Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

M.H.T. stöds av en byrå för vetenskap, teknologi och forsknings gemensamma rådet Office grant (1431AFG103), en National Medical Research Council bevilja (OFIRG-0017-2016), National Research Foundation bidrag (NRF2013-THE001-046 och NRF2013-THE001-093), en Ministeriet för utbildning Tier 1 grant (RG50/17 (S)), en start bevilja från Nanyang Technological University, och medel för internationella genetiskt Engineering maskin (iGEM) konkurrensen från Nanyang Technological University.

1. design av sgRNAs
<ol><li>Välj ett lämpligt CRISPR-Cas system.<ol>
<li>Först inspektera målregionen för PAM sekvenser av alla Cas9 och Cas12a nukleaser som har visat sig vara funktionell i däggdjursceller16,21-32. Fem vanliga enzymer ges i tabell 1 tillsammans med deras respektive PAMs. Obs: förutom endonucleases som anges i tabell 1, det finns andra mindre vanliga Cas-enzymer som framgångsrikt har distribuerats i däggdjursceller samt, såsom en Cas9 nuclease f...

CRISPR-Cas systemet är en kraftfull, revolutionerande teknik till ingenjör i arvsmassan och transcriptomes av växter och djur. Många bakteriearter har befunnits innehålla CRISPR-Cas system, som kan potentiellt anpassas för genomet och transkriptom engineering ändamål44. Även om den Cas9 Amiiiiin från Streptococcus pyogenes (SpCas9) var det första enzymet distribueras framgångsrikt i mänskliga celler21,22,<s...

