Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

M.H.T.는 과학 기술 및 연구의 공동 위원회 사무실 그랜트 (1431AFG103)에 대 한 기관에 의해 지원 됩니다, 국가 의료 연구 위원회 (OFIRG/0017/2016) 부여, 국립 연구 재단 보조금 (NRF2013-THE001-046, NRF2013-THE001-093)는 교육부의 교육 1 단계 그랜트 (RG50/17 (S)), 난 양 기술 대학교, 난 양 기술 대학교에서 국제 유전자 공학 기계 (iGEM) 경쟁에 대 한 자금에서 시작 권한을 부여 합니다.

1입니다. sgRNAs의 디자인
<ol><li>적절 한 CRISPR-Cas 시스템을 선택 합니다.<ol>
<li>첫째, 모든 Cas9 및 Cas12a nucleases 포유류 세포16,21-32에 작동 표시 되어의 팸 시퀀스에 대 한 대상 영역을 검사 합니다. 5 자주 사용된 효소 그들의 각각 PAMs 함께 표 1 에 주어진 다. 참고: 외는 endonucleases 성공적으로 배포 된 포유류 세포 뿐만 아니라, 연쇄 상 구 균 thermophilus (St1Cas9)에서 Cas9 nuclea...

CRISPR-Cas 시스템 엔지니어 유전자 및 식물 및 동물의 transcriptomes 강력 하 고 혁신적인 기술입니다. 많은 세균성 종의 게놈 및 transcriptome 목적44엔지니어링에 대 한 적응 수 있습니다 CRISPR Cas 시스템을 포함 하도록 발견 되었습니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 Cas9 endonuclease은 배포할 성공적으로 인간 세포21,22,,...

