Name: genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

M.H.T. bir ajans için bilim teknoloji ve araştırma'nın ortak Konseyi Office grant (1431AFG103) tarafından desteklenmektedir, Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi grant (OFIRG/0017/2016), Ulusal Araştırma Vakfı Hibe (NRF2013-THE001-046 ve NRF2013-THE001-093), bir Bakanlığı Eğitim Tier 1 verme (RG50/17 (S)), bir başlangıç Nanyang Teknoloji Üniversitesi ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi Uluslararası genetik mühendislik makine (IGEM) rekabet için para verin.

1. tasarım sgRNAs
<ol><li>Uygun bir CRISPR-Cas sistemi seçin.<ol>
<li>İlk olarak, hedef bölge içinde memeli hücreleri16,21-32işlevsel olması için gösterilen tüm Cas9 ve Cas12a enzimler PAM dizisi için kontrol edin. Beş sık kullanılan enzimler Tablo 1 onların anılan sıraya göre PAMs birlikte verilmiştir. Not: yanında endonucleases Tablo 1' de listelenen, Streptococcus thermophilus (St1Cas9) üzerinden Cas9 nükleaz gibi memeli hücrelerinde de...

CRISPR-Cas sistemi genleri ve transcriptomes bitki ve hayvan Mühendisi için güçlü, devrimci bir teknolojidir. Çok sayıda bakteri türlerinin potansiyel olarak genom ve transcriptome amacıyla44mühendislik için adapte olabilir CRISPR-Cas sistemleri içeren tespit edilmiştir. Cas9 endonükleaz Streptococcus pyogenes (SpCas9) üzerinden diğer bakteriyel gelen enzimler insan hücreleri21,22,23</...

