Name: alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice at JoVE.com

עבודה זו נתמך על ידי מענק R01HL116826 X. Zhao.

פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) של הספר לרפואה במזרח וירג'יניה.
1. פלורסנט חרוזים Phagocytosis
<ol><li>המתת חסד העכבר (C57BL/6J, בן, 6 שבועות נקבה) על ידי חנק2 CO לפי IACUC פרוטוקולים עבור המתת החסד האתית של בעלי חיים.</li>
	<li>הנח העכבר הפאז...

<ol>
	<li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages:+plasticity+in+a+tissue-specific+context.">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li><li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease.">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li><li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia:+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival.">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li><li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia.">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li><li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury.">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation.">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li><li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation.">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li><li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo.">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li><li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells.">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc&#947;+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages.">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fc&#947; Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2011).</li><li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation.">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li><li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung.">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester.">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages.">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li><li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression.">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li><li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li></ol>

תוך כדי ביצוע פונקציה חילופי גז, הריאה בהתמדה מתעמת עם חלקיקים זרים, פתוגנים, אלרגנים. AMs לספק את השורה הראשונה של הגנה מכוח תפקידם העיקרי, כלומר phagocytosis. AMs גם לתאם עם תאים חיסוניים אחרים להרוס פתוגנים, הרזולוציה של דלקת. כאן, אנחנו תיאר שיטות להערכת במיוחד phagocytosis מאת AMs מבודד מן הריאות העכבר. ...

