Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

M.H.T. bir ajans için bilim teknoloji ve araştırma'nın ortak Konseyi Office grant (1431AFG103) tarafından desteklenmektedir, Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi grant (OFIRG/0017/2016), Ulusal Araştırma Vakfı Hibe (NRF2013-THE001-046 ve NRF2013-THE001-093), bir Bakanlığı Eğitim Tier 1 verme (RG50/17 (S)), bir başlangıç Nanyang Teknoloji Üniversitesi ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi Uluslararası genetik mühendislik makine (IGEM) rekabet için para verin.

1. tasarım sgRNAs
<ol><li>Uygun bir CRISPR-Cas sistemi seçin.<ol>
<li>İlk olarak, hedef bölge içinde memeli hücreleri16,21-32işlevsel olması için gösterilen tüm Cas9 ve Cas12a enzimler PAM dizisi için kontrol edin. Beş sık kullanılan enzimler Tablo 1 onların anılan sıraya göre PAMs birlikte verilmiştir. Not: yanında endonucleases Tablo 1' de listelenen, Streptococcus thermophilus (St1Cas9) üzerinden Cas9 nükleaz gibi memeli hücrelerinde de...

CRISPR-Cas sistemi genleri ve transcriptomes bitki ve hayvan Mühendisi için güçlü, devrimci bir teknolojidir. Çok sayıda bakteri türlerinin potansiyel olarak genom ve transcriptome amacıyla44mühendislik için adapte olabilir CRISPR-Cas sistemleri içeren tespit edilmiştir. Cas9 endonükleaz Streptococcus pyogenes (SpCas9) üzerinden diğer bakteriyel gelen enzimler insan hücreleri21,22,23</...

