Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
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M.H.T. は、科学技術と研究の共同協議会事務所の助成金 (1431AFG103) のための代理店でサポートされて、国立医療研究評議会は、(OFIRG/0017/2016) を付与、国立研究財団補助金 (046-NRF2013-THE001 ・ NRF2013-THE001-093)、教育層 1 の省許可 (RG50/17 (S))、スタートアップは、ナンヤン工科大学、南洋工科大学から国際遺伝子工学機械 (iGEM) 競争のための資金から付与します。

1. sgRNAs の設計
<ol><li>適切な CRISPR Cas システムを選択します。<ol>
<li>まず、哺乳類細胞16, 21-32で機能することが示されているすべての Cas9 と Cas12a の核酸分解酵素の PAM シーケンスの対象地域を確認します。5 つの頻繁に使用される酵素は、一緒に彼らのそれぞれの PAMs表 1に与えられています。 注: 酵素以外にも哺乳類セル同様、連鎖球菌サーモフィルス(St1Cas9) ?...

CRISPR Cas システムは、エンジニアのゲノムおよびトランスクリプトームの植物や動物に強力な革新的な技術です。CRISPR Cas システムでは、ゲノム、トランスクリプトーム解析目的44をエンジニア リングの適応が可能性があるを含む多くの菌種が見つかっています。化膿連鎖球菌(SpCas9) から Cas9 エンドヌクレアーゼが他の細菌由来の酵素細胞21,<...

