Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
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M.H.T. es apoyada por una agencia para la concesión de oficina conjunta del Consejo de ciencia, tecnología y de investigación (1431AFG103), un Consejo de investigación médica nacional conceder (OFIRG/0017/2016), otorga la Fundación Nacional de investigación (NRF2013-THE001-046 y NRF2013-THE001-093), un Subvención del Ministerio de educación nivel 1 (RG50/17 (S)), una startup becado por Universidad Tecnológica de Nanyang y fondos para la competencia internacional genéticamente máquina de la ingeniería (iGEM) de la Universidad Tecnológica de Nanyang.

1. diseño de sgRNAs
<ol><li>Seleccionar un sistema apropiado de CRISPR-Cas.<ol>
<li>En primer lugar, inspeccionar la región de destino para las secuencias de PAM de nucleasas Cas9 y Cas12a todos que han demostrado ser funcionales en células de mamífero16,21-32. Cinco enzimas utilizadas figuran en la tabla 1 junto con sus respectivas PAMs. Nota: además de las endonucleasas enumerados en la tabla 1, existen otras enzimas Cas menos comunes que han sido implementados con...

El sistema CRISPR-Cas es una potente y revolucionaria tecnología diseñar genomas los transcriptomas de plantas y animales. Numerosas especies bacterianas se han encontrado para contener sistemas CRISPR-Cas, que potencialmente pueden ser adaptados para el genoma y transcriptoma ingeniería propósitos44. Aunque la endonucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) fue la primera enzima a implementarse con éxito en células humanas21,<sup class="xref"...