AMs הינם phagocytes תושב הגדולות ב alveoli השלב מנוחתו, אחד השחקנים הראשיים של תגובות מערכת החיסון המולדת דרך ההכרה, הפנמה של פתוגנים בשאיפה וחלקיקים זרים1,2. בעבר דווח כי AMs הם חיוניים עבור פינוי מהיר של פתוגנים ריאתי רבים כגון aeruginosa פ ודלקת ריאות קלבסיאלה3,4, אז חוסר AM phagocytosis לעתים קרובות התוצאות הנשימה זיהומים, כגון דלקת ריאות חריפה, הגורמים שיעור גבוה של תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית.
AMs גם ליזום תגובות דלקתיות מולדת בריאה על ידי ייצור ציטוקינים ו נוגדנים כגון TNF-α ו- IL-1β, אשר crosstalk עם תאים אחרים של הסביבה מכתשי לייצר נוגדנים, לגייס נויטרופילים דלקתיות, ומונוציטים, ו תאים חיסוניים מסתגלת ב- ריאות5. לדוגמה, IL-1β המיוצר על ידי AMs מסייעת פריים לשחרור נויטרופילים כימוקין CXCL8 לתאי האפיתל6. יתר על כן, AMs לתרום phagocytosis אפופטוטיים להיפגע אורך חייהם יצירת לויקוציטים (PMNs), כשל של כשבסופו לדליפת מתמשכת של אנזימים תאיים מ PMNs הרקמה שמסביב, והתוצאה היא נזק לרקמות, דלקת ממושכת 7 , 8 , 9.
Phagocytosis מאת AMs מתווך על ידי הכרה ישירה של פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית על פני השטח הפתוגן קולטני זיהוי דפוס (PRRs) של AMs או על ידי האיגוד של פתוגנים opsonized עם אפקטור החיסון רצפטורים של AMs 10. עבור האחרון, AMs יכול לזהות את המטרות opsonized עם אימונוגלובולינים (IgG) דרך רצפטורים Fcγ שלהם (FcγR) או פתוגנים מצופה המשלים שברים, C3b, C3bi, דרך רצפטורים המשלים שלהם (CR)11. בין רצפטורים המשלים, הכי טובים ביותר של superfamily אימונוגלובולינים (CRIg) מתבטאת באופן סלקטיבי רקמות מקרופאגים12, והדגשתי ממצא האחרונות בתפקיד CRIg ב AM phagocytosis בהקשר של דלקת ריאות aeruginosa פ 13.
מחקרים מקוריים רבים להשתמש בשיטות להעריך מקרופאג phagocytosis כדי לתאר את המנגנונים המולקולריים של מקרופאג פונקציה14,15. עם זאת, שיטות כמו phagocytosis ויוו לדרוש כימות מדויק של phagocytosis. כאן, אנו מסכמים מתודולוגיה מפורט phagocytosis ויוו והן במבחנה באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-זכוכית חרוזים, חלבון פלואורסצנטי aeruginosa פ ירוק (GFP), בהתאמה. עוד, נסביר את שיטת המבדילים בין PRR - CR-, בתיווך FcγR phagocytosis. בסופו של דבר, אנחנו מדווחים על שיטה לאפיון סיווג חיידקי עכבר ביחס פ aeruginosa דלקת ריאות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:809px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">18-G Needle</td>
			<td style="width:179px;">Nipro Medical&#160;</td>
			<td style="width:143px;">CI+1832-2C</td>
			<td style="width:272px;">Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,7-diaminofluorene (DAF)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D17106</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;">Decon Labs Inc.</td>
			<td style="width:143px;">18C27B</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well plate</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">3603</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">A10492</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">Z23373</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C5 deficient serum&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">C1163</td>
			<td>Biochemical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Labnet International</td>
			<td style="width:143px;">C0160-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300101 Issue 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Cell Culture Media</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">11995-065</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:179px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:143px;">S11550</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Jo Software</td>
			<td style="width:179px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:179px;">Dumont</td>
			<td style="width:143px;">0508-SS/45-PS-1</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-carboxylated latex beads</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4530</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP-P. aeruginosa</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td>101045GFP</td>
			<td>Suitable for&#160; cell infection assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass bottom dish</td>
			<td style="width:179px;">MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-Pressure Syringe</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td>FMJ-250</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:179px;">Omni International</td>
			<td>TH-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">H1009</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Olympus</td>
			<td style="width:143px;">IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine Hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Hospira</td>
			<td style="width:143px;">CA-2904</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shandon Kwik-Diff Stains</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">9990700</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Agar</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1425</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1427</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MicroSprayer Aerosolizer</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">IA-1C</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P6148</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">20012-027</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgG&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55806</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgM&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Cedarline Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">CL9000-M</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td style="width:179px;">Miltex</td>
			<td style="width:143px;">5-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Animal Laryngoscope</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">LS-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:179px;">BioRad</td>
			<td style="width:143px;">1610301</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Med)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">15012-12</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Small)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">91500-09</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sheep red blood cells (SRBCs)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55876</td>
			<td>Washed, preserved SRBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">U5378</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Akorn Animal Health</td>
			<td style="width:143px;">59399-110-20</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice

עיצור מכתשי, מקרופאגים (AMs) השומרים את החלל מכתשי של הריאה. Phagocytosis מאת AMs משחק תפקיד קריטי בהגנה נגד הפולשים פתוגנים, הסרת תאים מתים או חלקיקים זרים, ומעבד בהחלטה תגובות דלקתיות ושחזור רקמות, מתווכת על ידי רצפטורים משטח שונים של AMs. כאן, אנחנו מדווחים שיטות לניתוח של הפונקציה phagocytic של AMs באמצעות מבחני במבחנה, ויוו ואסטרטגיות ניסיוני כדי להבדיל בין דפוס זיהוי הקולטן-, המשלים קולטן-Fc גמא קולטן בתיווך phagocytosis. לבסוף, נדון שיטה ליצירה ולקביעת לאפיין את מודל דלקת ריאות aeruginosa פ בעכברים כדי להעריך ויוו חיידקי סיווג. מבחני אלה מייצגים את השיטות הנפוצות להערכת AM פונקציות, יכול לשמש גם ללמוד מקרופאג פונקציה ו סיווג חיידקי באיברים אחרים.