すべての生きている有機体のゲノムをエンジニア リングすることで、病原の補正など、多くの医学・ バイオ テクノロジー アプリケーションの突然変異、病気の研究、正確な細胞モデルの構築や農業の生成望ましい特徴を持つ作物。世紀の変わり目以来は、哺乳類セルの meganucleases1,2,3を含むゲノム工学の様々 な技術が開発されて、亜鉛指の核酸の4、5、または転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs)6,7,8,9。ただし、これらの以前のテクノロジは、プログラムすることは困難または組み立て、退屈な研究と業界での普及を阻害します。
近年では、クラスター化された定期的に空間短い回文繰り返し (CRISPR) - CRISPR 関連 (Cas) システムは、強力な新しいゲノム工学技術10,11として浮上しています。もともと細菌の適応免疫系、それ正常にされている人間を含む動植物のゲノム育種のために展開します。なぜ CRISPR Cas は、このような短い時間でそんなに人気を得ている主な理由 Cas9 や Cas12a (Cpf1 とも呼ばれます) など、キー Cas エンドヌクレアーゼをもたらす要素は、ゲノム内の正しい場所は単にキメラ シングル ガイド RN の短い作品(SgRNA) を設計するは簡単で合成する安価であります。ターゲット サイトに採用されて後、Cas 酵素分子はさみのペアとして機能し、その RuvC、アレイ、または Nuc ドメイン12,13,14バインドされた DNA を切断します。結果として得られる二重鎖休憩 (DSB) 後で非相同末端結合 (NHEJ) または相同監督修理 (HDR) 経路を介して細胞によって修理されています。修理のテンプレートがない場合は、DSB のヌクレオチド (オクターリピート) カットのサイトでの擬似ランダム挿入または削除に上昇を与えることができます、エラーを起こしやすい NHEJ 経路による蛋白質のコーディングの遺伝子のフレーム シフト変異を引き起こす可能性があります修理です。ただし、目的の DNA の変更を含むドナー テンプレートの存在下で、DSB は忠実度の高い HDR 経路によって修復します。ドナー テンプレートの一般的な種類には、一本鎖オリゴヌクレオチド (ssODNs) とプラスミドがあります。前者は、後者は通常使用されますが比較的長いシーケンスを挿入を希望する場合は、目的の DNA の変化が (たとえば、単一の基礎ペアの変化)、小さい場合に使われる (例えば、緑色蛍光蛋白質のコーディング シーケンスまたはGFP) ターゲット遺伝子座に。
Cas タンパク質の酵素活性には、ターゲット サイト15protospacer の隣接するモチーフ (PAM) の存在が必要です。Cas9 PAM、protospacer の 3' 端に (Cpf1 とも呼ばれる) Cas12a PAM 5' 端に代わりに16。Ca ガイド複雑な RNA は PAM17欠席がある場合、DSB を導入することができます。したがって、PAM は、特定の Ca ヌクレアーゼは切断することができるゲノムの位置に制約を配置します。幸いなことに、Cas 細菌種の核酸分解酵素は通常さまざまな PAM 要件を展示します。したがって、様々 な CRISPR Cas システムを当社のエンジニア リングのツールボックスに統合することで、ゲノムの対象にできるサイトの範囲を展開できます。さらに、自然な Ca 酵素を設計またはさらにゲノムのターゲット操作18,,1920にアクセスできる範囲を拡大、PAM のオルタナティブ シーケンスを認識するように進化できます。
複数 CRISPR Cas システムはゲノム エンジニア リング目的で利用できるが、技術のほとんどのユーザーは、複数の理由主に化膿連鎖球菌(SpCas9) から Cas9 ヌクレアーゼに頼ってきました。まず、比較的単に NGG PAM、複雑 PAMs の存在下でのみ切断することができます他の多くの Ca のタンパク質とは異なりが必要です。第二に、ひと細胞21,22,23,24で展開することに最初の Ca エンドヌクレアーゼです。第三に、SpCas9 は日付に最高の特徴酵素を抜いて。研究者別の Ca ヌクレアーゼを使用する場合、彼または彼女しばしば不明瞭でしょう実験や SpCas9 と比較して異なる生物学的文脈で他の酵素がどのように実行される設計する最善の方法について。
異なる CRISPR Cas システムの相対的なパフォーマンスに明快さを提供するために我々 は最近 5 Ca 酵素-SpCas9、黄色ブドウ球菌(SaCas9)、から Cas9 の酵素 Cas9 酵素の体系的な比較を実行しました。髄膜炎菌(NmCas9)、(AsCas12a)、 Acidaminococcus sp BV3L6 から Cas12a 酵素と菌Lachnospiraceae ND2006 から Cas12a 酵素 (LbCas12a)25。公正な比較のためのターゲット ・ サイトと他の実験条件の同じセットを使用してさまざまな Cas 核酸を評価されます。技術のユーザーのための有用な参照として役立つであろう CRISPR Cas システムごとにも線引き研究設計パラメーター。ここより良い CRISPR Cas の活用研究を有効にするシステム、我々 は別の Cas9 と Cas12a の酵素 (図 1参照) で最適なゲノム工学のステップバイ ステップのプロトコルを提供します。プロトコルにはだけでなく哺乳類細胞で成功したゲノム エンジニア リング結果の可能性を最大限にまた重要な設計上の考慮事項が、実験の詳細が含まれます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> 図 1: ゲノムを生成するためのワークフローの概要がひと細胞ラインを編集します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

クラスター化された定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) システムは細菌の適応免疫の自然機能が、用途が正常に変更されて多くの異なる生物のゲノム工学のため。最も一般的に、または CRISPR 関連 9 (Cas9) または非相同末端結合 (NHEJ) 経路や相同性監督の修理 (を介して修理する DNA 二本鎖切断後、ゲノムの特定のサイトを切断するために使用 Cas12a エンドヌクレアーゼドナーのテンプレートがあるかによって HDR) 経路は、不在またはそれぞれ現在です。日には、哺乳類細胞でゲノムの編集を実行できるように細菌の異なる種から CRISPR システムを示されています。ただし、技術の見かけのシンプルさにもかかわらず複数の設計パラメーター必要があります考慮する頻繁のゲノム実験を編集を行う最高について当惑のユーザーを残して。ここでは、ゲノムを実験哺乳類セルラインでの編集が正常に実行を容易にする目的で、必要な DNA の変更を運ぶ細胞クローンの同定実験の設計から完全なワークフローを記述します。CRISPR システム、スペーサーの長さ、および単一座礁させた分野 (ssODN) ドナー テンプレートのデザインの選択など、メモを取るユーザーの重要な考慮事項を強調表示します。このワークフローは、遺伝子ノックアウト研究、疾患モデルの作業、役に立つでしょうか、記者の生成細胞を思い描いてください。