Förmågan att ingenjör genomet hos någon levande organism har många biomedicinska och biotekniska tillämpningar, såsom korrigering av sjukdomsframkallande mutationer, byggandet av korrekt cellular-modeller för sjukdom studier eller generation av jordbruks grödor med önskvärda egenskaper. Sedan vänden av århundradet, olika tekniker har utvecklats för genomet engineering i däggdjursceller inklusive meganucleases1,2,3, zink finger nukleotider4,5, eller transkription aktivator-liknande effektor nukleaser (TALENs)6,7,8,9. Dessa tidigare tekniker är dock svår att program och tråkiga att montera, därmed hämmar deras utbredd användning i forskning och industrin.
Under de senaste åren, den klustrade mellanliggande regelbundet kort palindromic repetitioner (CRISPR) - CRISPR-associerade (Cas) system har vuxit fram som en kraftfull ny genome engineering technology10,11. Ursprungligen en adaptiva immunsystemet i bakterier, det har varit framgångsrikt distribuerat för genomet ändring i växter och djur, inklusive människor. En primär anledning varför CRISPR-Cas har fått så mycket popularitet på så kort tid är det elementet som ger den viktiga Cas Amiiiiin, såsom Cas9 eller Cas12a (även känd som Cpf1), på rätt plats i genomet är bara en kort bit av chimära enda guide RN En (sgRNA), som är enkla att design och billigt att syntetisera. Efter rekryteras till målwebbplatsen, Cas enzymet fungerar som ett par molekylära saxar och klyver bundna DNA med dess RuvC, HNH eller Nuc domäner12,13,14. Den resulterande dubbel strandsatta pausen (DSB) repareras därefter av cellerna via antingen icke-homolog slutet att gå (NHEJ) eller homologi-regisserad reparation (HDR) väg. I avsaknad av en reparation mall repareras DSB av felbenägna NHEJ vägen, som kan ge upphov till pseudo-slumpmässiga infogning eller borttagning av nukleotider (indels) på webbplatsen skurna, potentiellt orsaka frameshift mutationer i proteinet-kodande gener. Dock i närvaro av en givare-mall som innehåller DNA ändringarna, repareras DSB av HiFi HDR smittvägen. Vanliga typer av givare mallar inkluderar enkelsträngat oligonukleotider (ssODNs) och plasmider. Förstnämnda används vanligtvis om de avsedda DNA-förändringarna är små (exempelvis ändring av ett enda baspar), medan den senare används vanligtvis om man vill infoga en relativt lång sekvens (exempelvis den kodande sekvensen av ett grönt fluorescerande protein eller GFP) i det mål locus.
Amiiiiin aktiviteten av proteinet Cas kräver närvaro av en protospacer intill motiv (PAM) på mål plats15. Den PAM av Cas9 är slutet 3' av protospacer, medan den PAM av Cas12a (även kallad Cpf1) är på 5' avsluta istället16. Cas-guiden RNA komplex är inte att införa en DSB om PAM är frånvarande17. PAM förlägger därför en begränsning på de genomiska platser där en viss Cas nuclease kunna klyva. Lyckligtvis, Cas nukleaser från olika bakteriearter uppvisar vanligtvis olika PAM krav. Därav, genom att integrera olika CRISPR-Cas system i våra engineering verktygslådan, kan vi öka utbudet av platser som kan riktas i en genomet. Dessutom kan en naturlig Cas-enzym vara konstruerad eller utvecklats för att identifiera alternativa PAM sekvenser, ytterligare utvidgning av genomisk mål nås till manipulation18,19,20.
Även om flera CRISPR-Cas system finns tillgängliga för genomet engineering ändamål, har de flesta användare av tekniken åberopat huvudsakligen den Cas9 nuclease från Streptococcus pyogenes (SpCas9) av flera skäl. Först, det kräver en förhållandevis enkelt NGG PAM, till skillnad från många andra Cas proteiner som kan bara klyva i närvaro av mer komplexa PAMs. Det andra är den första Cas Amiiiiin distribueras framgångsrikt i mänskliga celler21,22,23,24. Tredje är SpCas9 överlägset bäst kännetecknas enzymet hittills. Om en forskare vill använda en annan Cas nuclease, skulle han eller hon ofta vara oklart om hur man bäst att utforma experimentet och hur väl andra enzymer utför i olika biologiska sammanhang jämfört med SpCas9.
För att ge klarhet till relativa prestanda för olika CRISPR-Cas system, har vi nyligen utfört en systematisk jämförelse av fem Cas endonucleases – SpCas9, enzymet Cas9 från Staphylococcus aureus (SaCas9), enzymet Cas9 från Neisseria meningitidis (NmCas9), det Cas12a enzymet från Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) och enzymet Cas12a från Lachnospiraceae bakterien ND2006 (LbCas12a)25. För en rättvis jämförelse utvärderat vi de olika Cas nukleaser använder samma uppsättning mål platser och andra försöksbetingelser. Studien avgränsas också design parametrar för varje CRISPR-Cas-systemet, som skulle tjäna som en användbar referens för användare av tekniken. Här, att bättre möjliggöra forskare att använda CRISPR-Cas system, vi tillhandahåller en stegvisa protokoll för optimal genomet engineering med olika Cas9 och Cas12a-enzymer (se figur 1). Protokollet omfattar inte endast experimentella Detaljer men också viktiga designhänsyn att maximera sannolikheten för en framgångsrik genomet engineering resultatet i däggdjursceller.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> Figur 1 : En översikt av arbetsflödet att generera genomet redigeras mänskliga cellinjer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

Klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) systemet fungerar naturligt i bakteriell adaptiv immunitet, men har varit framgångsrikt repurposed för genomet engineering i många olika levande organismer. Vanligast, vildtyp CRISPR associerade 9 (Cas9) eller Cas12a Amiiiiin används för att klyva specifika platser i genomet, varefter rasten dubbelsträngat DNA repareras via icke-homolog slutet att gå (NHEJ) väg eller på homologi-regisserad reparation ( HDR) väg beroende på om en givare mall är frånvarande eller presentera respektive. Hittills har har CRISPR system från olika bakteriearter visat sig kunna utföra gen editering i däggdjursceller. Men trots den skenbara enkelheten av teknik måste flera design parametrar övervägas, som ofta lämnar användare villrådig om hur bäst för att utföra sin arvsmassa redigering experiment. Här beskriver vi ett komplett arbetsflöde från experimentell design till identifiering av cell kloner som bär önskat DNA ändringar, med målet att underlätta framgångsrika genomförandet av genomet redigering experiment i däggdjursceller linjer. Vi belysa viktiga överväganden för användare att ta del av, inklusive valet av CRISPR system, spacer längden och utformningen av en mall för givare av enkelsträngat oligodeoxynucleotide (ssODN). Vi föreställer oss att det här arbetsflödet kommer att vara användbart för genen knockout studier, sjukdom modellering ansträngningar, eller generering av reporter cellinjer.