어떤 생명체의 게놈 엔지니어링 능력은 많은 생물 의학 및 바이오 응용 프로그램, 질병 발생의 수정 같은 돌연변이, 질병 연구에 대 한 정확한 휴대 전화 모델의 건설 또는 농업 생성 바람직한 특성을 가진 작물입니다. 세기의 차례 이후 다양 한 기술 개발 되었으며, meganucleases,12,3을 포함 한 포유류 세포에서 게놈 엔지니어링, 아연 손가락 nucleases4,5또는 전사 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs)6,7,,89. 그러나, 이러한 이전 기술을 어려운 프로그램 또는 조립, 지루한 연구 및 업계에서 광범위 하 게 채택 함으로써 방해.
최근 몇 년 동안에는 클러스터 된 정기적으로 짧은 구조 반복 (CRISPR) interspaced-CRISPR 관련 (Cas) 시스템 엔지니어링 기술10,11강력한 새로운 게놈으로 떠오르고 있다. 원래 박테리아에 적응 면역 체계, 되었습니다 성공적으로 식물과 동물, 인간을 포함 한 게놈 수정에 대 한 배포. CRISPR-Cas 같은 짧은 시간에 너무 많은 인기를 얻고 있다 왜 주된 이유 주요 Cas endonuclease, Cas9 또는 Cas12a (Cpf1 라고도 함) 등을 제공 하는 요소, 게놈에 있는 정확한 위치는 단순히 공상 단일 가이드 RN의 짧은 조각 (SgRNA), A는 디자인을 간단 하 고 저렴 한 합성. 대상 사이트에 보충 되 고, 후 Ca 효소 분자가 위 한 쌍으로 하 고 그것의 RuvC, 트, 또는 Nuc 도메인12,,1314바인딩된 DNA를 앞. 결과 두 배 좌초 휴식 (DSB)은 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 또는 상 동 감독 수리 (HDR) 통로 통해 세포에 의해 연속적으로 복구 됩니다. 복구 서식 파일의 부재, DSB 단백질 코딩 유전자에 frameshift 돌연변이 일으키는 잠재적으로 야기할 수 있는 난수 삽입 또는 삭제 컷된 사이트에 뉴클레오티드 (indels), 오류가 NHEJ 통로 의해 수리는. 그러나, 원하는 DNA 변화를 포함 하는 기증자 템플릿을, 존재 DSB 고화질 HDR 통로 의해 수리는. 기증자 서식 파일의 일반적인 종류 단일 가닥 oligonucleotides (ssODNs) 및 플라스 미드 포함 됩니다. 전 반면 후자는 일반적으로 사용 하나 비교적 긴 시퀀스를 삽입 하고자 하는 경우 원하는 DNA 변경 (예: 단일 기본적인 쌍의) 작은 경우에 일반적으로 사용 됩니다 (예를 들어 녹색 형광 단백질의 코딩 순서 또는 GFP) 대상 장소에.
Cas 단백질의 endonuclease 활동 대상 사이트15에 protospacer 인접 한 모티프 (PAM)의 존재를 요구 한다. Cas9의 팸은 protospacer의 3' 끝에는 PAM의 Cas12a (Cpf1 라고도 함)는 5' 끝에 대신 하는 동안16. Cas-가이드 복잡 한 RNA는 PAM은17에 결 석 하는 경우는 DSB 소개 하 수 없습니다. 따라서, PAM 특정 Ca nuclease 쪼개 다 수가 게놈 위치에 제약 조건을 배치 합니다. 다행히, 다른 세균 종에서 Cas nucleases 일반적으로 다른 팸 요구를 전시 한다. 따라서, 우리의 엔지니어링 도구 상자에 다양 한 CRISPR Cas 시스템을 통합, 우리는 게놈에 타겟이 될 수 있습니다 사이트의 범위를 확장할 수 있습니다. 또한, 자연 Ca 효소 설계 수 있습니다 또는 대체 팸 시퀀스, 게놈 목표 조작18,,1920에 액세스할 수의 범위를 더욱 확대 인식 진화.
여러 CRISPR Cas 시스템 게놈 기술 설계 목적을 위해 사용할 수 있지만, 기술의 대부분의 사용자는 여러 이유로 주로 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 Cas9 nuclease에 의존 했습니다. 첫째,이 상대적으로 단순히 NGG 팸, 더 복잡 한 PAMs 존재만 쪼개 다 수 다른 많은 Ca 단백질 달리 필요 합니다. 둘째, 인간의 세포21,,2223,24에 성공적으로 배포 하는 첫 번째 Ca endonuclease 이다. 셋째, SpCas9까지 날짜에 최고의 특징이 효소 이다. 연구자 다른 Cas nuclease 사용 하고자 하는 경우 그 또는 그녀가 종종 것 디자인 실험 및 다른 효소 SpCas9에 비해 다른 생물학 문맥에서 얼마나 잘 수행 하는 최선의 방법에 대 한 명확한.
다른 CRISPR Cas 시스템의 상대적인 성능에 선명도 제공 하려면 우리 최근 포도 상 구 균 (SaCas9), 에서 Cas9 효소에서에서 Cas9 효소 5 개의 Ca endonucleases-SpCas9의 체계적인 비교를 수행 했습니다. Neisseria meningitidis (NmCas9) (AsCas12a)에 Acidaminococcus sp. BV3L6에서에서 Cas12a의 효소 및 Cas12a 효소 Lachnospiraceae 박테리아 ND2006에서에서 (LbCas12a)25. 공정한 비교를 위해 우리는 다른 실험 조건 및 대상 사이트의 동일한 세트를 사용 하 여 다양 한 Cas nucleases 평가. 연구 또한 delineated 디자인 매개 변수 각 CRISPR Cas 시스템 기술의 사용자를 위한 유용한 참고 자료 역할을. 여기, 더 나은 CRISPR Cas 사용 하도록 연구 활성화 시스템, 다른 Cas9 및 Cas12a 효소 ( 그림 1참조)로 최적의 게놈 엔지니어링에 대 한 단계별 프로토콜 제공. 프로토콜 뿐만 아니라 포유류 세포에서 게놈 성공적인 엔지니어링 결과의 가능성을 최대화 하기 또한 중요 한 디자인 고려 하지만 실험 내용을 포함 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> 그림 1 : 게놈을 생성 하는 워크플로 개요 편집 인간의 세포 라인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 시스템 세균성 적응 면역에 자연스럽 게 작동 하지만 성공적으로 많은 다른 살아있는 유기 체에 있는 게놈 엔지니어링에 대 한 용도가 변경 되었습니다. 가장 일반적으로, CRISPR wildtype 관련 9 (Cas9) 또는 Cas12a endonuclease 게놈, DNA 이중 가닥 휴식 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 또는 상 동 감독 수리 (를 통해 복구 후에 특정 사이트를 쪼개 다 하는 데 사용 됩니다. HDR) 통로 기증자 서식 파일 인지에 따라 결 석 또는 각각 제시. 날짜 하려면, 다른 세균 종에서 CRISPR 시스템 게놈 포유류 세포에서 편집을 수행 할 수 표시 되었습니다. 그러나, 기술의 명백한 단순에도 불구 하 고 여러 설계 매개 변수 필요 간주, 종종 그들의 게놈 편집 실험 수행에 최고의 방법에 대 한 당황 하 게 하는 사용자를 떠나. 여기, 우리가 원하는 DNA 수정, 편집 하는 포유류 세포에 실험 하는 게놈의 성공적인 실행을 촉진의 목표를 수행 하는 세포 클론의 식별에 실험적인 디자인의 완벽 한 워크플로우를 설명 합니다. 우리는 사용자의를 위한 주요 고려 사항 선택 CRISPR 시스템, 공백 길이 그리고 단일 가닥 oligodeoxynucleotide (ssODN) 기증자 서식 파일의 디자인을 포함 하 여 강조 표시 합니다. 우리는이 워크플로 유전자 녹아웃 연구, 모델링 노력, 질병에 대 한 도움이 될 것입니다 또는 기자 생성 세포 라인을 구상.

