Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

M.H.T. støttes av et byrå for vitenskap teknologi og Research felles rådet Office grant (1431AFG103), gir en National Medical Research Council (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation gir (NRF2013-THE001-046 og NRF2013-THE001-093), en Departementet for utdanning Tier 1 grant (RG50-17 (S)), en oppstart gi fra Nanyang Technological University, og midler til internasjonale genetisk Engineering maskin (iGEM) konkurransen fra Nanyang Technological University.

1. design av sgRNAs
<ol><li>Velg en passende CRISPR-Cas-system.<ol>
<li>Først inspisere målregion for PAM sekvensene av alle Cas9 og Cas12a nucleases som har vist seg å fungere i pattedyrceller16,21-32. Fem brukte enzymer er gitt i tabell 1 sammen med deres respektive PAMs. Merk: i tillegg til endonucleases oppført i tabell 1, det finnes andre mindre brukte Cas enzymer som har blitt distribuert i pattedyrceller også, som en Cas9 nuclease fra Streptococcus thermop...

CRISPR-Cas systemet er en kraftig og revolusjonerende teknologi til ingeniør genomes og transcriptomes av planter og dyr. Mange bakteriell arter er funnet for å inneholde CRISPR-Cas-systemer, som kan være tilpasset genom og transcriptome engineering formål44. Selv om Cas9 endonuclease fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) var den første enzymet distribueres vellykket i menneskeceller21,22,23<s...

Muligheten til å ingeniør genomet av enhver levende organisme har mange biomedisinsk og bioteknologisk programmer, for eksempel korrigering av sykdomsfremkallende mutasjoner, bygging av nøyaktige mobilnettet modeller for sykdom studier eller generering av landbruket vekster med ønskelig egenskaper. Siden begynnelsen av århundret, ulike teknologier er utviklet for genomet engineering i pattedyrceller, inkludert meganucleases1,2,3, sink finger nucleases4,5, eller transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs)6,7,8,9. Men er disse tidligere teknologiene vanskelig å programmet eller kjedelig å montere, og dermed hindrer deres utbredt adopsjon i forskning og industri.
De siste årene, de klynget interspaced regelmessig kort palindromic gjentar (CRISPR) - CRISPR-assosiert (Cas) systemet har dukket opp som en kraftig ny genomet engineering teknologi10,11. Opprinnelig en adaptive immunsystemet i bakterier, det har blitt deployert for genomet endring i planter og dyr, inkludert mennesker. Hovedårsak hvorfor CRISPR-Cas har fått så mye popularitet i så kort tid er at elementet som bringer den viktigste Cas-endonuclease, som Cas9 eller Cas12a (også kjent som Cpf1), til riktig sted i genomet er bare et kort stykke chimeric enkelt støttelinje RN En (sgRNA), som er enkelt å utforme og billig å syntetisere. Etter blir rekruttert til målområdet, Cas enzymet fungerer som et par molekylær saks og innstiftet bundet DNA med sin RuvC, HNH eller Nuc domener12,13,14. Resulterende dobbel strandet pause (DSB) repareres senere av cellene via enten ikke-homologe slutten med (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR) veien. I fravær av en reparasjon mal repareres DSB av feilutsatte NHEJ veien, som kan gi opphav til pseudo-tilfeldige innsetting eller sletting av nukleotider (indeler) på webområdet kutt, potensielt forårsake frameshift mutasjoner i protein-koding gener. Men i nærvær av en donor mal som inneholder endringene i DNA, er DSB reparert av Hi-Fi HDR veien. Vanlige typer donor maler inkluderer enkelt-strandet oligonucleotides (ssODNs) og plasmider. Tidligere brukes vanligvis hvis tiltenkte DNA endringene er små (for eksempel endring av en enkelt base-par), mens sistnevnte brukes vanligvis hvis man ønsker å sette inn en relativt lang sekvens (for eksempel koding sekvensen av en grønn fluorescerende protein eller GFP) i målet locus.
Endonuclease aktiviteten til Cas protein krever tilstedeværelse av en protospacer tilstøtende motiv (PAM) mål område15. PAM Cas9 er på 3 slutten av protospacer, PAM Cas12a (også kalt Cpf1) er på 5' slutten i stedet16. Cas-guiden RNA komplekse er ikke innføre en DSB hvis PAM er fraværende17. Derfor plasserer PAM en begrensning på genomisk stedene der en bestemt Cas-nuclease er i stand til å holde seg. Heldigvis viser Cas nucleases fra ulike bakterie-art vanligvis ulike PAM krav. Ved å integrere ulike CRISPR-Cas systemer i våre tekniske verktøykassen, kan vi derfor utvide omfanget av nettsteder som kan målrettes i et genom. Videre kan et naturlig Cas enzym være konstruert eller utviklet for å gjenkjenne alternativ PAM sekvenser, ytterligere utvide omfanget av genomisk mål tilgjengelig for manipulasjon18,19,20.
Selv om flere CRISPR-Cas-systemer finnes genomet engineering formål, har de fleste brukere av teknologi stolt på Cas9 nuclease fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) av flere grunner. Først krever det en relativt enkelt NGG PAM, i motsetning til mange andre sertifiseringsinstanser proteiner som kan bare holde seg i nærvær av mer komplekse PAMs. Det andre er den første Cas endonuclease å bli distribuert i menneskeceller21,22,23,24. Tredje er SpCas9 langt den beste preget enzymet hittil. Hvis en forsker ønsker å bruke en annen Cas nuclease, vil han eller hun ofte være uklart om hvordan best å utforme eksperimentet og hvor godt andre enzymer vil opptre i ulike biologiske sammenhenger i forhold til SpCas9.
For å utdype den relative ytelsen til forskjellige CRISPR-Cas-systemer, har vi nylig utførte en systematisk Sammenlikning av fem Cas endonucleases-SpCas9, Cas9 enzymet fra Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzymet fra Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzymet fra Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) og Cas12a enzymet fra Lachnospiraceae bakterie ND2006 (LbCas12a)25. For en rettferdig sammenligning vurdert vi de ulike Cas nucleases bruker samme sett med målområder og andre eksperimentelle forhold. Studien også avgrenset design parameterne for hver CRISPR-Cas-system, som ville tjene som en nyttig referanse for brukere av teknologi. Her, bedre aktiverer forskere å bruke CRISPR-Cas system, gir vi en trinnvis protokoll for optimal genomet engineering med forskjellige Cas9 og Cas12a enzymer (se figur 1). Protokollen inkluderer ikke bare eksperimentelle detaljer men også viktige Utformingshensyn å maksimere sannsynligheten for et vellykket genomet engineering resultat i pattedyrceller.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> Figur 1 : En oversikt over arbeidsflyten skal generere genomet endret humane cellelinjer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

Gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) systemet fungerer naturlig bakteriell adaptiv immunitet, men har blitt vellykket repurposed genomet Engineering i mange forskjellige levende organismer. Oftest wildtype CRISPR tilknyttet 9 (Cas9) eller Cas12a endonuclease brukes til å holde seg bestemte nettsteder i genomet, hvoretter DNA double-strandet pause repareres via ikke-homologe slutten å bli (NHEJ) veien eller homologi-rettet reparasjon ( HDR) sti avhengig av om en giver mal er fraværende eller presentere henholdsvis. Hittil har CRISPR systemer fra ulike bakterie-art vist å kunne utføre genomet redigering i pattedyrceller. Men til tross for den tilsynelatende enkelheten av teknologi må flere design parametere vurderes, som ofte lar brukerne rådvill om hvordan best for å utføre sine genom redigering eksperimenter. Her beskriver vi en komplett arbeidsflyt fra experimental design til identifikasjon av cellen kloner som bærer DNA endringer, med mål om å tilrettelegge vellykket gjennomføring av genomet redigering eksperimenter i pattedyr linjer. Vi markere nøkkelfaktorer for brukere å merke, inkludert valg av CRISPR system, hvor mellomrom og utformingen av en enkelt-strandet oligodeoxynucleotide (ssODN) giver mal. Vi forventer at denne arbeidsflyten vil være nyttig for genet knockout studier, sykdom modellering innsats, eller generering av reporteren cellelinjer.

