Name: alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice at JoVE.com

Dette arbejde støttes af grant R01HL116826 til X. Zhao.

Denne protokol følger retningslinjerne i den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af østlige Virginia Medical School.
1. fluorescerende perler fagocytose
<ol><li>Aflive mus (C57BL/6J, 6 uger gamle, kvindelige) af CO2 kvælning som pr IACUC protokoller for den etiske eutanasi af dyr.</li>
	<li>Lå musen mave-up på en dissektion bord dækket med papirservietter. Indkredse sine poter med dens lemmer spread-eagle og krog en streng under dens forreste tænder til at tr...

<ol>
	<li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages:+plasticity+in+a+tissue-specific+context.">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li><li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease.">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li><li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia:+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival.">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li><li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia.">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li><li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury.">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation.">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li><li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation.">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li><li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo.">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li><li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells.">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc&#947;+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages.">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fc&#947; Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2011).</li><li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation.">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li><li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung.">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester.">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages.">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li><li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression.">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li><li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li></ol>

Mens de udfører en gas udveksling funktion, konfronterer lungen vedvarende fremmede partikler, patogener og allergener. AMs giver den første linje i forsvaret i kraft af deres hovedfunktion, nemlig fagocytose. AMs også koordinere med andre immunceller i ødelægger patogener og i løsningen af betændelse. Her, beskrevet vi metoder til konkret vurdering fagocytose af AMs isoleret fra mus lunge. Protokollen præsenteret i dette manuskript forklarer en detaljeret undersøgelse af fagocytose både in vivo og in vitro, so...

AMs er de store hjemmehørende fagocytter i alveolerne på den hvilende fase og en af de store aktører i medfødte immun svar gennem anerkendelse og internalisering af inhaleret patogener og fremmede partikler1,2. Det er blevet rapporteret, at AMs er afgørende for den hurtig clearance af mange pulmonal patogener som P. aeruginosa og Klebsiella lungebetændelse3,4, så en mangel i AM fagocytose resulterer ofte i luftvejene infektioner, såsom akut lungebetændelse, som forårsager højere dødelighed og sygelighed satser.
AMs også indlede medfødte inflammatoriske respons i lungen ved produktion af cytokiner og kemokiner såsom TNF-α og IL-1β, hvilke krydstale med andre celler af alveolær miljøet at producere kemokiner og rekruttere inflammatoriske neutrofiler, monocytter, og Adaptive immunceller i lunge5. For eksempel, hjælper IL-1β produceret af AMs til prime frigivelsen af den neutrofile chemokine CXCL8 fra epitelceller6. Derudover bidrage AMs til fagocytose af apoptotiske polymorfnukleære leukocytter (PMNs), hvilket fører til vedvarende udsivning af intracellulære enzymer fra PMNs manglende omkringliggende væv, resulterer i vævsskader og langvarig inflammation 7 , 8 , 9.
Fagocytose af AMs er medieret af en direkte anerkendelse af patogen-associeret molekylære mønstre på patogen overfladen af mønster anerkendelse receptorer (PRRs) af AMs eller ved binding af opsonized patogener med immun effektor receptorer af AMs 10. for sidstnævnte, AMs kan genkende mål opsonized med immunoglobulin (IgG) gennem deres Fcγ receptorer (FcγR) eller patogener belagt med supplement fragmenter, C3b og C3bi, gennem deres supplement receptorer (CR)11. Blandt supplement receptorer, CR af immunoglobulin superfamilien (CRIg) er selektivt udtrykt i væv makrofager12, og en nylig har konstateret fremhævet rollen, som CRIg i AM fagocytose i forbindelse med P. aeruginosa lungebetændelse 13.
Mange oprindelige undersøgelser bruge metoder til at vurdere makrofag fagocytose for at beskrive de molekylære mekanismer af makrofag funktion14,15. Metoder som in vivo fagocytose kræver imidlertid en præcis kvantificering af fagocytose. Her, vi opsummere en detaljeret metode til in vitro- og in vivo fagocytose ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC)-glas perler og P. aeruginosa grøn fluorescerende proteiner (NGL), henholdsvis. Derudover forklarer vi metode til skelne blandt PRR-, CR- og FcγR-medieret fagocytose. Endelig vil rapportere vi en metode til at karakterisere bakteriel clearance i mus med hensyn til P. aeruginosa lungebetændelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:809px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">18-G Needle</td>
			<td style="width:179px;">Nipro Medical&#160;</td>
			<td style="width:143px;">CI+1832-2C</td>
			<td style="width:272px;">Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,7-diaminofluorene (DAF)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D17106</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;">Decon Labs Inc.</td>
			<td style="width:143px;">18C27B</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well plate</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">3603</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">A10492</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">Z23373</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C5 deficient serum&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">C1163</td>
			<td>Biochemical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Labnet International</td>
			<td style="width:143px;">C0160-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300101 Issue 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Cell Culture Media</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">11995-065</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:179px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:143px;">S11550</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Jo Software</td>
			<td style="width:179px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:179px;">Dumont</td>
			<td style="width:143px;">0508-SS/45-PS-1</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-carboxylated latex beads</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4530</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP-P. aeruginosa</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td>101045GFP</td>
			<td>Suitable for&#160; cell infection assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass bottom dish</td>
			<td style="width:179px;">MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-Pressure Syringe</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td>FMJ-250</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:179px;">Omni International</td>
			<td>TH-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">H1009</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Olympus</td>
			<td style="width:143px;">IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine Hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Hospira</td>
			<td style="width:143px;">CA-2904</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shandon Kwik-Diff Stains</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">9990700</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Agar</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1425</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1427</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MicroSprayer Aerosolizer</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">IA-1C</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P6148</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">20012-027</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgG&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55806</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgM&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Cedarline Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">CL9000-M</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td style="width:179px;">Miltex</td>
			<td style="width:143px;">5-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Animal Laryngoscope</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">LS-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:179px;">BioRad</td>
			<td style="width:143px;">1610301</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Med)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">15012-12</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Small)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">91500-09</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sheep red blood cells (SRBCs)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55876</td>
			<td>Washed, preserved SRBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">U5378</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Akorn Animal Health</td>
			<td style="width:143px;">59399-110-20</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice

Alveolær makrofager (AMs) bevogte den alveolære rum af lungen. Fagocytose af AMs spiller en afgørende rolle i forsvaret mod invaderende patogener, fjernelse af døde celler eller fremmede partikler, og i beslutningsforslaget af inflammatoriske respons og væv remodellering, processer der er medieret af forskellige overflade receptorer af AMs. Her rapporterer vi metoder til analyse af AMs ved hjælp af in vitro- og in vivo assays og eksperimenterende strategier til at skelne mellem den mønster anerkendelse receptor-, supplere receptor- og Fc gamma receptor-medieret fagocyterende funktion fagocytose. Endelig vil diskutere vi en metode til at etablere og karakterisere en P. aeruginosa lungebetændelse model i mus at vurdere bakteriel clearance in vivo. Disse assays repræsenterer de mest almindelige metoder til at evaluere AM funktioner og kan også bruges til at studere makrofag funktion og bakteriel clearance i andre organer.

Vi uropført eksperiment for at analysere fagocytose af musen primære AMs. Hele alle analyser sammenlignede vi AMs isoleret fra WT og TRIM72KO mus. Som vist i figur 1A, afslørede Fluorescens mikroskopi at fagocytose af FITC-glasperler med musen primære AMs opstår efter 1 h inkubation. Figur 1 B viser analysen af fagocytose ved flowcytometri. Kvantificering af fagocytose målt ved m...

Watch this Scientific Journal Video about Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice at JoVE.com

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolær makrofag fagocytose og bakterier Clearance i mus

Her rapporterer vi fælles metoder til at analysere funktionen fagocyterende murine alveolær makrofager og bakteriel clearance fra lungen. Disse metoder studere in vitro-fagocytose af fluorescein isothiocyanat perler og in vivo fagocytose af Pseudomonas aeruginosa grøn fluorescerende proteiner. Vi beskriver også en metode til at rydde P. aeruginosa i mus.