ゲノムの実験では、クローンを作成する必要があります興味の軌跡 sgRNA ターゲットを表現する CRISPR プラスミドを編集を実行します。最初に、プラスミッドはそれをリニア化する (通常型酵素) 制限の酵素と消化されます。完全および部分的な消化を区別する未消化プラスミドと一緒に 1% の agarose のゲルの消化の製品を解決することをお勧めします。未消化のプラスミドはスーパー、線形化?...

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Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

CRISPR Cas は植物や動物の複雑なゲノムをエンジニア リングする強力な技術です。ここでは、我々 は異なる Ca 酵素を使用して人間のゲノムを効率的に編集するためのプロトコルを詳しく説明します。我々 は、重要な考慮事項と編集の効率を最適化する設計パラメーターを強調表示します。

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

このプロトコルは、CRISPR-Cas9 を使用して、ノックアウトまたはノックインラインを作成します。この技術の主な利点は、特に初心者の研究者のために従うことは簡単で効率的です。細胞通過の場合、1皿当たり0.25%トリプシンEDTAの2ミリリットルの一晩培養細胞を摂氏37度で2分間治療する。細胞がプレート底面から持ち上がったら、2ミリリットルの細胞培養培地で酵素反応を中和し、細胞懸濁液を円錐チューブに移す。遠心分離によって細胞を収集し、カウント用の新鮮な細胞培養培地の5ミリリットルでペレットを再懸濁する。その後、摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩培養するための24ウェル組織培養プレートの1つの井戸に1.8倍の5番目の細胞に種をまきます。細胞のトランスフェクションについては、実験計画および製造業者の指示に従って、CRISPRプラスミドの適切な濃度を含む適切な量のトランスフェクション試薬を適切な量のトランスフェクション試薬に加える。推奨期間室温でトランスフェクションミックスをインキュベーションした後、液をドロップワイズで細胞に加えます。その後、プレートをそっと渦巻いて混合し、5%の二酸化炭素を加湿した37°Cインキュベーターにプレートを入れ、トランスフェクションの終了時に、150マイクロリットルのトリプシン-EDTAを加えて細胞を解離し、遠心分離によって脱離した細胞を回収します。PBSで2%のウシ胎児血清中のペレットを再懸濁し、30マイクロメートルメッシュストレーナーを介して5ミリリットル蛍光活性化細胞選別、またはFACSチューブに細胞を濾過します。次に、非トランスフェクトされた細胞を使用して、フローサイトメーターに陰性制御ゲートを設定し、細胞培養液の100マイクロリットルを含むチューブにトランスフェクションに使用されるCRISPRプラスミド上の蛍光マーカーに従ってトランスフェクトされた細胞を選別します。全てのトランスフェクト細胞が採取されると、ペレットは最大速度で遠心分離して細胞をペレット化し、300マイクロリットルの細胞培養培地中でペレットを再懸濁した。24ウェル組織培養プレートの1つの井戸に200マイクロリットルの細胞をシードし、細胞が37°Cインキュベーターで数日間回復することを可能にする。残りの100マイクロリットルの細胞を最高速度で5分間ペレットし、標準的なDNA抽出プロトコルに従って得られたペレットからゲノムDNAを抽出した。次に、10マイクロリットルのポリメラーゼ連鎖反応バッファー、デオキシヌクレオチドミックス1マイクロリットル、ユーザー定義リバースプライマー2.5マイクロリットル、0.5マイクロリットルのDNAポリメラーゼ、抽出されたゲノムDNAテンプレートの2〜5マイクロリットル、および50マイクロリットルの最終体積に反応をもたらすのに十分な二重蒸留水を加える。サーマルサイクラーで混合物を実行し、標準プロトコルに従って1X TAEバッファーを使用して2%アガロースゲル上の反応を解決します。清潔でシャープなメスを使用してポリメラーゼ連鎖反応物を切除し、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。260ナノメートルの吸光度で分光光度計を使用して製品の濃度を測定します。200ナノグラムの単離されたDNA、T7エンドヌクレアーゼI反応バッファーの2マイクロリットル、および混合物の最終体積を19マイクロリットルにする十分な二重蒸留水を含むアッセイミックスを準備する。ポリメラーゼ連鎖反応生成物を示されたパラメータでサーマルサイクラーで再膜し、T7エンドヌクレアーゼIの5単位をReanneareled生成物と混合し、摂氏37度で50分間インキュベーションします。インキュベーションの終了時に、1X TAEバッファーを使用して2.5%アガロースゲル上で消化されたDNAを解決し、適切なゲルイメージングシステム上でゲルを画像化します。ImageJ でゲルイメージを開き、バンドの周囲をできるだけ境界に近い長方形のボックスに描画します。[解析]をクリックし、[測定を設定]をクリックして、面積、平均グレー値、および統合密度オプションがチェックされていることを確認します。[OK] をクリックし、[分析] を選択して[測定] をクリックします。平均値、または生の強度密度値は、バンド強度を示す値です。培養トランスフェクションされた細胞がコンフルエントになり始めたら、示されているようにトリプシンEDTAで取り外し、細胞を100ミリメートルの組織培養皿にまばらに播種して、細胞を細胞培養器に戻す前に個々のコロニーが成長するのに十分なスペースを確保する。コロニーが形成し始めると、4つのX倍率の顕微鏡を使用して、ウェルあたり500マイクロリットルの細胞培養培地を含む24ウェルプレートの個々の井戸に移管するために個々のコロニーを選ぶ。あなたの先端は、個々の井戸内のコロニーの混合を防ぐために周囲のコロニーに触れていないか、まばらなコロニーの成長の領域から選ぶように注意してください。すべてのクローンが摘み取られたら、培養物がコンフルエントになるまで細胞培養インキュベーターにプレートを置く。未消化のプラスミドは超コイル状であるため、線形化されたプラスミドよりも速く走る傾向があります。オリゴヌクレオチドがCRISPRプラスミド骨格に正常にクローン化されたかどうかを判断するために、コロニーPCRが行われ、プラスミドが抽出されてサンガーシーケンシングのために送られる前に陽性クローンが接種されます。この蛍光シグナルは、プラスミドの送達に成功すると顕微鏡下で容易に可視化することができ、トランスフェクトされた細胞をフローサイトメトリーで選別することができます。T7エンドヌクレアーゼIアッセイは、アガロースゲル上に観察されたバンドの強度から計算されるように、ゲノムDNAの切断効率をチェックするために行われる。さらに、相同性指向の修復ベースの実験が標的遺伝子座に制限部位を組み込むように設計されている場合、制限フラグメント長多型アッセイは、対応する制限酵素を用いて行うことができる。タンパク質コード遺伝子が正常に不活性化されたことをさらに検証するために、ウェスタンブロットを実行して、標的タンパク質が存在しないようにすることができます。トランスフェクション後に細胞を選別すると、プラスミドを組み込まずに細胞を排除し、ノックアウトまたはノックイン遺伝子を有する細胞として後の段階でスクリーニングされる細胞の割合を増加させる。この技術の開発により、ノックアウト細胞株を作製して遺伝子機能を研究し、細胞株をノックアウトして特定の疾患をモデル化し、そのメカニズムを理解できるようになりました。

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

遺伝学

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

CRISPR を介したゲノム人間病原菌カンジダの編集

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

窒素固定熱帯カンナバ科の木パラスポニア・アンダーソンニの変形、ゲノム編集、表現型

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ ・ハンティエラオマネンシス

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...