실험, 관심 소재 시 복제 될 필요가 타겟팅 sgRNA 표현 CRISPR 플라스 미드를 편집 하는 게놈을 수행 합니다. 첫째, 플라스 미드는 그것을 선형화 하는 제한 효소 (일반적으로 타입 IIs 효소)로 소화 된다. 완전 하 고 부분 소화 사이 구별 하는 소화 되지 않은 플라스 미드와 함께 1 %agarose 젤에 소화 제품을 확인 하는 것이 좋습니다. 소화 되지 않은 플라스 미드는 supercoiled, 그들은 선형화 (참조 <strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

이 프로토콜은 CRISPR-Cas9를 사용하여 녹아웃 또는 녹아웃 라인을 만듭니다. 이 기술의 주요 장점은 초보 연구원을 위해 특히 따르는 것이 간단하고 효율적이라는 것입니다. 세포 통과의 경우, 2 분 동안 섭씨 37도에서 플레이트 당 0.25 %의 트립신 EDTA의 2 밀리리터로 하룻밤 배양 세포를 치료하십시오.세포가 플레이트 바닥에서 들어 올릴 때, 세포 배양 배지의 2밀리리터로 효소 반응을 중화시키고, 세포 현탁액을 원내 튜브로 옮기다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 계산을 위한 신선한 세포 배양 배지의 5밀리리터에서 펠릿을 재중단합니다. 그런 다음 1.8배 10번을 5세포에 1.8배, 즉 24웰의 조직 배양판으로 1.8배, 이산화탄소는 5%로 하룻밤 문화를 갖는다.세포의 배설을 위해, 실험 설계 및 제조업체의 지시에 따라, 검사 시약의 적절한 부피에 CRISPR 플라스미드의 적절한 농도를 포함하는 경질 혼합의 적절한 볼륨을 추가합니다. 권장 시간 동안 실온에서 형질 혼합을 배양 한 후 낙하 방식으로 세포에 용액을 추가하십시오. 그런 다음 접시를 부드럽게 소용돌이어 접시를 혼합하고 5 %의 이산화탄소와 가습 섭씨 37도 인큐베이터에 놓습니다.형질 전환의 끝에서, 단지 입증 된 대로 세포를 해리하고 원심 분리에 의해 분리 된 세포를 수집하기 위해 트립신-EDTA의 150 마이크로 리터를 추가합니다. PBS에서 2% 태아 소 혈청에서 펠릿을 다시 중단하고 30 마이크로미터 메쉬 스트레이너를 통해 세포를 5밀리리터 형광 활성화 세포 선별 또는 FACS 튜브로 필터링합니다. 그런 다음 비-전염된 세포를 사용하여 유동 세포계상에 음수 조절 게이트를 설정하고 100 마이크로리터를 함유하는 튜브내형에 사용되는 CRISPR 플라스미드상형마커에 따라 전관된 세포를 분류한다.모든 전감염된 세포가 수집되었을 때, 세포배양 배지의 300마이크로리터에서 원심분리에 의해 세포를 원심분리하여 펠릿을 재연한다. 24웰 조직 배양 판의 한 우물에 세포의 200 마이크로 리터를 종자 하 고 세포37 섭씨 인큐베이터에서 며칠 동안 복구 할 수 있도록. 펠릿 5 분 동안 최대 속도로 선별 된 세포의 나머지 100 마이크로 리터를 펠릿 과 표준 DNA 추출 프로토콜에 따라 결과 펠릿에서 게놈 DNA를 추출.다음으로, 폴리머라제 연쇄 반응 완충제 10마이크로리터, 탈옥뉴클레오티드 믹스 1마이크로리터, 사용자 정의 역프라이머 2.5 마이크로리터, DNA 폴리머라제 0.5 마이크로리터, 추출된 게놈 DNA 템플릿의 2~5마이크로리터, 50마이크로리터의 최종 부피에 대한 반응을 가져올 수 있는 충분한 이중 증류수를 추가한다. 열 사이클러에 혼합물을 실행하고 표준 프로토콜에 따라 1X TAE 버퍼를 사용하여 2% 아가로즈 젤에 대한 반응을 해결한다. 깨끗하고 날카로운 메스를 사용하여 폴리머라제 체인 반응 생성물을 소비하고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다.260 나노미터 흡광도에서 분광계를 사용하여 제품의 농도를 측정합니다. 