Name: alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice at JoVE.com

ويدعم هذا العمل منحة R01HL116826 إلى X. Zhao.

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من مدرسة الطب في فيرجينيا الشرقية.
1. فلوري الخرز البلعمه
<ol><li>Euthanize الماوس (C57BL/6J، 6 أسابيع من العمر، أنثى) CO2 خنقاً وفقا لبروتوكولات IACUC للقتل الرحيم الأخلاقية للحيوانات ب.</li>
	<li>وضع...

<ol>
	<li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages:+plasticity+in+a+tissue-specific+context.">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li><li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease.">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li><li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia:+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival.">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li><li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia.">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li><li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury.">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation.">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li><li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation.">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li><li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo.">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li><li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells.">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc&#947;+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages.">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fc&#947; Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2011).</li><li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation.">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li><li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung.">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester.">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages.">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li><li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression.">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li><li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li></ol>

بينما تؤدي وظيفة تبادل غازات، يواجه الرئة إصرار الجسيمات الأجنبية ومسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية. مقياس الدعم الكلي توفر الخط الأول للدفاع بحكم وظيفتها الرئيسية، إلا وهي البلعمه. هيئة علماء المسلمين أيضا بتنسيق مع سائر الخلايا المناعية في تدمير مسببات الأمراض، وفي القرار من ا...