Hastalığa neden olan düzeltilmesi gibi birçok Biyomedikal ve Biyoteknolojik uygulamaları herhangi bir canlı organizma genom mühendis yeteneğine sahiptir mutasyonlar, hastalık çalışmalar için doğru hücresel modelleri inşaatı veya, tarımsal üretimi arzu edilen özellikleri ile bitkileri. Yüzyılın beri genom Mühendisliği dahil meganucleases1,2,3memeli hücrelerinde için çeşitli teknolojiler geliştirilmiştir, parmak nükleaz4,5, çinko veya Transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs)6,7,8,9. Ancak, bu önceki böylece onların yaygınlaşmasının araştırma ve endüstrisi engelleyici programı için zor ya da sıkıcı bir araya getirmek teknolojilerdir.
Son yıllarda, kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik yineler (CRISPR) interspaced - CRISPR-ilişkili (Cas) sistem teknoloji10,11mühendislik güçlü yeni genom ortaya çıkmıştır. Aslında bir adaptif bağışıklık sisteminde bakteri, başarıyla oldu genom değişiklik bitkiler ve hayvanlar, insanlar da dahil olmak üzere dağıtılmış. Neden CRISPR-Cas kısa bir sürede çok popülerlik kazanmıştır bir temel nedeni bu Cas9 veya Cas12a (Ayrıca Cpf1 da bilinir) gibi anahtar Cas endonükleaz getiriyor öğe, genom doğru konuma chimeric tek Kılavuzu RN sadece kısa bir parçası (SgRNA), bir tasarım için basit ve ucuz sentezlemek. Hedef siteye işe ediliyor sonra CA'ları enzim moleküler makas çifti olarak işlev görür ve onun RuvC, HNH veya Nuc etki alanları12,13,14ile ilişkili DNA cleaves. Elde edilen çift telli sonu (DSB) daha sonra homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma veya homoloji yönetmen onarım (HDR) yolu ile hücreleri tarafından onarıldı. Onarım şablon yokluğunda, DSB potansiyel olarak protein kodlayıcı genlerin frameshift mutasyonlar neden çıkmasına neden takma ad-rasgele ekleme veya silmek-in nükleotit (indels) kesim yerinde olabilir, hataya NHEJ yolu tarafından onarıldı. Ancak, istediğiniz DNA değişiklikleri içeren bir donör şablonu huzurunda DSB yüksek sadakat HDR yolu tarafından onarıldı. Donör şablonları sık karşılaşılan tek iplikçikli oligonucleotides (ssODNs) ve plazmid bulunmaktadır. Eğer bir nispeten uzun bir sıra eklemek dilek ikinci genellikle kullanılırken dilediğiniz DNA değişiklikleri (örneğin, tek bir baz çifti İLETİMLERİNİZE), küçük eski genellikle kullanılır (örneğin, bir yeşil flüoresan protein kodlama dizisi veya GFP) hedef locus içine.
CA'ları protein endonükleaz Etkinlik hedef site15bir protospacer bitişik motifi (PAM) olmasını gerektirir. (Cpf1 olarak da bilinir) Cas12a PAM 5' sonunda bunun yerine olmakla Cas9 PAM163' sonunda protospacer olduğunu. Cas-Kılavuzu RNA karmaşık PAM17ise bir DSB tanıtmak değiştiremiyor. Bu nedenle, PAM belirli bir Cas nükleaz ayırmak mümkün nerede genomik Mekanlar üzerinde bir kısıtlama yerleştirir. Neyse ki, Cas enzimler farklı bakteri türleri üzerinden genellikle farklı PAM gereksinimleri sergi. Bu nedenle, çeşitli CRISPR-Cas sistemleri mühendislik bizim alet entegre ederek, bir genom hedefleyebilir siteleri aralığını genişletebilirsiniz. Ayrıca, doğal bir Cas enzim mühendislik veya daha fazla genomik hedefleri manipülasyon18,19,20' ye erişilebilir kapsamını genişletme alternatif PAM dizileri tanımasını gelişti.
Teknolojisi çoğu kullanıcı için birden çok nedeni birden çok CRISPR-Cas sistemi genom mühendislik amaçları için kullanılabilir olmakla birlikte, ağırlıklı olarak Cas9 nükleaz Streptococcus pyogenes (SpCas9) üzerinden yararlanmıştır. Birincisi, bir nispeten sade bir şekilde NGG PAM, aksine sadece varlığında daha karmaşık PAMs bölmek birçok diğer Cas protein gerektirir. İkincisi, bu insan hücreleri21,22,23,24' te başarılı bir şekilde dağıtılması için ilk Cas endonükleaz 's. Üçüncü olarak, SpCas9 bugüne kadar en iyi karakterize enzim gereğidir. Bir araştırmacı başka bir Cas nükleaz kullanmak isterse, o ya da o sık sık tasarım deneme ve nasıl su kuyusu diğer enzimler için SpCas9 göre farklı biyolojik bağlamlarda yapmak için en iyi nasıl hakkında belirsiz olur.
Farklı CRISPR-Cas sistemleri göreli performansını konusunu açıklığa kavuşturmak amacıyla, biz son zamanlarda beş Cas endonucleases – SpCas9, Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzim dan gelen Cas9 enzim sistematik karşılaştırılması gerçekleştirdiyseniz Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzim Acidaminococcus sp. BV3L6 üzerinden (AsCas12a) ve Cas12a enzim (LbCas12a) Lachnospiraceae bakteri ND2006 üzerinden25. Adil bir karşılaştırma için hedef siteleri ve diğer deneysel koşullar aynı kümesini kullanarak çeşitli Cas nükleaz değerlendirildi. Teknoloji kullanıcıları için yararlı bir başvuru olarak hizmet verecek her CRISPR-Cas sistem ayrıca belirlenen çalışma tasarım parametreleri. Burada, daha iyi araştırmacılar CRISPR-CA'larına faydalanmak için etkinleştirme sistemi, biz en iyi genom Mühendisliği (bkz. şekil 1) farklı Cas9 ve Cas12a enzimleri ile için adım adım bir protokol sağlar. Protokol sadece başarılı genom mühendislik sonucu memeli hücrelerinde olasılığını en üst düzeye çıkarmak için de önemli tasarım konuları ama deneysel ayrıntıları içerir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> Resim 1 : İnsan hücre hatları düzenlenmiş genom oluşturmak için iş akışının genel bir bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

Kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) sistem doğal olarak bakteriyel edinilmiş bağışıklık fonksiyonları ama başarılı bir şekilde pek çok farklı canlıların genom mühendisliği için repurposed. En sık wildtype CRISPR 9 (Cas9) ilişkili veya Cas12a endonükleaz sonra homolog olmayan sonunda (NHEJ) yol veya onarım homoloji-yönetmen (katılma yolu ile DNA çift iplikçikli sonu onarılana genom, belirli sitelerde ayırmak için kullanılır Bir donör şablon olmasına bağlı olarak HDR) yolu yok veya sırasıyla mevcut. Bugüne kadar farklı bakteri türleri sistemlerden CRISPR genom memeli hücrelerinde düzenleme gerçekleştirme yeteneğine sahip olması gösterilmiştir. Ancak, teknoloji belirgin basitliğine rağmen birden çok tasarım parametrelerinin değerlendirilmesi, hakkında en iyi deneyler düzenleme onların genom taşımak için çapraşık kullanıcılar sık sık terk gerekir. Burada, tam bir iş akışı deneysel tasarım başarılı memeli hücre hatları deneylerde düzenleme genom yürütülmesini kolaylaştırmak amacı ile istenilen DNA değişiklikleri taşıyan Hücre klonlar tanımlaması için açıklamak. Biz kullanıcıların, dikkat çekmek kritik noktalar CRISPR sistem, rondela uzunluğu ve tek iplikçikli oligodeoxynucleotide (ssODN) donör şablonunun tasarımını seçimi de dahil olmak üzere vurgulayın. Biz bu iş akışı için gen nakavt çalışmaları, çabaları, modelleme hastalığı faydalı olacaktır veya satırları üretimi muhabiri hücre öngörülüyor.