La capacidad para diseñar el genoma de cualquier organismo vivo tiene muchas aplicaciones biomédicas y biotecnológicas, como la corrección de enfermedad-causar mutaciones, construcción de modelos celulares precisos estudios de la enfermedad, o generación de agrícola cultivos con características deseables. Puesto que la vuelta del siglo, se han desarrollado diversas tecnologías para la ingeniería del genoma en células de mamíferos, incluyendo meganucleases1,2,3, zinc finger nucleasas4,5, o transcripción efector activador como nucleasas (TALENs)6,7,8,9. Sin embargo, estas tecnologías anteriores son programa difícil o tedioso de montar, tal modo obstaculizando su adopción generalizada en la investigación y la industria.
En los últimos años, el cluster regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) - sistema CRISPR-asociado (Cas) se ha convertido en un genoma nuevo potente ingeniería tecnología10,11. Originalmente un sistema inmune adaptante en las bacterias, ha sido exitosamente implementado para la modificación del genoma en plantas y animales, incluyendo seres humanos. La razón principal por qué CRISPR-Cas ha ganado tanta popularidad en tan corto tiempo es el elemento que trae la clave endonucleasa de Cas, como Cas9 o Cas12a (también conocido como Cpf1), en la ubicación correcta en el genoma es simplemente una pequeña pieza de guía solo quimérica RN A (sgRNA), que es de diseño sencillo y barato sintetizar. Después de ser reclutado al sitio de destino, la enzima Cas funciona como un par de tijeras moleculares y hiende la DNA dependiente con su RuvC, HNH o Nuc dominios12,13,14. Posteriormente se repara la rotura trenzada doble resultante (de diferencias OSD) por las células a través de la vía de reparación dirigido por homología (HDR) o no homóloga se terminan uniendo (NHEJ). En la ausencia de una plantilla de reparación, el OSD es reparado por la vía NHEJ propenso, que puede dar lugar a pseudo-random inserción o deleción de nucleótidos (indels) en el sitio de corte, potencialmente causando mutágeno ' frameshift ' mutaciones en genes de la proteína-codificación. Sin embargo, en presencia de una plantilla de donante que contiene los cambios de ADN deseados, el OSD es reparado por la vía HDR de alta fidelidad. Tipos comunes de donantes plantillas son oligonucleótidos de cadena simple (ssODNs) y plásmidos. El primero se utiliza normalmente si los cambios previstos de DNA son pequeños (por ejemplo, alteración de un solo par de base), mientras que este último se suele utilizar si se desea insertar una secuencia relativamente larga (por ejemplo, la secuencia de codificación de una proteína verde fluorescente o GFP) en el lugar de destino.
La actividad endonucleasa de la proteína Cas requiere la presencia de un motivo adyacente de protospacer (PAM) en el sitio de destino15. PAM de Cas9 es el extremo 3' de la protospacer, mientras que el PAM de Cas12a (también llamado Cpf1) está en el extremo 5' en lugar16. La guía de Cas RNA complejo es incapaz de introducir un OSD si el PAM es ausente17. Por lo tanto, el PAM coloca una restricción en las localizaciones genómicas donde una nucleasa Cas particular es capaz de unirse. Afortunadamente, las nucleasas de la Cas de diferentes especies bacterianas típicamente exhiben diversos requisitos de PAM. Por lo tanto, al integrar varios sistemas de CRISPR-Cas en nuestra caja de herramientas de ingeniería, podemos ampliar la gama de sitios que pueden ser objeto de un genoma. Además, una enzima natural de la Cas puede ser diseñado o evolucionado para reconocer secuencias de PAM alternativas, ampliando aún más el alcance de objetivos genómicas accesibles a la manipulación18,19,20.
Aunque varios sistemas CRISPR-Cas están disponibles para propósitos de ingeniería del genoma, la mayoría de usuarios de la tecnología ha dependido principalmente la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) por múltiples razones. En primer lugar, requiere un PAM relativamente simplemente NGG, a diferencia de muchas otras proteínas de Cas que pueden unirse sólo en presencia de PAM más compleja. En segundo lugar, es la primera endonucleasa de Cas a ser implementado con éxito en células humanas21,22,23,24. En tercer lugar, SpCas9 es la enzima mejor caracterizada hasta la fecha. Si un investigador desea utilizar otro nucleasa de Cas, él o ella a menudo sería confusa acerca de la mejor manera de diseñar el experimento y así otras enzimas llevará a cabo en diferentes contextos biológicos comparados con SpCas9.
Para dar claridad al desempeño relativo de los diferentes sistemas de CRISPR-Cas, recientemente hemos realizado una comparación sistemática de cinco endonucleases de Cas-SpCas9, la enzima Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9), la enzima Cas9 de Meningitidis de la Neisseria (NmCas9), la enzima Cas12a de Acidaminococcus SP. BV3L6 (AsCas12a) y la enzima Cas12a de Lachnospiraceae bacteria ND2006 (LbCas12a)25. Para una comparación justa, se evaluaron las diversas nucleasas Cas mediante el mismo conjunto de sitios de destino y otras condiciones experimentales. Los parámetros de diseño del estudio también delineado para cada sistema CRISPR-Cas, que serviría como una referencia útil para los usuarios de la tecnología. Aquí, mejor permiten a los investigadores a hacer uso de la Cas CRISPR sistema, proporcionamos un protocolo paso a paso para la ingeniería del genoma óptima con los distintos enzimas Cas9 y Cas12a (ver figura 1). El Protocolo no sólo incluye detalles experimentales pero también importantes consideraciones para maximizar la probabilidad de un resultado de ingeniería exitosa del genoma en células de mamíferos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> Figura 1 : Una visión general del flujo de trabajo para generar el genoma editado líneas celulares humanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

El sistema regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) Cluster funciona naturalmente en bacteria inmunidad adaptativa, pero ha sido repurposed con éxito para la ingeniería del genoma de muchos organismos vivos diferentes. Comúnmente, el wildtype CRISPR asociados 9 (Cas9) o endonucleasa de Cas12a se utiliza para unirse a sitios específicos en el genoma, después de que la rotura de doble hebra de ADN se repara mediante la no homóloga se terminan uniendo (NHEJ) camino o la reparación dirigida de homología ( Camino HDR) dependiendo de si es una plantilla de donantes ausente o presente respectivamente. Hasta la fecha, sistemas CRISPR de diferentes especies bacterianas han demostrado ser capaces de realizar la edición del genoma en células de mamíferos. Sin embargo, a pesar de la aparente simplicidad de la tecnología, varios parámetros de diseño necesitan ser considerados, que a menudo dejan perplejos sobre la forma mejor para llevar a cabo su genoma experimentos de edición de usuarios. Aquí, describimos un completo flujo de trabajo de diseño experimental para identificación de clones de células que llevan a modificaciones de ADN deseados, con el objetivo de facilitar la ejecución exitosa del genoma edición experimentos en líneas celulares mamíferos. Destacamos consideraciones clave para los usuarios a tomar nota, incluyendo la elección del sistema CRISPR, la longitud del espaciador y el diseño de una plantilla de donantes oligodeoxynucleotide monocatenario (ssODN). Imaginamos que este flujo de trabajo será útil para estudios gene knockout, modelado de esfuerzos, la enfermedad o líneas celulares de la generación del reportero.

Para llevar a cabo un genoma edición experimento, un plásmido CRISPR expresando un sgRNA dirigidas al que locus de interés necesita ser clonado. En primer lugar, el plásmido se digiere con una enzima de restricción (típicamente un tipo de enzima de IIs) para alinearlo. Se recomienda resolver el producto digerido en un gel de agarosa al 1% junto a un plásmido no digerida para distinguir entre una digestión completa y parcial. Como los plásmidos digeridos son superenrollados, tienden a correr más rápido que sus ...

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Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

CRISPR-Cas es una tecnología de gran alcance para los complejos genomas de plantas y animales. Aquí detallamos un protocolo eficiente editar el genoma humano utilizando diferentes endonucleasas de Cas. Se destacan importantes consideraciones y parámetros de diseño para optimizar la eficiencia de la edición.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Este protocolo utiliza CRISPR-Cas9 para crear líneas knock-out o knock-in. La principal ventaja de esta técnica es que es simple y eficiente seguir especialmente para los investigadores principiantes. Para el passaging celular, trate las células cultivadas durante la noche con dos mililitros de 0.25%trypsin EDTA por placa a 37 grados Celsius durante dos minutos.Cuando las células se hayan levantado de los fondos de las placas, neutralice la reacción enzimática con dos mililitros de medio de cultivo celular y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico. Recoger las células por centrifugación y resuspender el pellet en cinco mililitros de medio de cultivo celular fresco para el conteo. Luego sembra 1.8 veces 10 a las quintas células en un pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos para el cultivo nocturno a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono.Para la transfección de las células, añadir un volumen adecuado de mezcla de transfección que contenga la concentración adecuada de plásmido CRISPR al volumen adecuado de reactivo de transfección, de acuerdo con el diseño experimental y las instrucciones del fabricante. Después de incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante el período de tiempo recomendado, agregue la solución a las células de una manera a gota. A continuación, gire suavemente la placa para mezclar y colocar la placa en una incubadora humidificada de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Al final de la transfección, añadir 150 microlitros de trippsina-EDTA para disociar las células como acaba de demostrar y recoger las células separadas por centrifugación. Resuspender el pellet en suero bovino 2%fetal en PBS y filtrar las células a través de un colador de malla de 30 micrómetros en una clasificación celular activada por fluorescencia de cinco mililitros, o tubo FACS. A continuación, utilice las células no trans infectadas para establecer una puerta de control negativa en el citómetro de flujo y clasificar las células trans infectadas de acuerdo con el marcador fluorescente en el plásmido CRISPR utilizado para la transfección en un tubo que contiene 100 microlitros del medio de cultivo celular.Cuando se hayan recogido todas las células trans infectadas, pelete las células por centrifugación a máxima velocidad y resusppend el pellet en 300 microlitros del medio de cultivo celular. Siembra 200 microlitros de células en un pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos y permite que las células se recuperen durante unos días en una incubadora de 37 grados Celsius. Peleci con los 100 microlitros restantes de células clasificados a velocidad máxima durante cinco minutos y extraiga el ADN genómico del pellet resultante de acuerdo con los protocolos estándar de extracción de ADN.A continuación, añada 10 microlitros de tampón de reacción en cadena de polimerasa, un microlitro de mezcla de desoxinucleótido, 2,5 microlitros de imprimación inversa definida por el usuario, 0,5 microlitros de ADN polimerasa, dos a cinco microlitros de la plantilla de ADN genómico extraído y suficiente agua destilada doble para llevar la reacción a un volumen final de 50 microlitros. Ejecute la mezcla en un ciclor térmico y resuelva la reacción en un gel de 2% de agarosa utilizando un tampón 1X TAE de acuerdo con los protocolos estándar. Utilice un bisturí limpio y afilado para extirpar el producto de reacción de la cadena de polimerasa y purificar el ADN utilizando un kit de extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Mida la concentración del producto utilizando un espectrofotómetro a una absorbancia de 260 nanómetros. Preparar una mezcla de ensayo que contenga 200 nanogramos del ADN aislado, dos microlitros de T7 endonucleasa I tampón de reacción, y suficiente agua doble destilada para llevar el volumen final de la mezcla a 19 microlitros. Reanneal el producto de reacción en cadena de la polimerasa en un ciclor térmico a los parámetros indicados y mezclar cinco unidades de T7 endonucleasa I con el producto reannealed para una incubación de 50 minutos a 37 grados centígrados.Al final de la incubación, resuelva el ADN digerido en un gel de 2,5% de agarosa usando un tampón 1X TAE, e imagine el gel en un sistema de imágenes de gel adecuado. Abra la imagen de gel en ImageJ y dibuje una caja rectangular alrededor de la banda lo más cerca posible de su límite. Haga clic en Analizar y Establecer medidas, confirmando que las opciones de área, valor gris medio y densidad integrada están activadas.Haga clic en Aceptar y seleccione Analizar y Medir. La media, o el valor de densidad de intensidad bruta, es indicativo de la intensidad de la banda. Cuando las células trans infectadas de cultivo comienzan a ser confluentes, desprende con tripina-EDTA, como se ha demostrado, y sembrar las células escasamente en un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros para permitir que crezca suficiente espacio para que las colonias individuales crezcan antes de devolver las células a la incubadora de cultivo celular.Cuando las colonias comiencen a formarse, utilice un microscopio con un aumento de cuatro X para recoger las colonias individuales para transferirse a pozos individuales de una placa de 24 pozos que contiene 500 microlitros de medio de cultivo celular por pozo. Tenga cuidado de que su punta no toque las colonias circundantes para evitar la mezcla de colonias dentro de pozos individuales o elegir entre un área de crecimiento de colonias escasas. Cuando todos los clones hayan sido seleccionados, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular hasta que los cultivos se vuelvan confluentes.Como los plásmidos no digeridos están super-enrollados, tienden a funcionar más rápido que sus contrapartes linealizadas. Para determinar si los oligonucleótidos se han clonado con éxito en la columna vertebral del plásmido CRISPR, se realiza la pcR de la colonia y se inoculan los clones positivos antes de que los plásmidos se extraigan y se envíen para la secuenciación de Sanger. La señal fluorescente se puede visualizar fácilmente bajo un microscopio tras una entrega exitosa de los plásmidos, lo que permite ordenar las células trans infectadas por citometría de flujo.Se realiza un ensayo de endonucleasa T7 I para comprobar la eficiencia del escote del ADN genómico, calculado a partir de las intensidades de las bandas observadas en un gel de agarosa. Además, si un experimento basado en la reparación dirigido por la homología está diseñado para incorporar un sitio de restricción en el locus objetivo, se puede realizar un ensayo de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción con una enzima de restricción correspondiente. Para validar aún más que un gen de codificación de proteínas se ha inactivado con éxito, se puede llevar a cabo una mancha occidental para garantizar que no haya ninguna proteína dirigida.La clasificación de las células después de la transfección elimina las células sin plásmidos incorporados, aumentando así el porcentaje de células examinadas en etapas posteriores como que tienen un gen eliminatoria o knock-in. Con el desarrollo de esta técnica, ahora somos capaces de producir líneas celulares knock-out para estudiar la función génica y llamar a las líneas celulares para modelar enfermedades específicas para entender su mecanismo.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinación de todo el genoma de los mamíferos sincronización de replicación de ADN por medición del contenido

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Investigación

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

Disección de la función del reforzador mediante Multiplex basados en CRISPR potenciador de interferencia en líneas celulares

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Edición del genoma mediada por CRISPR el hongo patógeno Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

Transformando, Edición del Genoma y Fenotipando el árbol tropical de cannabaceae de fijación de nitrógeno Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

Identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

Edición del genoma mediado por CRISPR-Cas9 en el Ascomicete Filamentoso Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...