هيئة علماء المسلمين هي البالعات المقيم الرئيسي في الحويصلات الهوائية في مرحلة استراحة وواحدة من اللاعبين الرئيسيين من الاستجابات المناعية الفطرية من خلال الاعتراف واستيعاب استنشاق الجراثيم والجسيمات الأجنبية1،2. وذكر أن هيئة علماء المسلمين تعتبر أساسية للتخليص السريع من العديد من مسببات الأمراض الرئوية مثل P. الزّنجاريّة و الالتهاب الرئوي الكلبسيله3،4، حيث غالباً ما يؤدي نقص في البلعمه صباحا في الجهاز التنفسي التهابات، مثل الالتهاب الرئوي الحاد، مما يتسبب في ارتفاع معدلات الوفيات والاعتلال.
هيئة علماء المسلمين أيضا بدء الفطرية الردود التهاب في الرئة بإنتاج السيتوكينات والمستقطبات مثل تنف-α وايل-1β، الذي الحديث المتبادل مع الخلايا الأخرى للبيئة السنخية لإنتاج المستقطبات وتجنيد العَدلات التحريضية، وحيدات، و الخلايا المناعية التكيفية في الرئة5. على سبيل المثال، يساعد إيل-1β التي تنتجها هيئة علماء المسلمين رئيس الوزراء إطلاق سراح chemokine العَدلات CXCL8 من الخلايا الظهارية6. وعلاوة على ذلك، تسهم هيئة علماء المسلمين البلعمه من الكريات البيض النوى apoptotic (بمنس)، فشل الأمر الذي يؤدي إلى تسرب المطرد للإنزيمات داخل الخلايا من بمنس إلى الأنسجة المحيطة مما أدى إلى تلف الأنسجة والتهاب المطول 7 , 8 , 9.
هو باعتراف مباشر بأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة في السطح الممرض المستقبلات التعرف على نمط (برس) من هيئة علماء المسلمين أو بواسطة الربط من مسببات الأمراض أوبسونيزيد مع مستقبلات المستجيب محصنة من هيئة علماء المسلمين وساطة البلعمه بهيئة علماء المسلمين 10-لهذا الأخير، مقياس الدعم الكلي يمكن التعرف على الأهداف التي أوبسونيزيد مع الغلوبولين المناعي (IgG) من خلال ما مستقبلات Fcγ (FcγR) أو مسببات الأمراض مغلفة بشظايا مكملاً، C3b و C3bi، من خلال مستقبلات تكمل بهم (CR)11. بين مستقبلات مكملاً، وأعرب عن الجمهورية التشيكية من فوق عائلة الغلوبولين المناعي (كريج) بشكل انتقائي في الأنسجة الضامة12، ونتيجة الأخيرة وأبرزت دور كريج في البلعمه صباحا في سياق P. الزّنجاريّة الالتهاب الرئوي 13.
العديد من الدراسات الأصلية استخدام أساليب تقييم بلعم البلعمه لوصف الآليات الجزيئية بلعم الدالة14،15. ومع ذلك، تتطلب أساليب مثل البلعمه المجراة في إجراء تقييم كمي دقيق البلعمه. وهنا، يمكننا تلخيص منهجية مفصلة البلعمه على حد سواء في المختبر والمجراه في استخدام fluorescein isothiocyanate (فيتك)-الزجاج الخرز والبروتين P. الزّنجاريّة أخضر نيون (التجارة والنقل)، على التوالي. علاوة على ذلك، يشرح لنا الطريقة للتفريق بين بر-والجمهورية التشيكية--و FcγR بوساطة البلعمه. وأخيراً، نحن تقرير طريقة تميز إزالة البكتيرية في الماوس فيما يتعلق بالتهاب رئوي P. الزّنجاريّة .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:809px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">18-G Needle</td>
			<td style="width:179px;">Nipro Medical&#160;</td>
			<td style="width:143px;">CI+1832-2C</td>
			<td style="width:272px;">Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,7-diaminofluorene (DAF)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D17106</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;">Decon Labs Inc.</td>
			<td style="width:143px;">18C27B</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well plate</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">3603</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">A10492</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">Z23373</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C5 deficient serum&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">C1163</td>
			<td>Biochemical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Labnet International</td>
			<td style="width:143px;">C0160-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300101 Issue 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Cell Culture Media</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">11995-065</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:179px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:143px;">S11550</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Jo Software</td>
			<td style="width:179px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:179px;">Dumont</td>
			<td style="width:143px;">0508-SS/45-PS-1</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-carboxylated latex beads</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4530</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP-P. aeruginosa</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td>101045GFP</td>
			<td>Suitable for&#160; cell infection assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass bottom dish</td>
			<td style="width:179px;">MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-Pressure Syringe</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td>FMJ-250</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:179px;">Omni International</td>
			<td>TH-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">H1009</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Olympus</td>
			<td style="width:143px;">IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine Hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Hospira</td>
			<td style="width:143px;">CA-2904</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shandon Kwik-Diff Stains</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">9990700</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Agar</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1425</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1427</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MicroSprayer Aerosolizer</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">IA-1C</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P6148</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">20012-027</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgG&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55806</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgM&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Cedarline Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">CL9000-M</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td style="width:179px;">Miltex</td>
			<td style="width:143px;">5-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Animal Laryngoscope</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">LS-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:179px;">BioRad</td>
			<td style="width:143px;">1610301</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Med)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">15012-12</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Small)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">91500-09</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sheep red blood cells (SRBCs)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55876</td>
			<td>Washed, preserved SRBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">U5378</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Akorn Animal Health</td>
			<td style="width:143px;">59399-110-20</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice

البلاعم السنخية (هيئة علماء المسلمين) حراسة الفضاء التهاب في الرئة. البلعمه بمقياس الدعم الكلي تلعب دوراً حاسما في الدفاع ضد غزو العوامل الممرضة، وإزالة الخلايا الميتة أو الجسيمات الأجنبية، وفي القرار الردود الملتهبة والأنسجة يعيد البناء، العمليات التي هي توسط المستقبلات السطحية المختلفة من هيئة علماء المسلمين. هنا، نحن التقرير أساليب لتحليل الدالة متجولة لمقياس الدعم الكلي باستخدام استراتيجيات تجريبية وفحوصات في المختبر والمجراه في التفريق بين نمط الاعتراف مستقبلات-وتكملة مستقبلات-، ونادي غاما بوساطة مستقبلات البلعمه. وأخيراً، نحن نناقش أسلوب لإنشاء ووصف نموذج P. الزّنجاريّة الالتهاب رئوي في الفئران لإزالة البكتيريا الحية في تقييم. هذه الاختبارات تمثل الأساليب الأكثر شيوعاً لتقييم وظائف صباحا ويمكن استخدامها أيضا لدراسة وظيفة بلعم وإزالة البكتيريا في الأجهزة الأخرى.