Deney, ilgi odağı klonlanmış gerekiyor hedefleme bir sgRNA ifade CRISPR plazmid düzenleme genom gerçekleştirmek için. İlk olarak, plazmid bir kısıtlama bu linearize için enzim ile (genellikle bir türü IIS enzim) sindirilir. Bu % 1'özel jel ile birlikte komple ve Parsiyel sindirim arasında ayırt etmek için sindirilmemiş bir plazmid sindirilir ürünü gidermek için tavsiye edilir. Sindirilmemiş plazmid supercoiled olduğu gibi onlar doğrusallaştırılmış karşılıkları (bkz: <strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Bu protokol, knock-out veya knock-in hatları oluşturmak için CRISPR-Cas9 kullanır. Bu tekniğin en büyük avantajı, özellikle acemi araştırmacılar için takip etmek basit ve verimli olmasıdır. Hücre geçişi için, iki dakika boyunca 37 santigrat derece plaka başına% 0,25 tripsin EDTA iki mililitre ile gece kültürlü hücreleri tedavi.Hücreler plaka diplerinden kalktığında, enzimatik reaksiyonu iki mililitre hücre kültürü ortamıyla nötralize edin ve hücre süspansiyonuna konik bir tüpe aktarın. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve sayma için taze hücre kültürü orta beş mililitre pelet resuspend. Sonra tohum 1.8 kez 10 beşinci hücrelere bir kuyu içine 24-iyi doku kültürü plaka bir gecede kültür için 37 derece santigrat ve% 5 karbondioksit.Hücrelerin transfeksiyonu için, deneysel tasarım aveğine ve imalatçının talimatlarına uygun olarak, uygun transfeksiyon reaktifi hacmine CRISPR plazmid konsantrasyonu içeren uygun bir transfeksiyon karışımı hacmi ekleyin. Transfeksiyon karışımını önerilen süre boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yattıktan sonra, çözeltiyi hücrelere damla şeklinde ekleyin. Daha sonra yavaşça plakayı karıştırıp %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş 37 derece lik bir inkübatöre yerleştirin.Transfeksiyon sonunda, sadece gösterildiği gibi hücreleri ayırmak ve santrifüj ile müstakil hücreleri toplamak için tripsin-EDTA 150 mikrolitre ekleyin. PBS'deki %2'lik fetal büyükbaş serumdaki peleti yeniden askıya alın ve hücreleri 30 mikrometrelik bir örgü süzgeçten beş mililitrefloresan aktif hücre ayıklama veya FACS tüpüne filtreleyin. Daha sonra akış sitometreüzerinde negatif bir kontrol kapısı ayarlamak ve transfected hücreleri crispr plazmid üzerinde floresan marker göre hücre kültürü orta 100 mikrolitre içeren bir tüp içine transfeksiyon için kullanılan sıralamak için transfected hücreleri kullanın.Transfected hücrelerin tüm toplandığında, maksimum hızda santrifüj ile hücreleri pelet ve hücre kültürü orta 300 mikrolitre pelet resuspend. 24 kuyulu doku kültürü plakasının bir kuyuya 200 mikrolitre hücre tohumve 37 derece lik bir inkübatörde hücrelerin birkaç gün iyileşmesini sağlar. Kalan 100 mikrolitre lik hücreyi maksimum hızda beş dakika boyunca peletleyin ve standart DNA çıkarma protokollerine göre ortaya çıkan peletten genomik DNA ayıklayın.Daha sonra, 10 mikrolitre polimeraz zincir reaksiyonu tamponu, bir mikrolitre deoksinükleotid karışımı, 2,5 mikrolitre kullanıcı tanımlı ters astar, 0,5 mikrolitre DNA polimeraz, 2-5 mikrolitre çıkarılan genomik DNA şablonu ve 50 mikrolitrelik son bir hacme reaksiyon getirmek için yeterli çift distile su ekleyin. Karışımı bir termal döngücüzerinde çalıştırın ve standart protokollere göre 1X TAE tampon kullanarak %2'lik agarose jelüzerindeki reaksiyonu çözün. Polimeraz zinciri reaksiyon ürün çıkarmak ve üreticinin talimatlarına göre bir jel çıkarma kiti kullanarak DNA arındırmak için temiz, keskin bir neşter kullanın.