Att utföra en genomet redigering experiment, en CRISPR plasmid uttrycker en sgRNA inriktning i locus-of-intresse behöver klonas. Först rötas plasmiden med ett restriktionsenzym (vanligtvis en typ IIs enzym) till linjär det. Det rekommenderas att lösa den smälta produkten på en 1% agarosgel tillsammans med en osmält plasmiden att skilja mellan en fullständig och partiell matsmältning. Osmält plasmider är supercoiled, tenderar de att köra snabbare än motsvarigheterna linearized (se figur...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genomet redigering i däggdjur cellinjer med CRISPR-Cas

CRISPR-Cas är en kraftfull teknik för att konstruera komplexa genomen hos växter och djur. Här, detalj vi ett protokoll för att effektivt redigera det mänskliga genomet som använder olika Cas endonucleases. Vi belysa viktiga överväganden och konstruktionsparametrar att optimera redigering effektivitet.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Det här protokollet använder CRISPR-Cas9 för att skapa knock-out- eller knock-in-linjer. Den största fördelen med denna teknik är att det är enkelt och effektivt att följa särskilt för nybörjare forskare. För cellpassning, behandla över natten odlade celler med två milliliter på 0,25%trypsin EDTA per platta vid 37 grader Celsius i två minuter.När cellerna har lyft från plattan bottnar, neutralisera den enzymatiska reaktionen med två milliliter av cellodling medium, och överföra cellen suspensionen till ett koniskt rör. Samla in cellerna genom centrifugering och resuspend pelleten i fem milliliter av färskt cellodlingsmedium för räkning. Sedan utsäde 1,8 gånger 10 till de femte cellerna i en brunn av en 24-brunn vävnad kultur tallrik för natten kultur på 37 grader Celsius och 5% koldioxid.För transfektion av cellerna, tillsätt en lämplig volym transfection mix som innehåller lämplig koncentration av CRISPR plasmid till lämplig volym transfection-reagens, enligt den experimentella konstruktionen och tillverkarens anvisningar. Efter inkuberingen av transfektionsblandningen i rumstemperatur under den rekommenderade tidsperioden, tillsätt lösningen till cellerna på ett droppvist sätt. Sedan snurra försiktigt plattan för att blanda och placera plattan i en befuktad 37 grader Celsius inkubator med 5%koldioxid.I slutet av transfection, tillsätt 150 mikroliter av trypsin-EDTA att dissociate cellerna som bara visat och samla de fristående cellerna genom centrifugeringen. Resuspend pelleten i 2%fetala nötkreatur serum i PBS och filtrera cellerna genom en 30 mikrometer maska sil i en fem milliliter fluorescens-aktiverad cell sortering, eller FACS rör. Använd sedan de icke-transfekterade cellerna för att ställa in en negativ kontrollgrind på flödescytometern och sortera de transfekterade cellerna enligt fluorescerande markören på CRISPR-plasmiden som används för transfektionen till ett rör som innehåller 100 mikroliter av cellodlingsmedium.När alla transfekterade celler har samlats in, pellet cellerna genom centrifugeringen vid maximal hastighet och resuspend pelleten i 300 mikroliter av cellodling medium. Frö 200 mikroliter av celler i en brunn av en 24-brunn vävnad kultur tallrik och låta cellerna att återhämta sig för ett par dagar i en 37 grader Celsius inkubator. Pellet de återstående 100 mikroliter av sorterade celler vid maximal hastighet i fem minuter och extrahera arvsmassans DNA från den resulterande pelleten enligt vanliga DNA-extraktionsprotokoll.Därefter lägger du till 10 mikroliter av polymeraskedjereaktionsbuffert, en mikroliter av deoxynucleotide mix, 2,5 mikroliter av användardefinierade omvänd primer, 0,5 mikroliter av DNA-polymeras, två till fem mikroliter av den extraherade genomiska DNA-mallen och tillräckligt med dubbeldestillerat vatten för att få reaktionen på en slutlig volym på 50 mikroliter. Kör blandningen på en termisk cycler och lös reaktionen på en 2%agarosgel med hjälp av 1X TAE buffert enligt standardprotokoll. Använd en ren, skarp skalpell för att punktskatter polymeras kedjan reagera produkt och rena DNA med hjälp av en gel extraktion kit enligt tillverkarens instruktioner.Mät produktens koncentration med hjälp av en spektrofotometer vid 260 nanometerabsorbans. Förbered en analys mix som innehåller 200 nanogram av den isolerade DNA, två mikroliter av T7 endonuclease I reaktion buffert, och tillräckligt