أجرينا أول تجربة لتحليل البلعمه بالماوس مقياس الدعم الكلي الأساسي. طوال جميع التحليلات، قارنا AMs المعزولة من الفئران WT و TRIM72كو . كما هو مبين في الشكل 1ألف، كشف الفحص المجهري الأسفار أن البلعمه من حبات الزجاج فيتك بالماوس مقياس الدعم الكلي ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice at JoVE.com

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

البلعمه البلاعم السنخية وإزالة البكتيريا في الفئران

هنا نحن تقرير الأساليب الشائعة لتحليل الدالة متجولة مورين البلاعم السنخية وإزالة البكتيريا من الرئة. دراسة هذه الأساليب البلعمه في المختبر من fluorescein isothiocyanate الخرز والمجراه في البلعمه من "بروتين فلوري أخضر" الزائفة الزّنجاريّة . كما يصف لنا طريقة لمسح P. الزّنجاريّة في الفئران.

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Pseudomonas aeruginosa هو مرض الأمراض BSL-2 مستوى. تذكر أن تتبع جميع الممارسات السلامة مستوى BSL-2 عند التعامل مع هذا الكائن الحي. هنا سوف نظهر عزل الخلية الأولية، في فيتروب phagocytosis، وتحليل مسار البلعومي، وفي الفيتوسيتوس الجسم الحي وتقييم إزالة البكتيريا في الفئران.يتطلب نجاح التسليم داخل المناطق التي ينتفض فيها العمل على إتقانها. تأكد من أن يتم تحميل الرذاذ المجهري بشكل صحيح ، والإبرة بين طيات صوتيتين ، ويتم التحكم في سرعة المكبس بشكل صحيح. تبدأ من خلال تأمين الماوس في موقف سوبين مع أطرافه المنتشرة على لوحة تشريح مغطاة المناشف الورقية وربط سلسلة تحت الأسنان الأمامية لسحب الرأس بحيث يتم وضع القصبة الهوائية على التوالي ومستوى.تطهير الماوس مع 70٪ الإيثانول واستخدام ملقط العادية لسحب ما يصل الجلد في خط وسط الجسم. استخدم مقص جراحيًا لقطع الجلد من البطن إلى أعلى الحلق. استخدم الطرف الحاد للمقص الجراحي القياسي لتشريح عضلة الحلق والأنسجة الضامة بعناية.افتح جدار البطن أسفل القفص الصدري. قطع الحجاب الحاجز، وقطع بعيدا الجزء السفلي من القفص الصدري لفضح جزئيا الرئتين. استخدام مقص الربيع لفضح القصبة الهوائية واستخدام ملقط لفهم حلقة الغضروف.استخدم المقص الصغير لعمل شق 1.5 ملليمتر تقريبًا على الوجه البطني للرغام الهوائية. سلسلة بعناية طول قصير من الخيط خياطة تحت القصبة الهوائية وإدراج قنية قياس 18 في القصبة الهوائية. عندما يكون القنية في مكانها ، قم بغسل الرئة برفق ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من PBS الطازجة لكل غسل ، وسحب السائل بلطف في الحقنة قبل إعادة ضخها مرة أخرى في الرئة ثلاث مرات متتالية.بعد كل lava، نقل السائل القصبي التي تم جمعها bronchoalveolar أو BALF إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي من مجموع السوائل المقطوعة. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد للطرد المركزي الثاني و resuspend الضامة السنخية غسلها في اثنين من milliliters من النسور المعدلة Dulbecco المتوسطة أو DMEM تكملها 10٪ غير تنشيط الحرارة مصل البقر الجنين. ثم نقل الضامة السنيلية الأولية إلى طبق بيتري من قاع الزجاج لاستزراعهم لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في حاضنة الخلايا.بعد 48 ساعة، وغسل الثقافة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني قبل تغذية الثقافة مع ملليلتر اثنين من المتوسطة الطازجة. بعد ذلك، أضف 50 كربوكسيلاتيتيمتر قطرهما 50 ميكرومتراً لاتكس FITC-متقارنة في الخلية إلى الثقافة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في حاضنة الخلية. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة على نطاق واسع خمس مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل لإزالة الخرز خارج الخلية وصورة عشوائية 100 الخلايا لحساب الخلايا التي تحتوي على الخرز داخل الخلايا.لمجرّد فحص opsonization، احتضان مرتين 10 إلى الخروف الثامن خلايا الدم الحمراء أو SRBCs مع 50 ميكرولترات من الزبيب المضادة لـ SRBC المناعية M أو IgM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان SRBCs opsonized مع 50 ميكرولترات من مصل الإنسان C5 ناقص لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية لإصلاح C3b وC3b مثبطات تكمل شظايا على SRBCs المغلفة IgM. المقبل، الطامحين وسائل الإعلام وإضافة 100 ميكرولترات من واحد مرات 10 إلى SRBCs opsonized سبعة لكل ملليلتر من المتوسطة إلى كل بئر من لوحة 96-well التي تحتوي على 10 مرات واحدة إلى الضامة مورين بين عشية وضحاها الرابع مثقف في البئر.احتضان الاستزراع المشترك للماوس SRBC لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية ثم قم بإزالة SRBCs غير المنضمة عن طريق الغسيل مع 100 ميكرولترات من تحلل كلوريد الأمونيوم العازلة للبوتاسيوم لمدة دقيقة واحدة. بعد إزالة SRBCs غير منضم، شطف مع 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام. Lyse الخلايا المتبقية مع 0.1 ٪ من كبريتات دوديسيل الصوديوم وعلاج lysates مع 50 ميكرولترات من 2 ، 7 ديامينوفلورين تكملها 3 ٪ بيروكسيد الهيدروجين وستة اليوريا المولى.ثم قياس امتصاص تشكيل الهيموغلوبين الأزرق الفلورين المحفز على مقياس الطيفي في 620 نانومتر. استخدم منحنى قياسي في 620 نانومتر امتصاص القيم مع عدد معروف من SRBCs لتحديد عدد SRBCs opsonized التي يتم phagocytized. لتقييم نمط التعرف على مستقبلات البلعوم بوساطة، غسل لمدة يومين الماوس مثقف الضامة السنوية الأولية مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وعلاج الخلايا مع 500 ميكرولترات من المتوسطة الطازجة التي تحتوي على 100 اليكسا فلور-488 مترافق Zymosan-A-الجسيمات الحيوية.بعد ساعة واحدة في 37 درجة مئوية، وإلقاء القبض على البلعوم مع 500 ميكرولترات من الجليد البارد PBS وغسل الخلايا على نطاق واسع خمس مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ شبه شكلي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واغسل الخلايا خمس مرات أخرى كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير، قم بتغطية الخلايا بـ 500 ميكرولترات من برنامج PBS الطازج للتصوير في ظل تباين التداخل وقناة الفلورسنت عند 488 نانومتر لتحديد عدد الضامة السنخية التي تحتوي على Zymosan-A-bioparticle.ل في تقييم الضامة الضامة في الجسم الحر، تأكيد المستوى المناسب من التخدير من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع قدم في الماوس تخدير ووضع الماوس على لوحة مسطحة مع سلك من البلاستيك تحت القاطع العلوي. ضع الفأرة في منصة شبه مُبَتَكّنة في موضع 45 درجة مع السطح البطني الذي يواجه الصعود واستخدم ملقطًا منحنية لسحب اللسان وقمعه. ثم إدراج رذاذ مجهري بين طيات الصوتية لإدارة داخلtracheally 50 ميكرولترات من خمس مرات 10 إلى وحدات تشكيل مستعمرة ست من P.aeruginosa GFP في الرئتين من الحيوان تخدير.