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Pseudomonas aeruginosa er et BSL-2 niveau patogen. Husk at følge alle BSL-2-niveau sikkerhedspraksis, når du håndterer denne organisme. Her vil vi demonstrere primær celleisolering, in vitro fagocytose, og fagocytiske vej analyse, og in vivo fagocytose og bakteriel clearance vurdering i mus.Vellykket intratracheal levering kræver praksis at mestre. Sørg for, at mikrosprøjten er korrekt indlæst, nålen er mellem de to vokalfolder, og stemplets hastighed styres korrekt. Begynd med at fastgøre musen i liggende position med lemmerne spredt på et dissektionsbræt dækket med papirhåndklæder og koble en snor under fortænderne for at trække hovedet tilbage, så luftrøret er placeret lige og i niveau.Desinficere musen med 70% ethanol og bruge regelmæssige kraftvæceser til at trække op huden i midten af kroppen. Brug kirurgisk saks til at skære huden fra maven til toppen af halsen. Brug den stumpe ende af standard kirurgisk saks til omhyggeligt dissekere halsen muskel og bindevæv.Åbn bugvæggen under brystkassen. Skær mellemgulvet, og skær den nederste del af brystkassen til delvist udsætte lungerne. Brug foråret saks til at udsætte luftrøret og bruge de virpint til at gribe en brusk ring.Brug mikro saks til omhyggeligt at gøre en ca 1,5-millimeter snit på ventrale ansigt af luftrøret. Streng forsigtigt en kort længde af sutur tråd under luftrøret og indsætte en 18 gauge kanyle i luftrøret. Når kanylen er på plads, skal du forsigtigt trække lungen ud tre gange med en milliliter frisk PBS pr. vask, forsigtigt trække væsken ind i sprøjten, før den trækkes tilbage i lungerne igen tre gange i træk.Efter hver lavage overføres den opsamlede bronchoalveolar lavagevæske eller BALF til et konisk rør på 15 milliliter til centrifugering af den samlede høstede væske. Pelletsuspendrer pelletet op igen i en milliliter frisk PBS med endnu en centrifugering og opsaltning af de vaskede alveolær makrofager i to milliliter af Dulbeccos Modified Eagles Medium eller DMEM suppleret med 10 % ikke-varmeinaktiveret føtalt kvægserum. Overfør derefter den primære alveolær makrofager til en glasbundet petriskål til deres to-dages kultur ved 37 grader Celsius i en celleinkubator.Efter 48 timer vaskes kulturen med en milliliter PBS, før kulturen fodres med to milliliter frisk medium. Dernæst tilsættes 50 to-mikrometer diameter carboxylated latex FITC-konjugerede perler pr celle til kulturen for en times inkubation ved 37 grader Celsius i en celle inkubator. Ved slutningen af inkubationen vaskes pladen grundigt fem gange med en milliliter frisk PBS pr. vask for at fjerne de ekstracellulære perler og tilfældigt billede 100 celler for at tælle cellerne, der indeholder intracellulære perler.For en opsonization assay, inkubere to gange 10 til den ottende får røde blodlegemer eller SRBCs med 50 mikroliter af kanin anti-SRBC immunglobulin M eller IgM i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter inkuberes de opsoniserede SRBCs med 50 mikroliter C5-mangelfuldt humant serum i 30 minutter ved 37 grader Celsius for at fikse C3b- og C3b-inhibitoren til at komplementere fragmenter på IgM-belagte SRBC'er. Dernæst aspirere medierne og tilføje 100 mikroliter af en gang 10 til de syv opsonized SRBCs per milliliter medium til hver brønd af en 96-brønd plade, der indeholder en gange 10 til den fjerde overnight-dyrkede murine makrofager per brønd.Inkuber SRBC-musemakrofaget coculture i en time ved 37 grader Celsius, og fjern derefter de ubundne SRBCs ved at vaske med 100 mikroliter ammoniumchlorid kaliumlysisbuffer i et minut. Når de ubundne SRBCs er blevet fjernet, skylles med 100 mikroliter medier. Lyse de resterende celler med 0,1% natrium dodecyli sulfat og behandle lysater med 50 mikroliter af 2, 7-diaminofluorene suppleret med 3% hydrogenperoxid og seks molar urea.Derefter måle absorbans af hæmoglobin-katalyseret fluorein blå dannelse på et spektrofotometer på 620 nanometer. Brug en standardkurve ved 620 nanometerabsorbanceværdier med kendt antal SRBCs til at bestemme antallet af opsoniserede SRBCs, der er fagocytized. For at vurdere mønstergenkendelse receptor-medieret fagocytose, vask to-dages dyrket mus primær alveolær makrofager med en milliliter PBS og behandle cellerne med 500 mikroliter frisk medium indeholdende 100 Alexa fluor-488 konjugerede Zymosan-A-biopartikler.Efter en time ved 37 grader Celsius, standse fagocytose med 500 mikroliter af iskold PBS og vaske cellerne i udstrakt grad fem gange med en milliliter PBS per vask. Efter den sidste vask, fastgør cellerne med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og vask cellerne fem gange mere som påvist. Efter den sidste vask dækkes cellerne med 500 mikroliter frisk PBS til billeddannelse under differensinterferenskontrast og lysstofkanal ved 488 nanometer for at kvantificere antallet af Zymosan-A-biopartikelholdige alveolær makrofager.For i vivo alveolær makrofag fagocytose evaluering, bekræfte det passende niveau af sedation ved manglende reaktion på tå knivspids i en bedøvet mus og placere musen på et fladt bord med en plastiktråd under de øverste fortænder. Placer musen i en semi-liggende talerstol på 45 graders position med den ventrale overflade vender opad og bruge buede kraftanger til at trække sig ud og undertrykke tungen. Indsæt derefter en mikrosprøjt mellem vokalfolderne for intratracheally at administrere 50 mikroliter på fem gange 10 til de seks kolonidannende enheder af P.aeruginosa GFP i lungerne på det bedøvede dyr.For at bekræfte, at mikrosprøjtensnålen er i luftrøret, skal du forsigtigt flytte sprøjten og observere stemmefolderne på hver side af nålen. En time efter infektionen, indsamle lavage væske som netop påvist og pellet alveolær makrofager ved centrifugering. Opslænt en gange 10 til de tredje celler i 100 mikroliter frisk PBS til cytocentrifuge på et glas dias.Derefter differentieret pletten cytospun dias for alveolær makrofager, neutrofiler, og lymfocytter, i henhold til standard histokemiske protokoller. Tilfældigt vælge 100 alveolær makrofager til at kvantificere den procentdel af celler, fagocytserede bakterier. I det første in vivo-bakterierydningsforsøg injiceres intratrachealt en sublethalisk dosis på ca. 2,5 til fem gange 10 af de femte kolonidannende enheder pr. milliliter P.aeruginosa i bedøvet vildtype og mutantmus og måles hvert dyrs kropsvægt hver dag i seks dage.I det andet forsøg injiceres et nyt sæt vilde typer og mutantmus med en dødelig tre gange 10 til de syv kolonidannende enheder pr. milliliterdosis P.aeruginosa, og dødeligheden registreres inden for to dage efter en injektion, indsamle hele lungevævet på dødstidspunktet eller to dage efter injektionen for kvantificering af lungebakterielle byrde ved maksimal infektion. Efter høst lungerne skæres lungeprøverne i små stykker på is og homogenisere lungefragmenterne ved hjælp af en justeret elektrisk homogenisatorindstilling. Derefter plade 100 mikroliter af homogenat på Pseudomonas isolering agar plader i 10-fold seriel fortyndinger.Fluorescensmikroskopi afslører, at muse primære alveolær makrofag fagocytose af FITC latex perler opstår efter en times inkubation, med TRIM72 knockout makrofager viser en betydeligt højere fagocytiske evne. Omvendt resulterer overekspression af TRIM72, et protein med ukendt funktion i murine makrofagceller, i et mere end femdobling af komplementfagycytose. Alexa fluor-488 konjugerede Zymosan-A partikler, dog indtages i lige stor mængde ved primær alveolær makrofager isoleret fra enten vilde type eller knockout mus.Differential farvning af BALF høstet fra vilde type og knockout dyr afslører et tilsvarende antal makrofager, men en højere fagocytisk evne til makrofager høstet fra knockout mus. Yderligere, TRIM72 knockout mus demonstrere en hurtigere genopretning af deres kropsvægt, bevare deres overlevelse, og udviser en lavere bakteriel byrde end vilde type dyr efter intratracheal P.aeruginosa administration. Ved hjælp af denne teknik, andre fagocytiske processer, der er vigtige for lungebetændelse såsom neutrofil fagocytose og det relative bidrag af andre fagocytter i bakterier clearance kan analyseres.I kombination med farmakologiske hæmmere, adaptive overførsel, og transgene dyr, denne teknik kan hjælpe forskere til at udforske den molekylære komponent af specifikke type fagocytose for fagocytter af interesse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-afledt Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere antisvampeaktivitet Isoleret alveolære makrofager ved konfokal mikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High Throughput Fluorometrisk Teknik for Vurdering af makrofag Fagocytose og actinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofag Kolesterol Udtømmelse og dens indflydelse på fagocytose af<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Phagocytosis Assay for Apoptotiske Celler i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoer

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere makrofag ekstracellulære fælder ved hjælp af konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Ved hjælp af forbedret grønne fluorescens Protein-udtryk for Escherichia Coli at vurdere musen Peritoneal makrofag fagocytose

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Behandling af Bronkoalveolær lavage væske og matchet blod for alveolær makrofag og CD4+ T-celle Immunophenotyping og hiv reservoir Assessment