Hastalığa neden olan düzeltilmesi gibi birçok Biyomedikal ve Biyoteknolojik uygulamaları herhangi bir canlı organizma genom mühendis yeteneğine sahiptir mutasyonlar, hastalık çalışmalar için doğru hücresel modelleri inşaatı veya, tarımsal üretimi arzu edilen özellikleri ile bitkileri. Yüzyılın beri genom Mühendisliği dahil meganucleases1,2,3memeli hücrelerinde için çeşitli teknolojiler geliştirilmiştir, parmak nükleaz4,5, çinko veya Transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs)6,7,8,9. Ancak, bu önceki böylece onların yaygınlaşmasının araştırma ve endüstrisi engelleyici programı için zor ya da sıkıcı bir araya getirmek teknolojilerdir.
Son yıllarda, kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik yineler (CRISPR) interspaced - CRISPR-ilişkili (Cas) sistem teknoloji10,11mühendislik güçlü yeni genom ortaya çıkmıştır. Aslında bir adaptif bağışıklık sisteminde bakteri, başarıyla oldu genom değişiklik bitkiler ve hayvanlar, insanlar da dahil olmak üzere dağıtılmış. Neden CRISPR-Cas kısa bir sürede çok popülerlik kazanmıştır bir temel nedeni bu Cas9 veya Cas12a (Ayrıca Cpf1 da bilinir) gibi anahtar Cas endonükleaz getiriyor öğe, genom doğru konuma chimeric tek Kılavuzu RN sadece kısa bir parçası (SgRNA), bir tasarım için basit ve ucuz sentezlemek. Hedef siteye işe ediliyor sonra CA'ları enzim moleküler makas çifti olarak işlev görür ve onun RuvC, HNH veya Nuc etki alanları12,13,14ile ilişkili DNA cleaves. Elde edilen çift telli sonu (DSB) daha sonra homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma veya homoloji yönetmen onarım (HDR) yolu ile hücreleri tarafından onarıldı. Onarım şablon yokluğunda, DSB potansiyel olarak protein kodlayıcı genlerin frameshift mutasyonlar neden çıkmasına neden takma ad-rasgele ekleme veya silmek-in nükleotit (indels) kesim yerinde olabilir, hataya NHEJ yolu tarafından onarıldı. Ancak, istediğiniz DNA değişiklikleri içeren bir donör şablonu huzurunda DSB yüksek sadakat HDR yolu tarafından onarıldı. Donör şablonları sık karşılaşılan tek iplikçikli oligonucleotides (ssODNs) ve plazmid bulunmaktadır. Eğer bir nispeten uzun bir sıra eklemek dilek ikinci genellikle kullanılırken dilediğiniz DNA değişiklikleri (örneğin, tek bir baz çifti İLETİMLERİNİZE), küçük eski genellikle kullanılır (örneğin, bir yeşil flüoresan protein kodlama dizisi veya GFP) hedef locus içine.
CA'ları protein endonükleaz Etkinlik hedef site15bir protospacer bitişik motifi (PAM) olmasını gerektirir. (Cpf1 olarak da bilinir) Cas12a PAM 5' sonunda bunun yerine olmakla Cas9 PAM163' sonunda protospacer olduğunu. Cas-Kılavuzu RNA karmaşık PAM17ise bir DSB tanıtmak değiştiremiyor. Bu nedenle, PAM belirli bir Cas nükleaz ayırmak mümkün nerede genomik Mekanlar üzerinde bir kısıtlama yerleştirir. Neyse ki, Cas enzimler farklı bakteri türleri üzerinden genellikle farklı PAM gereksinimleri sergi. Bu nedenle, çeşitli CRISPR-Cas sistemleri mühendislik bizim alet entegre ederek, bir genom hedefleyebilir siteleri aralığını genişletebilirsiniz. Ayrıca, doğal bir Cas enzim mühendislik veya daha fazla genomik hedefleri manipülasyon18,19,20' ye erişilebilir kapsamını genişletme alternatif PAM dizileri tanımasını gelişti.
Teknolojisi çoğu kullanıcı için birden çok nedeni birden çok CRISPR-Cas sistemi genom mühendislik amaçları için kullanılabilir olmakla birlikte, ağırlıklı olarak Cas9 nükleaz Streptococcus pyogenes (SpCas9) üzerinden yararlanmıştır. Birincisi, bir nispeten sade bir şekilde NGG PAM, aksine sadece varlığında daha karmaşık PAMs bölmek birçok diğer Cas protein gerektirir. İkincisi, bu insan hücreleri21,22,23,24' te başarılı bir şekilde dağıtılması için ilk Cas endonükleaz 's. Üçüncü olarak, SpCas9 bugüne kadar en iyi karakterize enzim gereğidir. Bir araştırmacı başka bir Cas nükleaz kullanmak isterse, o ya da o sık sık tasarım deneme ve nasıl su kuyusu diğer enzimler için SpCas9 göre farklı biyolojik bağlamlarda yapmak için en iyi nasıl hakkında belirsiz olur.
Farklı CRISPR-Cas sistemleri göreli performansını konusunu açıklığa kavuşturmak amacıyla, biz son zamanlarda beş Cas endonucleases – SpCas9, Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzim dan gelen Cas9 enzim sistematik karşılaştırılması gerçekleştirdiyseniz Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzim Acidaminococcus sp. BV3L6 üzerinden (AsCas12a) ve Cas12a enzim (LbCas12a) Lachnospiraceae bakteri ND2006 üzerinden25. Adil bir karşılaştırma için hedef siteleri ve diğer deneysel koşullar aynı kümesini kullanarak çeşitli Cas nükleaz değerlendirildi. Teknoloji kullanıcıları için yararlı bir başvuru olarak hizmet verecek her CRISPR-Cas sistem ayrıca belirlenen çalışma tasarım parametreleri. Burada, daha iyi araştırmacılar CRISPR-CA'larına faydalanmak için etkinleştirme sistemi, biz en iyi genom Mühendisliği (bkz. şekil 1) farklı Cas9 ve Cas12a enzimleri ile için adım adım bir protokol sağlar. Protokol sadece başarılı genom mühendislik sonucu memeli hücrelerinde olasılığını en üst düzeye çıkarmak için de önemli tasarım konuları ama deneysel ayrıntıları içerir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg"> Resim 1 : İnsan hücre hatları düzenlenmiş genom oluşturmak için iş akışının genel bir bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1424px;" width="1424">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td style="width:175px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201</td>
			<td style="width:688px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3000-50X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BUF-3020-10X4L</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">BsmBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202</td>
			<td>400,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1423</td>
			<td>An alternative to T4 DNA Ligase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">451245</td>
			<td>The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td>Kit for Gibson assembly.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">LB Broth with Agar (Lennox), powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td>Reconstitute in ddH20, and autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:443px;">SOC media</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">REDiant 2X PCR Mastermix</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-5185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Agarose</td>
			<td>1st Base</td>
			<td style="width:119px;">BIO-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>Favorgen</td>
			<td style="width:119px;">FAPDE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">0.25% Trypsin-EDTA, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160</td>
			<td>FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Phosphate Buffered Saline, 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">LUCG-QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ISOLATE II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-52067</td>
			<td>An alternative to QuickExtract</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitor Cocktail, Set3</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:119px;">539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrocellulose membrane, 0.2&#181;m</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine-SDS buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610772</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tris-glycine buffer, 10X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2020</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">TBS, 20X</td>
			<td>1st base</td>
			<td style="width:119px;">BUF-3030</td>
			<td>Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Skim Milk for immunoassay</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">WesternBright Sirius-femtogram HRP</td>
			<td>Advansta</td>
			<td style="width:119px;">K12043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Antibody for &#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-47778</td>
			<td>Lot number: C0916</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">MiSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">61591</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: xCas9 3.7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">108379</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: hCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">41815</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">71814</td>
			<td>Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:119px;">72247</td>
			<td>Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in mammalian cell lines using crispr-cas

Kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) sistem doğal olarak bakteriyel edinilmiş bağışıklık fonksiyonları ama başarılı bir şekilde pek çok farklı canlıların genom mühendisliği için repurposed. En sık wildtype CRISPR 9 (Cas9) ilişkili veya Cas12a endonükleaz sonra homolog olmayan sonunda (NHEJ) yol veya onarım homoloji-yönetmen (katılma yolu ile DNA çift iplikçikli sonu onarılana genom, belirli sitelerde ayırmak için kullanılır Bir donör şablon olmasına bağlı olarak HDR) yolu yok veya sırasıyla mevcut. Bugüne kadar farklı bakteri türleri sistemlerden CRISPR genom memeli hücrelerinde düzenleme gerçekleştirme yeteneğine sahip olması gösterilmiştir. Ancak, teknoloji belirgin basitliğine rağmen birden çok tasarım parametrelerinin değerlendirilmesi, hakkında en iyi deneyler düzenleme onların genom taşımak için çapraşık kullanıcılar sık sık terk gerekir. Burada, tam bir iş akışı deneysel tasarım başarılı memeli hücre hatları deneylerde düzenleme genom yürütülmesini kolaylaştırmak amacı ile istenilen DNA değişiklikleri taşıyan Hücre klonlar tanımlaması için açıklamak. Biz kullanıcıların, dikkat çekmek kritik noktalar CRISPR sistem, rondela uzunluğu ve tek iplikçikli oligodeoxynucleotide (ssODN) donör şablonunun tasarımını seçimi de dahil olmak üzere vurgulayın. Biz bu iş akışı için gen nakavt çalışmaları, çabaları, modelleme hastalığı faydalı olacaktır veya satırları üretimi muhabiri hücre öngörülüyor.

Deney, ilgi odağı klonlanmış gerekiyor hedefleme bir sgRNA ifade CRISPR plazmid düzenleme genom gerçekleştirmek için. İlk olarak, plazmid bir kısıtlama bu linearize için enzim ile (genellikle bir türü IIS enzim) sindirilir. Bu % 1'özel jel ile birlikte komple ve Parsiyel sindirim arasında ayırt etmek için sindirilmemiş bir plazmid sindirilir ürünü gidermek için tavsiye edilir. Sindirilmemiş plazmid supercoiled olduğu gibi onlar doğrusallaştırılmış karşılıkları (bkz: <strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas at JoVE.com

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Bu protokol, knock-out veya knock-in hatları oluşturmak için CRISPR-Cas9 kullanır. Bu tekniğin en büyük avantajı, özellikle acemi araştırmacılar için takip etmek basit ve verimli olmasıdır. Hücre geçişi için, iki dakika boyunca 37 santigrat derece plaka başına% 0,25 tripsin EDTA iki mililitre ile gece kültürlü hücreleri tedavi.Hücreler plaka diplerinden kalktığında, enzimatik reaksiyonu iki mililitre hücre kültürü ortamıyla nötralize edin ve hücre süspansiyonuna konik bir tüpe aktarın. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve sayma için taze hücre kültürü orta beş mililitre pelet resuspend. Sonra tohum 1.8 kez 10 beşinci hücrelere bir kuyu içine 24-iyi doku kültürü plaka bir gecede kültür için 37 derece santigrat ve% 5 karbondioksit.Hücrelerin transfeksiyonu için, deneysel tasarım aveğine ve imalatçının talimatlarına uygun olarak, uygun transfeksiyon reaktifi hacmine CRISPR plazmid konsantrasyonu içeren uygun bir transfeksiyon karışımı hacmi ekleyin. Transfeksiyon karışımını önerilen süre boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yattıktan sonra, çözeltiyi hücrelere damla şeklinde ekleyin. Daha sonra yavaşça plakayı karıştırıp %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş 37 derece lik bir inkübatöre yerleştirin.Transfeksiyon sonunda, sadece gösterildiği gibi hücreleri ayırmak ve santrifüj ile müstakil hücreleri toplamak için tripsin-EDTA 150 mikrolitre ekleyin. PBS'deki %2'lik fetal büyükbaş serumdaki peleti yeniden askıya alın ve hücreleri 30 mikrometrelik bir örgü süzgeçten beş mililitrefloresan aktif hücre ayıklama veya FACS tüpüne filtreleyin. Daha sonra akış sitometreüzerinde negatif bir kontrol kapısı ayarlamak ve transfected hücreleri crispr plazmid üzerinde floresan marker göre hücre kültürü orta 100 mikrolitre içeren bir tüp içine transfeksiyon için kullanılan sıralamak için transfected hücreleri kullanın.Transfected hücrelerin tüm toplandığında, maksimum hızda santrifüj ile hücreleri pelet ve hücre kültürü orta 300 mikrolitre pelet resuspend. 24 kuyulu doku kültürü plakasının bir kuyuya 200 mikrolitre hücre tohumve 37 derece lik bir inkübatörde hücrelerin birkaç gün iyileşmesini sağlar. Kalan 100 mikrolitre lik hücreyi maksimum hızda beş dakika boyunca peletleyin ve standart DNA çıkarma protokollerine göre ortaya çıkan peletten genomik DNA ayıklayın.Daha sonra, 10 mikrolitre polimeraz zincir reaksiyonu tamponu, bir mikrolitre deoksinükleotid karışımı, 2,5 mikrolitre kullanıcı tanımlı ters astar, 0,5 mikrolitre DNA polimeraz, 2-5 mikrolitre çıkarılan genomik DNA şablonu ve 50 mikrolitrelik son bir hacme reaksiyon getirmek için yeterli çift distile su ekleyin. Karışımı bir termal döngücüzerinde çalıştırın ve standart protokollere göre 1X TAE tampon kullanarak %2'lik agarose jelüzerindeki reaksiyonu çözün. Polimeraz zinciri reaksiyon ürün çıkarmak ve üreticinin talimatlarına göre bir jel çıkarma kiti kullanarak DNA arındırmak için temiz, keskin bir neşter kullanın.Ürünün konsantrasyonunu 260 nanometre absorbansta bir spektrofotometre kullanarak ölçün. İzole DNA 200 nanogram içeren bir tahlil karışımı hazırlayın, T7 enonukleaz I reaksiyon tampon iki mikrolitre, ve yeterli çift distile su karışımının son hacmi getirmek için 19 mikrolitre. Polimeraz zincir reaksiyonu ürününün belirtilen parametrelerde bir termal döngüde reanneal ve 5 birim T7 enonukleaz I'i 37 santigrat derecede 50 dakikalık bir kuluçka için reannealed ürünle karıştırın.Kuluçka sonunda, 1X TAE tampon kullanarak% 2.5 agarose jel üzerinde sindirilmiş DNA çözmek ve uygun bir jel görüntüleme sistemi üzerinde jel görüntü. ImageJ'deki jel görüntüsünü açın ve bandın etrafına mümkün olduğunca sınırına yakın dikdörtgen bir kutu çizin. Alanın ortalama gri değeri ve tümleşik yoğunluk seçeneklerinin denetlendiğini onaylayan Analiz et ve Ölçümleri Ayarla'yı tıklatın.Tamam'ı tıklatın ve Çözümle ve Ölçü'nü seçin. Ortalama veya ham yoğunluk yoğunluğu değeri, bant yoğunluğunun göstergesidir. Kültüre aktarılan hücreler konfluren olmaya başladıklarında, gösterildiği gibi tripsin-EDTA ile ayırın ve hücreleri 100 milimetrelik doku kültürü yemeğine seyrek olarak yerleştirin ve hücreleri hücre kültürünün kuluçka makinesine geri dönmeden önce tek tek kolonilerin büyümesine olanak sağlar.Koloniler oluşmaya başladığında, her kuyuda 500 mikrolitre hücre kültürü ortamı içeren 24 kuyuluk bir plakanın tek tek kuyularına aktarılmak için tek tek kolonileri seçmek için dört X büyütmeli bir mikroskop kullanın. İpucubireysel kuyular içinde kolonilerin karıştırma önlemek için çevredeki koloniler dokunmaz dikkat edin veya seyrek koloni büyüme bir alanda seçim. Tüm klonlar seçildiğinde, kültürler konca gelene kadar plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Sindirilmemiş plazmidler süper kıvrılmış olduğundan, doğrusallaştırılmış benzerlerinden daha hızlı koşma eğilimindedirler. Oligonükleotidlerin CRISPR plazmid omurgasına başarılı bir şekilde klonlanıp klonlanadığını belirlemek için koloni PCR yapılır ve plazmidler ayıklanıp Sanger dizilimi için gönderilmeden önce pozitif klonlar aşılanır. Floresan sinyal plazmidlerin başarılı bir şekilde teslim edilmesiyle mikroskop altında kolayca görüntülenebilir ve transfected hücrelerin akış sitometrisine göre sıralanmasına izin verir.Bir Agarose jel üzerinde gözlenen bantların yoğunlukları hesaplanır gibi, genomik DNA'nın dekolte verimliliğini kontrol etmek için bir T7 enonukleaz i test yapılır. Ayrıca, homoloji yönelimli onarım tabanlı bir deney hedef lokusbir kısıtlama alanı dahil etmek için tasarlanmıştır, bir kısıtlama parçası uzunluğu polimorfizm tsay ilgili bir kısıtlama enzimi ile yapılabilir. Bir protein kodlama geninin başarıyla inaktive edildiğini doğrulamak için, hedeflenen proteinin bulunmadığından emin olmak için batılı bir leke yapılabilir.Transfeksiyon dan sonra hücrelerin sıralanması plazmidler dahil olmadan hücreleri ortadan kaldırır, daha sonraki aşamalarında bir knock-out veya knock-in gen sahip olarak taranan hücrelerin yüzdesini artırarak. Bu tekniğin geliştirilmesi ile, şimdi onların mekanizmasını anlamak için belirli hastalıkları modellemek için gen fonksiyonu ve knock-in hücre hatları çalışma knock-out hücre hatları üretmek edebiliyoruz.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genetik