dubbeldestillerat vatten för att få den slutliga volymen av blandningen till 19 mikroliter. Reanneal polymeras kedjereaktion produkt i en termisk cycler vid de angivna parametrarna och blanda fem enheter av T7 endonuclease I med reannealed produkten för en 50 minuters inkubation vid 37 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen, lös det smälta DNA på en 2,5%agarosgel med hjälp av 1X TAE buffert, och bild gelen på en lämplig gel avbildningssystem. Öppna gelbilden i ImageJ och rita en rektangulär ruta runt bandet så nära dess gräns som möjligt. Klicka på Analysera och Ange mått, vilket bekräftar att området, medelvärdet av grått värde och alternativen för integrerad densitet kontrolleras.Klicka på OK och välj Analysera och Mät. Medelvärdet, eller råintensitetstäthetsvärdet, är ett tecken på bandintensiteten. När de kulturtransfekterade cellerna börjar bli konfluenta, lossa dem med trypsin-EDTA, som visats, och utsäde cellerna glest i en 100 millimeter vävnad kultur skålen för att ge tillräckligt utrymme för enskilda kolonier att växa innan de återvänder cellerna till cellkulturen inkubatorn.När kolonierna börjar bildas, använd ett mikroskop med en fyra X förstoring för att plocka de enskilda kolonierna för överföring till enskilda brunnar av en 24-brunnsplatta som innehåller 500 mikroliter av cellodlingsmedium per brunn. Var försiktig så att ditt tips inte vidrör de omgivande kolonierna för att förhindra blandning av kolonier inom enskilda brunnar eller plocka från ett område med gles kolonitillväxt. När alla kloner har plockats, placera plattan i cellkulturen inkubatorn tills kulturerna blir konfluenta.Som osmält plasmider är super-coiled, tenderar de att köra snabbare än sina linjäriserade motsvarigheter. För att avgöra om oligonukleotider har framgångsrikt klonats in i CRISPR plasmid ryggraden, koloni PCR utförs och de positiva klonerna inokuleras innan plasmiderna extraheras och skickas för Sanger sekvensering. Den fluorescerande signalen kan lätt visualiseras under ett mikroskop vid en lyckad leverans av plasmiderna, vilket gör att de transfekterade cellerna kan sorteras efter flödescytometri.En T7 endonuclease I-analys utförs för att kontrollera klyvningseffektiviteten hos det genomiska DNA, enligt beräknat från intensiteterna hos de band som observerats på en agarosgel. Dessutom, om en homology-riktade reparation-baserade experiment är utformad för att införliva en begränsning webbplats vid målet locus, en begränsning fragment längd polymorfism analys kan utföras med en motsvarande begränsning enzym. För att ytterligare validera att en proteinkodande gen framgångsrikt har inaktiverats kan en western blot utföras för att säkerställa att inget riktat protein finns.Sortering av cellerna efter transfektion eliminerar cellerna utan införlivade plasmider, vilket ökar andelen celler som screenas i senare skeden som har en knock-out eller knock-in gen. Med utvecklingen av denna teknik kan vi nu producera knock-out cellinjer för att studera genfunktion och knock-in cellinjer för att modellera specifika sjukdomar för att förstå deras mekanism.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Genomvid Fastställande av däggdjur Replication Timing av DNA-innehåll Mätning

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Kromatinimmunutfällning (ChIP) i mus-T-celllinjer

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Förbättrad genomet redigering med Cas9 ribonukleoprotein i olika celler och organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

Dissektion av Enhancer-funktion som använder Multiplex CRISPR-baserade Enhancer störningar i cellinjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

CRISPR-medierad gen editering av den mänskliga svamp patogener Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

Transformering, genom-redigering och fenotypning av kvävefixerande tropiska Cannabaceae träd Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

Cell Surface Receptor Identification Med hjälp av genomskala CRISPR/Cas9 Genetiska skärmar

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Introduktion av punktmutationer i mänskliga pluripotenta stamceller med sömlös genomredigering

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-Medierad genomredigering i den fintrådiga Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...