Utføre et genom redigering eksperiment, en CRISPR plasmider uttrykke en sgRNA rettet mot den locus steder skal klones. Først er plasmider fordøyd med en begrensning enzym (vanligvis en type IIs enzym) å linearize den. Det anbefales å løse fordøyd produktet på en 1% agarose gel sammen med en ufordøyd plasmider å skille mellom en fullstendig og delvis fordøyelsen. Som ufordøyd plasmider er supercoiled, pleier de å kjøre raskere enn sine linearisert kolleger (se figur 7en<...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genomet redigering i pattedyr linjer med CRISPR-Cas

CRISPR-Cas er en kraftig teknologi til ingeniør komplekse genomer av planter og dyr. Her, detalj vi en protokoll effektivt redigere det menneskelige genomet bruker forskjellige Cas-endonucleases. Vi markere viktige hensyn og design parametere for å optimalisere redigering effektivitet.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Denne protokollen bruker CRISPR-Cas9 til å opprette knock-out- eller knock-in-linjer. Den største fordelen med denne teknikken er at det er enkelt og effektivt å følge spesielt for nybegynnere forskere. For cellepassaging, behandle overnatten kultiverte celler med to milliliter på 0,25% trypsin EDTA per plate ved 37 grader Celsius i to minutter.Når cellene har løftet fra platebunnen, nøytraliser den enzymatiske reaksjonen med to milliliter cellekulturmedium, og overfør cellesuspensjonen til et konisk rør. Samle cellene ved sentrifugering og gjenbruk pellet i fem milliliter av fersk celle kultur medium for telling. Deretter frø 1,8 ganger 10 til de femte cellene i en brønn av en 24-brønns vev kultur plate for overnatting kultur på 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.For transfection av cellene, legg til et passende volum av transfection blanding som inneholder riktig konsentrasjon av CRISPR plasmid til riktig volum av transfection reagens, i henhold til eksperimentell design og produsentens instruksjoner. Etter inkubering av transfection blandingen ved romtemperatur for den anbefalte tidsperioden, legg til løsningen til cellene på en drop-wise måte. Virvle deretter forsiktig platen for å blande og plassere platen i en fuktet 37 grader Celsius inkubator med 5% karbondioksid.På slutten av transfection, tilsett 150 mikroliter trypsin-EDTA å dissosiere cellene som nettopp demonstrert og samle de frittliggende cellene ved sentrifugering. Resuspend pellet i 2% fosterbovin serum i PBS og filtrere cellene gjennom en 30 mikrometer mesh sil i en fem milliliter fluorescens-aktivert celle sortering, eller FACS tube. Bruk deretter de ikke-trans infiserte cellene til å sette en negativ kontrollport på strømningssytometeret og sortere de trans infiserte cellene i henhold til den fluorescerende markøren på CRISPR plasmid som brukes til transinfeksjonen i et rør som inneholder 100 mikroliter cellekulturmedium.Når alle de trans infiserte cellene er samlet inn, pellet cellene ved sentrifugering med maksimal hastighet og resuspend pellet i 300 mikroliter av cellekultur medium. Seed 200 mikroliter av celler i en brønn av en 24-brønns vevskulturplate og la cellene gjenopprette i noen dager i en 37 graders Celsius inkubator. Pellet de resterende 100 mikroliter av sorterte celler med maksimal hastighet i fem minutter og trekke ut genomisk DNA fra den resulterende pellet i henhold til standard DNA ekstraksjon protokoller.Deretter legger du til 10 mikroliter polymerasekjedereaksjonsbuffer, en mikroliter deoksynucleotidblanding, 2,5 mikroliter av brukerdefinert omvendt primer, 0,5 mikroliter DNA-polymerase, to til fem mikroliter av den ekstraherte genomiske DNA-malen og nok dobbeltdestillert vann for å bringe reaksjonen til et endelig volum på 50 mikroliter. Kjør blandingen på en termisk cycler og løse reaksjonen på en 2% agarose gel ved hjelp av 1X TAE buffer i henhold til standardprotokoller. Bruk en ren, skarp skalpell for å avgiftsdirektoratet polymerasekjeden reagere produktet og rense DNA ved hjelp av en gel ekstraksjon kit i henhold til produsentens instruksjoner.Mål konsentrasjonen av produktet ved hjelp av et spektrofotometer ved 260 nanometer absorbans. Forbered en analyseblanding som inneholder 200 nanogram av det isolerte DNA- et, to mikroliter T7-endonukle i reaksjonsbuffer, og nok dobbeltdestillert vann til å bringe det endelige volumet av blandingen til 19 mikroliter. Reanneal polymerase kjedereaksjonsproduktet i en termisk cycler ved de angitte parametrene og bland fem enheter T7 endonukleær I med det reannealed produktet i en 50 minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, løse fordøyd DNA på en 2,5% agarose gel ved hjelp av 1X TAE buffer, og bilde gelen på en passende gel imaging system. Åpne gelbildet i ImageJ og tegn en rektangulær boks rundt båndet så nær grensen som mulig. Klikk Analyser og Angi målinger, som bekrefter at området, gjennomsnittlig grå verdi og alternativer for integrert tetthet er merket.Klikk OK, og velg Analyser og Mål. Gjennomsnittlig, eller rå intensitetstetthetsverdi, indikerer båndintensiteten. Når de kulturtrans infiserte cellene begynner å bli samløpet, løsne dem med trypsin-EDTA, som demonstrert, og frø cellene sparsomt i en 100 millimeter vevkulturrett for å gi tilstrekkelig plass til individuelle kolonier å vokse før de returnerer cellene til cellekulturinkubatoren.Når koloniene begynner å danne seg, bruk et mikroskop med en fire X forstørrelse for å plukke de enkelte koloniene for overføring til individuelle brønner av en 24-brønnsplate som inneholder 500 mikroliter cellekulturmedium per brønn. Vær forsiktig med at spissen ikke berører de omkringliggende koloniene for å forhindre blanding av kolonier i individuelle brønner eller plukke fra et område med sparsom kolonivekst. Når alle klonene er plukket, plasser platen i cellekulturinkubatoren til kulturene blir samløpet.Som ufordøyde plasmider er super-kveilet, har de en tendens til å kjøre raskere enn sine lineære kolleger. For å finne ut om oligonucleoides har blitt klonet inn i CRISPR plasmid ryggraden, koloni PCR utføres og de positive klonene er inokulert før plasmidene ekstraheres og sendes til Sanger sekvensering. Det fluorescerende signalet kan lett visualiseres under et mikroskop ved vellykket levering av plasmidene, slik at de trans infiserte cellene kan sorteres etter strømningscytometri.En T7 endonukleær I analyse utføres for å sjekke spaltingseffektiviteten til genomisk DNA, som beregnet ut fra intensitetene til båndene observert på en agarosegel. I tillegg, hvis et homologi-rettet reparasjonsbasert eksperiment er utformet for å innlemme et restriksjonssted på målområdet, kan en begrensning fragmentlengde polymorfismeanalyse utføres med et tilsvarende begrensningsenzym. For ytterligere å validere at et proteinkodingsgen har blitt inaktivert, kan en vestlig flekk utføres for å sikre at det ikke finnes noe målrettet protein.Sortering av cellene etter transfeksjon eliminerer cellene uten inkorporerte plasmider, og øker dermed prosentandelen av celler screenet på senere stadier som å ha et knock-out eller knock-in gen. Med utviklingen av denne teknikken er vi nå i stand til å produsere knock-out cellelinjer for å studere genfunksjon og knock-in cellelinjer for å modellere spesifikke sykdommer for å forstå deres mekanisme.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Fastsettelse av pattedyr Replication Timing av DNA innhold Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Kromatinimmunpresipitasjon (ChIP) i mus-T-cellelinjer

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Forbedret genomet redigering med Cas9 Ribonucleoprotein i ulike celler og organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Disseksjon Enhancer funksjon med Multiplex CRISPR-baserte Enhancer forstyrrelser i linjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediert genomet redigering av Human Fungal patogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformasjon, Genova redigering og bestemmelse av fenotype av nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Cell Surface Reseptor identifikasjon ved hjelp av genom-skala CRISPR / Cas9 genetiske skjermer

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Vi introduserer punktmutasjoner i menneskelige pluripotente stamceller ved hjelp av sømløs genomredigering

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-mediert genomredigering i filamentous ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...