Ürünün konsantrasyonunu 260 nanometre absorbansta bir spektrofotometre kullanarak ölçün. İzole DNA 200 nanogram içeren bir tahlil karışımı hazırlayın, T7 enonukleaz I reaksiyon tampon iki mikrolitre, ve yeterli çift distile su karışımının son hacmi getirmek için 19 mikrolitre. Polimeraz zincir reaksiyonu ürününün belirtilen parametrelerde bir termal döngüde reanneal ve 5 birim T7 enonukleaz I'i 37 santigrat derecede 50 dakikalık bir kuluçka için reannealed ürünle karıştırın.Kuluçka sonunda, 1X TAE tampon kullanarak% 2.5 agarose jel üzerinde sindirilmiş DNA çözmek ve uygun bir jel görüntüleme sistemi üzerinde jel görüntü. ImageJ'deki jel görüntüsünü açın ve bandın etrafına mümkün olduğunca sınırına yakın dikdörtgen bir kutu çizin. Alanın ortalama gri değeri ve tümleşik yoğunluk seçeneklerinin denetlendiğini onaylayan Analiz et ve Ölçümleri Ayarla'yı tıklatın.Tamam'ı tıklatın ve Çözümle ve Ölçü'nü seçin. Ortalama veya ham yoğunluk yoğunluğu değeri, bant yoğunluğunun göstergesidir. Kültüre aktarılan hücreler konfluren olmaya başladıklarında, gösterildiği gibi tripsin-EDTA ile ayırın ve hücreleri 100 milimetrelik doku kültürü yemeğine seyrek olarak yerleştirin ve hücreleri hücre kültürünün kuluçka makinesine geri dönmeden önce tek tek kolonilerin büyümesine olanak sağlar.Koloniler oluşmaya başladığında, her kuyuda 500 mikrolitre hücre kültürü ortamı içeren 24 kuyuluk bir plakanın tek tek kuyularına aktarılmak için tek tek kolonileri seçmek için dört X büyütmeli bir mikroskop kullanın. İpucubireysel kuyular içinde kolonilerin karıştırma önlemek için çevredeki koloniler dokunmaz dikkat edin veya seyrek koloni büyüme bir alanda seçim. Tüm klonlar seçildiğinde, kültürler konca gelene kadar plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Sindirilmemiş plazmidler süper kıvrılmış olduğundan, doğrusallaştırılmış benzerlerinden daha hızlı koşma eğilimindedirler. Oligonükleotidlerin CRISPR plazmid omurgasına başarılı bir şekilde klonlanıp klonlanadığını belirlemek için koloni PCR yapılır ve plazmidler ayıklanıp Sanger dizilimi için gönderilmeden önce pozitif klonlar aşılanır. Floresan sinyal plazmidlerin başarılı bir şekilde teslim edilmesiyle mikroskop altında kolayca görüntülenebilir ve transfected hücrelerin akış sitometrisine göre sıralanmasına izin verir.Bir Agarose jel üzerinde gözlenen bantların yoğunlukları hesaplanır gibi, genomik DNA'nın dekolte verimliliğini kontrol etmek için bir T7 enonukleaz i test yapılır. Ayrıca, homoloji yönelimli onarım tabanlı bir deney hedef lokusbir kısıtlama alanı dahil etmek için tasarlanmıştır, bir kısıtlama parçası uzunluğu polimorfizm tsay ilgili bir kısıtlama enzimi ile yapılabilir. Bir protein kodlama geninin başarıyla inaktive edildiğini doğrulamak için, hedeflenen proteinin bulunmadığından emin olmak için batılı bir leke yapılabilir.Transfeksiyon dan sonra hücrelerin sıralanması plazmidler dahil olmadan hücreleri ortadan kaldırır, daha sonraki aşamalarında bir knock-out veya knock-in gen sahip olarak taranan hücrelerin yüzdesini artırarak. Bu tekniğin geliştirilmesi ile, şimdi onların mekanizmasını anlamak için belirli hastalıkları modellemek için gen fonksiyonu ve knock-in hücre hatları çalışma knock-out hücre hatları üretmek edebiliyoruz.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Candida albicans insan mantar patojen genom düzenleme CRISPR-aracılı

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Dönüşüm, Genom Düzenleme ve Fenotipleme Azot sabitleme Tropikal Cannabaceae Ağaç Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

Filamentöz Ascomycete Huntiella omanensis'te CRISPR-Cas9 Aracılı Genom Düzenleme

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...