للتأكد من أن الإبرة المجهرية في القصبة الهوائية، قم بتحريك الحقنة برفق ولاحظ الطيات الصوتية على جانبي الإبرة. ساعة واحدة بعد العدوى، وجمع السائل lavage كما أظهرت للتو وبليه الضامة السنخية عن طريق الطرد المركزي. Resuspend مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثالثة في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد لcytocentrifuge على شريحة زجاجية.ثم تلطخ تفاضليا الشرائح السيتوسبون لالبالام السنخية، العدلات، والخلايا الليمفاوية، وفقا للبروتوكولات الهستوكيميائية القياسية. اختر عشوائيًا 100 من الضامة السنخية لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي بعمت البكتيريا. في أول تجربة في إزالة البكتيريا الحية، حقن داخل الرحم جرعة تحت تهليل من حوالي 2.5 إلى خمس مرات 10 وحدات تشكيل مستعمرة الخامسة لكل ملليلتر من P.aeruginosa إلى نوع البرية مفجّرة والفئران المتحولة وقياس وزن الجسم من كل كل يوم لمدة ستة أيام.في التجربة الثانية، حقن مجموعة جديدة من النوع البري والفئران المتحولة مع قاتلة ثلاث مرات 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة سبع لكل جرعة ملليلتر من P.aeruginosa وتسجيل الوفيات في غضون يومين من الحقن، وجمع أنسجة الرئة بأكملها في وقت الوفاة أو بعد يومين من الحقن لتحديد كمية من عبء الرئة البكتيرية في ذروة العدوى. بعد حصاد الرئتين، وقطع عينات الرئة إلى قطع صغيرة على الجليد والتجانس شظايا الرئة باستخدام ضبط إعداد المهيجات الكهربائية. ثم لوحة 100 ميكروليتر من التجانس على لوحات عزل Pseudomonas agar في 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية.المجهر Fluorescence يكشف أن الماوس الأولية alveolar الضامة البلعم البلعومي من الخرز اللاتكس FITC يحدث بعد ساعة واحدة من الحضانة، مع الضامة 100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 على العكس من ذلك ، فرط التعبير عن TRIM72 ، وهو بروتين مع وظيفة غير معروفة في خلايا الضامة مورين ، والنتائج في انخفاض أكثر من خمسة أضعاف في البلعمة التكميلية. اليكسا فلور-488 مترافق Zymosan-A الجسيمات، ومع ذلك، يتم تناولها في كمية متساوية من قبل الضامة السنخية الأولية معزولة عن أي نوع البرية أو الفئران خروج المغلوب.التلطيخ التفاضلي من BALF حصادها من نوع البرية والحيوانات خروج المغلوب يكشف عن عدد مماثل من الضامة ولكن قدرة أعلى البلعومات ل الضامة التي يتم حصادها من الفئران خروج المغلوب. وعلاوة على ذلك، فئران خروج المغلوب TRIM72 إظهار انتعاش أسرع من أوزان الجسم، والحفاظ على بقائها على قيد الحياة، ويحمل عبئا أقل من البكتيرية تفعل الحيوانات من النوع البرية بعد إدارة P.aeruginosa داخل المناطق. باستخدام هذه التقنية، يمكن تحليل العمليات البلعومية الأخرى المهمة للالتهاب الرئوي مثل بَتَمَعَل العدلات والمساهمة النسبية للبلعيات الأخرى في إزالة البكتيريا.في تركيبة مع مثبطات الدوائية، والنقل التكيفي، والحيوانات المعدلة وراثيا، يمكن أن تساعد هذه التقنية الباحثين على استكشاف المكون الجزيئي لنوع معين من البلعومات للبلعات ذات الاهتمام.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Bone Marrow-derived Macrophage Production

نخاع العظام المستمدة من بلعم الإنتاج

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

البلعمة فحص الخلايا الخلوية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

استخدام تعزيز الفلورية الخضراء البروتين-الإعراب عن الإشريكيّة القولونية لتقييم البلعمه بلعم البريتوني الماوس

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment