Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
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M.H.T. é suportado por uma agência de tecnologia da ciência e da pesquisa concessão de escritório comum do Conselho (1431AFG103), um Conselho Nacional de pesquisa médica grant (OFIRG/0017/2016), Fundação Nacional de pesquisa concede (NRF2013-THE001-046 e NRF2013-THE001-093), um Concessão do Ministério da educação Tier 1 (RG50/17 (S)), uma startup grant da Universidade Tecnológica de Nanyang e fundos para a competição internacional geneticamente engenharia máquina (Medren) da Universidade Tecnológica de Nanyang.

1. design de sgRNAs
<ol><li>Selecione um sistema adequado de CRISPR-Cas.<ol>
<li>Primeiro, inspecione a região de destino para as sequências de PAM de todas as nucleases Cas9 e Cas12a que foram mostradas para ser funcional em células de mamíferos16,21-32. Cinco enzimas usadas com frequência são descritas na tabela 1 , juntamente com seus respectivas PAMs. Nota: além das endonucleases listados na tabela 1, há outras enzimas Cas menos comumente usadas que foram impl...

O sistema CRISPR-Cas é uma poderosa, revolucionária tecnologia para projetar os genomas e transcriptomes de plantas e animais. Numerosas espécies bacterianas foram encontradas para conter sistemas CRISPR-Cas, que potencialmente podem ser adaptados para o genoma e transcriptoma fins44de engenharia. Embora a endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) foi a primeira enzima a ser implantado com sucesso em células humanas21,22<...

A capacidade para projetar o genoma de qualquer organismo vivo tem muitas aplicações biomédicas e biotecnológicas, como a correção da doença-causando mutações, construção de modelos de celulares precisos para estudos de doença, ou geração de produtos agrícolas culturas com características desejáveis. Desde a virada do século, diversas tecnologias foram desenvolvidas para a engenharia do genoma em células de mamíferos, incluindo meganucleases1,2,3, zinco dedo nucleases4,5, ou transcrição como ativador effector nucleases (TALENs)6,7,8,9. No entanto, estas tecnologias anteriores são difíceis de programa ou tedioso para montar, prejudicando, assim, sua adoção generalizada na investigação e a indústria.
Nos últimos anos, o cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) - sistema CRISPR-associado (Cas) tem emergido como um poderoso novo genoma engenharia tecnologia10,11. Originalmente um sistema imune adaptativo em bactérias, tem sido com sucesso implantado para a modificação do genoma em plantas e animais, incluindo seres humanos. Uma razão principal por que CRISPR-Cas ganhou tanta popularidade em tão pouco tempo é que o elemento que traz a chave endonuclease de Cas, tais como Cas9 ou Cas12a (também conhecido como Cpf1), para o local correto no genoma é simplesmente um pedaço curto de quimérico único guia RN Um (sgRNA), que é simples para o projeto e barato para sintetizar. Depois de ser recrutado para o site de destino, a enzima Cas funciona como um par de tesouras moleculares e cliva o DNA acoplado com sua RuvC, HNH ou Nuc domínios12,13,14. A resultante quebra encalhada dobro (DSB) é posteriormente reparada pelas células através de fim não-homóloga (NHEJ) juntar-se ou no caminho de reparação homologia-dirigido (HDR). Na ausência de um modelo de reparação, o ORL é reparado por via NHEJ propenso a erro, que pode dar origem a pseudo-aleatório inserção ou supressão de nucleotídeos (puntuais) no local do corte, potencialmente causando frameshift mutações nos genes codificantes de proteínas. No entanto, na presença de um modelo de doador que contém as alterações de DNA desejadas, o ORL é reparado por via HDR de alta fidelidade. Tipos comuns de modelos de doadores incluem oligonucleotides single-stranded (ssODNs) e plasmídeos. O primeiro costuma ser usado se as alterações de DNA pretendidas são pequenas (por exemplo, a alteração de um único par de base), enquanto o último é geralmente usado se deseja inserir uma sequência relativamente longa (por exemplo, a sequência de codificação de uma proteína verde fluorescente ou GFP) para o local de destino.
A atividade de endonuclease da proteína Cas requer a presença de um motivo protospacer adjacentes (PAM) para o local de destino15. O PAM de Cas9 é na extremidade 3' da protospacer, enquanto o PAM de Cas12a (também chamado Cpf1) é, ao invés, na extremidade 5'16. O Cas-guia complexo RNA é incapaz de apresentar um ORL se o PAM estiver ausente17. Daí, o PAM coloca uma restrição na genômicas locais onde um determinado nuclease Cas é capaz de decompor. Felizmente, nucleases de Cas de diferentes espécies bacterianas geralmente apresentam exigências diferentes do PAM. Portanto, integrando vários sistemas CRISPR-Cas em nossa caixa de ferramentas de engenharia, podemos expandir a gama de sites que podem ser alvo de um genoma. Além disso, uma enzima natural do Cas pode ser projetada ou evoluiu para reconhecer sequências de PAM alternativas, ainda mais, alargar o âmbito da genômicos alvos acessíveis para manipulação de19,18,20.
Embora vários sistemas CRISPR-Cas estão disponíveis para fins de engenharia do genoma, a maioria dos usuários da tecnologia dependem principalmente da nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) por várias razões. Em primeiro lugar, requer um PAM relativamente simplesmente NGG, ao contrário de muitas outras proteínas de Cas que podem cleave apenas na presença de PAMs mais complexas. Em segundo lugar, é a primeira endonuclease Cas seja implantado com sucesso em células humanas21,22,23,24. Em terceiro lugar, SpCas9 é, de longe, a melhor enzima caracterizada até à data. Se um pesquisador deseja usar outro nuclease Cas, ele ou ela muitas vezes seria incerto sobre qual a melhor forma de projetar o experimento e bem como outras enzimas irão realizar em diferentes contextos biológicos em relação ao SpCas9.
Para fornecer clareza para o desempenho relativo dos diferentes sistemas de CRISPR-Cas, recentemente Efetuamos uma comparação sistemática de cinco endonucleases de Cas-SpCas9, a enzima Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9), a enzima Cas9 de Neisseria meningitidis (NmCas9), a enzima Cas12a de SP Acidaminococcus BV3L6 (AsCas12a) e a enzima Cas12a de bactéria Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. Para uma comparação justa, avaliamos as nucleases de Cas diferentes usando o mesmo conjunto de sites de destino e outras condições experimentais. Os parâmetros de projeto de estudo também delineado para cada sistema CRISPR-Cas, que serviu como uma referência útil para os usuários da tecnologia. Aqui, para melhor permitir aos investigadores fazer uso das CRISPR-Cas sistema, nós fornecemos um protocolo passo a passo para engenharia de genoma ideal com diferentes enzimas Cas9 e Cas12a (ver Figura 1). O protocolo inclui não apenas detalhes experimentais, mas considerações de design também é importante para maximizar a probabilidade de um resultado de sucesso do genoma engenharia em células de mamíferos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> Figura 1 : Uma visão geral do fluxo de trabalho para gerar o genoma edição linha celular humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

O sistema regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) em cluster funciona naturalmente na imunidade adaptativa bacteriana, mas tem com êxito foi realocado para engenharia do genoma em muitos organismos vivos diferentes. Mais comumente, a sua CRISPR associado 9 (Cas9) ou Cas12a endonuclease é usado para decompor a locais específicos no genoma, após o qual o intervalo de dupla-hélice do DNA é reparado através de fim não-homóloga aderir a caminho (NHEJ) ou o reparo de homologia-dirigido ( Caminho HDR) dependendo se é um modelo de doador ausentes ou apresentam respectivamente. Até à data, sistemas CRISPR de diferentes espécies bacterianas foram mostrados para ser capaz de realizar a edição de genoma em células de mamíferos. No entanto, apesar da aparente simplicidade da tecnologia, vários parâmetros de projeto precisam ser considerados, que muitas vezes deixam perplexos sobre como melhor realizar seu genoma edição de experiências de usuários. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo de delineamento experimental para identificação de clones de células que levam a modificações de DNA desejadas, com o objetivo de facilitar a execução bem-sucedida do genoma edição experimentos em linhas de células de mamíferos. Destacamos as considerações-chave para que os usuários anotem, incluindo a escolha do sistema CRISPR, o comprimento do espaçador e o design de um modelo de doador single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN). Vislumbramos que este fluxo de trabalho será útil para estudos de gene nocaute, doença modelagem esforços, ou linhas de célula a geração de repórter.