격리된 DNA의 200 나노그램, T7 의 마이크로리터 I 반응 버퍼, 19 마이크로리터에 혼합물의 최종 부피를 가져오기에 충분한 이중 증류수를 포함하는 분석 믹스를 준비한다. 폴리머라제 연쇄 반응 생성물을 표시된 파라미터에서 열 사이클러로 회수하고 T7 엔도니클로스 I의 5단위를 섭씨 37도에서 50분 동안 배양한 제품으로 혼합한다.인큐베이션의 끝에서, 1X TAE 버퍼를 사용하여 2.5%의 아가로즈 젤로에서 소화된 DNA를 해결하고, 적절한 겔 이미징 시스템에서 겔을 이미지화한다. ImageJ에서 젤 이미지를 열고 밴드 주위에 사각형 상자를 가능한 한 경계에 가깝게 그립니다. 분석 및 측정 설정을 클릭하여 영역, 평균 회색 값 및 통합 밀도 옵션을 확인합니다.확인을 클릭하고 분석 및 측정을 선택합니다. 평균 또는 원시 강도 밀도 값은 대역 강도를 나타냅니다. 배양-전염된 세포가 컨부유해지기 시작하면, 입증된 바와 같이 트립신-EDTA로 세포를 분리하고, 세포 배양배기로 세포를 되돌리기 전에 개별 식민지가 성장할 수 있도록 100mm 조직 배양 접시에서 세포를 희소하게 파종한다.식민지가 형성되기 시작하면 4 X 배율의 현미경을 사용하여 4 개의 X 배율로 현미경을 사용하여 500 마이크로 리터의 세포 배양 배지를 포함하는 24 웰 플레이트의 개별 우물로 옮길 개별 식민지를 선택하십시오. 팁이 개별 우물 내에서 식민지의 혼합을 방지하기 위해 주변 식민지를 만지지 않도록주의하거나 희소 식민지 성장의 영역에서 선택. 모든 클론을 골랐을 때, 배양이 수렴될 때까지 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.소화되지 않은 플라스미드는 매우 코일러이기 때문에 선형화된 플라스미드보다 빠르게 달리는 경향이 있습니다. 올리고뉴클레오티드가 CRISPR 플라스미드 백본으로 성공적으로 복제되었는지 확인하기 위해, 콜로니 PCR이 수행되고 플라스미드가 추출되기 전에 양성 클론이 접종되어 Sanger 시퀀싱을 위해 전송된다. 형광 신호는 플라스미드의 성공적인 납품시 현미경으로 쉽게 시각화될 수 있으며, 전감염된 세포는 유동 세포측정에 의해 정렬될 수 있게 한다.A T7 엔도나크리스 I 분석은 아가로즈 겔상에서 관찰된 밴드의 강도로부터 계산된 바와 같이 게놈 DNA의 절단 효율을 확인하기 위해 수행된다. 또한, 상동성 지향 수리 기반 실험이 표적 궤적에 제한 부위를 통합하도록 설계된 경우, 제한 단편 길이 다형성 분석은 해당 제한 효소로 수행될 수 있다. 단백질 코딩 유전자가 성공적으로 비활성화되었음을 더욱 검증하기 위해, 표적 단백질이 존재하지 않도록 서양 얼룩을 수행할 수 있습니다.이식 후 세포를 분류하면 통합 된 플라스미드없이 세포를 제거하여 나중에 선별 된 세포의 비율을 녹아웃 또는 녹아웃 유전자로 증가시합니다. 이 기술의 발달로, 우리는 지금 그들의 기계장치를 이해하기 위하여 특정 질병을 모델링하기 위하여 유전자 기능 및 노크에 세포주를 공부하기 위하여 녹아웃 세포주를 생성할 수 있습니다.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

연구

유전학

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 CRISPR 중재

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

질소 고정 열대 카나바세아 나무 파라스포니아 앤더슨이 변형, 게놈 편집 및 현상형 화

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

필라멘트 아콤유세테 헌티엘라 오만시스에서 CRISPR-Cas9 중재 게놈 편집

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...