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these enhancers combine to produce a transcriptional response. As millions of enhancers have been identified, high-throughput tools are needed to determine enhancer function on a genome-wide scale. Current methods for studying enhancer function include making genetic deletions using nuclease-proficient Cas9, but it is difficult to study the combinatorial effects of multiple enhancers using this technique, as multiple successive clonal cell lines must be generated. Here, we present Enhancer-i, a CRISPR interference-based method that allows for functional interrogation of multiple enhancers simultaneously at their endogenous loci. Enhancer-i makes use of two repressive domains fused to nuclease-deficient Cas9, SID and KRAB, to achieve enhancer deactivation via histone deacetylation at targeted loci. This protocol utilizes transient transfection of guide RNAs to enable transient inactivation of targeted regions and is particularly effective at blocking inducible transcriptional responses to stimuli in tissue culture settings. Enhancer-i is highly specific both in its genomic targeting and its effects on global gene expression. Results obtained from this protocol help to understand whether an enhancer is contributing to gene expression, the magnitude of the contribution, and how the contribution is affected by other nearby enhancers.

This protocol describes the steps needed to design and perform multiplexed targeting of enhancers with the deactivating fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, also known as enhancer interference (Enhancer-i). This protocol enables the identification of enhancers that regulate gene expression and facilitates the dissection of relationships between enhancers regulating a common target gene.

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Candida albicans insan mantar patojen genom düzenleme CRISPR-aracılı

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed description of the transformation and genome editing procedures developed for P. andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae) and can form nitrogen-fixing root nodules in association with the rhizobium. Here, we describe a detailed protocol for reverse genetic analyses in P. andersonii based on Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing.

Dönüşüm, Genom Düzenleme ve Fenotipleme Azot sabitleme Tropikal Cannabaceae Ağaç Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

Filamentöz Ascomycete Huntiella omanensis'te CRISPR-Cas9 Aracılı Genom Düzenleme

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...