Para executar um genoma edição experimento, um plasmídeo CRISPR expressando uma sgRNA como alvo que o locus de interesse precisa ser clonado. Primeiro, o plasmídeo é digerido com uma enzima de restrição (normalmente um tipo de enzima do IIs) para linearizá-lo. É recomendável para resolver o produto digerido em um gel de agarose 1% ao lado de um plasmídeo não digerido para distinguir entre uma digestão completa e parcial. Como plasmídeo não digerido supercoiled, eles tendem a correr mais rápido do que suas...

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Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

CRISPR-Cas é uma tecnologia poderosa para projetar os genomas complexos de plantas e animais. Aqui, detalhamos um protocolo eficiente editar o genoma humano usando diferentes endonucleases de Cas. Destacamos importantes considerações e parâmetros de projeto para otimizar a eficiência de edição.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Este protocolo usa o CRISPR-Cas9 para criar linhas de knock-out ou knock-in. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples e eficiente de seguir especialmente para pesquisadores iniciantes. Para a passagem celular, trate células cultivadas durante a noite com dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA por placa a 37 graus Celsius por dois minutos.Quando as células tiverem levantado do fundo da placa, neutralizar a reação enzimática com dois mililitros de cultura celular média, e transferir a suspensão celular para um tubo cônico. Colete as células por centrifugação e resuspense a pelota em cinco mililitros de meio de cultura celular fresca para contar. Em seguida, semente 1,8 vezes 10 para as quintas células em um poço de uma placa de cultura tecidual de 24 poços para cultura noturna a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono.Para transfecção das células, adicione um volume apropriado de mistura de transfecção contendo a concentração adequada de plasmídeo CRISPR ao volume apropriado de reagente de transfecção, de acordo com o design experimental e as instruções do fabricante. Depois de incubar a mistura de transfecção à temperatura ambiente pelo período recomendado, adicione a solução às células de forma em gota. Em seguida, gire suavemente a placa para misturar e coloque a placa em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.No final da transfecção, adicione 150 microliters de trypsin-EDTA para dissociar as células como apenas demonstrado e coletar as células separadas por centrifugação. Resuspenque a pelota em soro bovino fetal de 2% em PBS e filtre as células através de um filtro de malha de 30 micrômetros em uma triagem celular ativada por fluorescência de cinco milímetros, ou tubo FACS. Em seguida, use as células não transfectidas para definir um portão de controle negativo no citômetro de fluxo e classificar as células transfeccionadas de acordo com o marcador fluorescente no plasmídeo CRISPR usado para a transfecção em um tubo contendo 100 microliters de meio de cultura celular.Quando todas as células transfeinadas tiverem sido coletadas, pelota as células por centrifugação em velocidade máxima e resuspense a pelota em 300 microliters de meio de cultura celular. Semente 200 microliters de células em um poço de uma placa de cultura tecidual de 24 poços e permitem que as células se recuperem por alguns dias em uma incubadora Celsius de 37 graus. Pelota os 100 microliters restantes de células classificadas em velocidade máxima por cinco minutos e extraia o DNA genômico da pelota resultante de acordo com protocolos padrão de extração de DNA.Em seguida, adicione 10 microliters de tampão de reação em cadeia de polimerase, um microlitr de mistura de desoxynucleotídeo, 2,5 microliters de primer reverso definido pelo usuário, 0,5 microliters de POLIMERASE de DNA, dois a cinco microliters do modelo de DNA genômico extraído e água dupla-destilada suficiente para trazer a reação a um volume final de 50 microliters. Execute a mistura em um cicloviário térmico e resolva a reação em um gel de 2%agarose usando tampão TAE 1X de acordo com os protocolos padrão. Use um bisturi limpo e afiado para extirpar o produto de reação da cadeia de polimerase e purificar o DNA usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.Meça a concentração do produto usando um espectrofotômetro a 260 nanômetros de absorvimento. Prepare uma mistura de ensaio contendo 200 nanogramas do DNA isolado, dois microliters de tampão de reação Endonuclease I T7, e água dupla destilada suficiente para levar o volume final da mistura para 19 microliters. Reanneal o produto de reação em cadeia de polimerase em um cicloviário térmico nos parâmetros indicados e misture cinco unidades de Endonuclease T7 com o produto reaalado para uma incubação de 50 minutos a 37 graus Celsius.No final da incubação, resolva o DNA digerido em um gel de 2,5% de agarose usando tampão 1X TAE, e imagem do gel em um sistema de imagem de gel apropriado. Abra a imagem em gel no ImageJ e desenhe uma caixa retangular ao redor da banda o mais perto possível de seu limite. Clique em Analisar e Definir Medidas, confirmando que a área, o valor médio cinza e as opções de densidade integrada são verificados.Clique em OK e selecione Analisar e Medir. O valor médio, ou de densidade de intensidade bruta, é indicativo da intensidade da banda. Quando as células transfectadas pela cultura começam a se tornar confluentes, desvinculem-as com trippsina-EDTA, como demonstrado, e semeassem as células escassamente em um prato de cultura tecidual de 100 milímetros para permitir espaço suficiente para colônias individuais crescerem antes de devolver as células à incubadora de cultura celular.Quando as colônias começarem a se formar, use um microscópio com uma ampliação de quatro X para escolher as colônias individuais para transferência em poços individuais de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de meio de cultura celular por poço. Tome cuidado para que sua ponta não toque nas colônias circundantes para evitar a mistura de colônias dentro de poços individuais ou escolher de uma área de crescimento de colônias esparsas. Quando todos os clones tiverem sido colhidos, coloque a placa na incubadora de cultura celular até que as culturas se tornem confluentes.Como plasmídeos não digeridos são super-enrolados, eles tendem a correr mais rápido do que seus homólogos linearizados. Para determinar se os oligonucleotídeos foram clonados com sucesso na espinha dorsal plasmida CRISPR, a colônia PCR é realizada e os clones positivos são inoculados antes que os plasmídeos sejam extraídos e enviados para sequenciamento de Sanger. O sinal fluorescente pode ser facilmente visualizado sob um microscópio após uma entrega bem sucedida dos plasmídeos, permitindo que as células transfeinadas sejam classificadas por citometria de fluxo.Um ensaio endonuclease T7 É realizado para verificar a eficiência do decote do DNA genômico, conforme calculado a partir das intensidades das bandas observadas em um gel de agarose. Além disso, se um experimento baseado em reparo direcionado à escoologia for projetado para incorporar um local de restrição no lócus alvo, um ensaio de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição pode ser realizado com uma enzima de restrição correspondente. Para validar ainda mais que um gene de codificação de proteínas foi inativado com sucesso, uma mancha ocidental pode ser realizada para garantir que nenhuma proteína direcionada esteja presente.A classificação das células após a transfecção elimina as células sem plasmídeos incorporados, aumentando assim a porcentagem de células exibidas em estágios posteriores como tendo um gene knock-out ou knock-in. Com o desenvolvimento dessa técnica, agora somos capazes de produzir linhas celulares eliminatórias para estudar a função genética e linhas celulares para modelar doenças específicas para entender seu mecanismo.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) em linhas de células T de mouse

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Mediada por CRISPR genoma edição do patógeno humano fungo Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

Transformação, edição do genoma e fenotipagem do nitrogênio-fixação tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

Identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

Edição de genoma mediado por CRISPR-Cas9 no Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...