schermi genetici CRISPR/Cas9 su scala genomica

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CrispR-Cas9-Mediato Genome Editing nel Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...