אנחנו בוצע לראשונה את הניסוי כדי לנתח phagocytosis על ידי העכבר הראשי AMs. לאורך כל הבדיקות, השווינו AMs מבודד מןKO עכברים WT ו- TRIM72. כפי שמוצג באיור 1א, פלורסצנטיות מיקרוסקופ חשף את phagocytosis מחרוזי זכוכית FITC על ידי העכבר AMs העיקרית מתרחשת אחרי h 1 של דגירה. ...

Watch this Scientific Journal Video about Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice at JoVE.com

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

כאן אנחנו מדווחים על שיטות נפוצות כדי לנתח את הפונקציה phagocytic של מקרופאגים מכתשי מאתר ואישור חיידקים מן הריאות. שיטות אלה לומדים phagocytosis במבחנה של חרוזים isothiocyanate fluorescein ו- phagocytosis ויוו של Pseudomonas aeruginosa חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנו גם מתארים שיטה לניקוי aeruginosa פ בעכברים.

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

פסאודומונס ארוגינוזה הוא פתוגן ברמה BSL-2. זכור לעקוב אחר כל נוהלי הבטיחות ברמת BSL-2 בעת טיפול באורגניזם זה. כאן נדגים בידוד תאים ראשוני, במבחנה phagocytosis, וניתוח מסלול phagocytic, ו vivo phagocytosis והערכה סיווג חיידקי בעכברים.מסירה תוך-יצ'בית מוצלחת דורשת תרגול כדי לשלוט. ודא כי microsprayer טעון כראוי, המחט היא בין שני קפלי הקול, ואת מהירות הבוכנה נשלטת כראוי. התחל על ידי אבטחת העכבר בתחנה supine עם הגפיים להתפשט על לוח ניתוח מכוסה מגבות נייר משדלת חוט מתחת לשיניים הקדמיות כדי לסגת את הראש, כך קנה הנשימה ממוקם ישר ברמה.לחטא את העכבר עם 70% אתנול ולהשתמש מטלטולים רגילים כדי למשוך את העור בקו המרכזי של הגוף. השתמש מספריים כירורגיים כדי לחתוך את העור מהבטן לראש הגרון. השתמש בקצה הקהה של מספריים כירורגיים סטנדרטיים כדי לנתח בזהירות את שריר הגרון ורקמות החיבור.פתח את דופן הבטן מתחת לצלעות. חותכים את הסרעפת, וחותכים את החלק התחתון של בית החזה כדי לחשוף חלקית את הריאות. השתמש מספריים באביב כדי לחשוף את קנה הנשימה ולהשתמש במטסים לתפוס טבעת סחוס.השתמש מספריים מיקרו בזהירות לעשות חתך כ 1.5 מילימטר על פני הגחון של קנה הנשימה. בזהירות מחרוזת אורך קצר של חוט תפר מתחת קנה הנשימה ולהכניס 18 מד cannula לתוך קנה הנשימה. כאשר cannula הוא במקום, בעדינות לשטוף את הריאה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS טרי לכל לשטוף, בעדינות למשוך את הנוזל לתוך המזרק לפני reinfusing אותו בחזרה לתוך הריאה במשך שלוש פעמים ברציפות.לאחר כל לשון, להעביר את נוזל lavage bronchoalveolar שנאסף או BALF לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה של הנוזל שנקטף הכולל. אפשרו מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS טרי לצנטריפוגה שנייה והשקיעו מחדש את מקרופאגים מכתשים שנשטפו לשני מיליליטר של נסיוב בקר העוברי המשונה של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי שאינו מושבת בחום. ואז להעביר את מקרופאגים מים ראשוניים לצלחת פטרי תחתית זכוכית לתרבות שלהם יומיים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תא.לאחר 48 שעות, לשטוף את התרבות עם מיליליטר אחד של PBS לפני האכלת התרבות עם שני מיליליטר של מדיום טרי. לאחר מכן, הוסיפו לתרבות 50 חרוזים בקוטר 2 מיקרומטר עם לטוקסידות מסוג FITC לתא עבור דגירה של שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תאים. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת בהרחבה חמש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS טרי לכל לשטוף כדי להסיר את חרוזים חוץ תאיים באופן אקראי תמונה 100 תאים לספור את התאים המכילים חרוזי תאיים.לצורך בדיקה אופוסוניזציה, דגירה פעמיים 10 כדי כבשים השמינית כדוריות דם אדומות או SRBCs עם 50 microliters של ארנב נגד SRBC אימונוגלובולין M או IgM במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הדגירה SRBCs opsonized עם 50 microliters של סרום אנושי C5 לקוי במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לתקן את C3b ו C3b מעכבי להשלים שברים על SRBCs מצופה IgM. לאחר מכן, שאפו את המדיה והוסיפו 100 מיקרוליטרים של 10 פעמים לשבעת ה-SRBCs האופוסוניים למיליליטר של מדיום לכל באר של צלחת של 96 בארות המכילה פי 10 למאקרופאגים המורין המתורבים בן הלילה הרביעיים לבא.הדגירה את coculture מקרופאג עכבר SRBC במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להסיר את SRBCs מאוגד על ידי שטיפה עם 100 microliters של מאגר אשלגן אמוניום כלורי אשלגן במשך דקה אחת. לאחר הסרת SRBCs לא מאוגדים, לשטוף עם 100 microliters של מדיה. Lyse התאים הנותרים עם 0.1% נתרן dodecyl סולפט ולטפל lysates עם 50 microliters של 2, 7-diaminofluorene בתוספת 3%מי חמצן ושש אוריאה טוחנת.לאחר מכן למדוד את הספיגה של היווצרות כחול פלואורן המוגלובין-קטליז על ספקטרופוטומטר ב 620 ננומטר. השתמש בעקומה סטנדרטית בערכי ספיגת ננומטר של 620 עם מספר ידוע של SRBCs כדי לקבוע את מספר ה- SRBCs האופוסוניים המרוכזים ב- phagocytized. כדי להעריך phagocytosis מתווך קולטן זיהוי דפוס, לשטוף יומיים מתורבת עכבר מכתש ראשוני מקרופאגים עם מיליליטר אחד של PBS ולטפל בתאים עם 500 microliters של מדיום טרי המכיל 100 אלקסה פלואור-488 גדילן Zymosan-A-bioparticles.לאחר שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס, לעצור את phagocytosis עם 500 microliters של PBS קר כקרח ולשטוף את התאים בהרחבה חמש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף את התאים חמש פעמים נוספות כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, לכסות את התאים עם 500 microliters של PBS טרי עבור הדמיה תחת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית ערוץ פלואורסצנטי ב 488 ננומטר כדי לכמת את מספר מקרופאגים Zymosan-A-bioparticle המכיל מכתש.עבור להערכת phagocytosis מקרופאג מכתב vivo, לאשר את הרמה המתאימה של הרדמה על ידי חוסר תגובה קמצוץ בוהן בעכבר הרדמה ולמקם את העכבר על לוח שטוח עם חוט פלסטיק מתחת החותכים העליונים. מניחים את העכבר ב rostrum שקע למחצה ב 45 מעלות מיקום עם משטח הגחון פונה כלפי מעלה ולהשתמש מדפים מעוגלים לשלוף ולדכא את הלשון. לאחר מכן הכנס microsprayer בין קפלי הקול לנהל תוך מאמץ 50 microliters של חמש פעמים 10 לשש יחידות יוצרות המושבה של P.aeruginosa GFP לתוך הריאות של החיה הרדמה.כדי לאשר כי מחט microsprayer הוא קנה הנשימה, בעדינות להזיז את המזרק ולהתבונן קפלי הקול משני צדי המחט. שעה לאחר הזיהום, לאסוף את נוזל lavage כפי שהוכח רק גלולה מקרופאגים alveolar על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר פעם אחת 10 לתאים השלישיים ב 100 microliters של PBS טרי עבור cytocentrifuge על מגלשת זכוכית.ואז להכתים באופן דיפרנציאלי את שקופיות cytospun עבור מקרופאגים מכתים, נויטרופילים, ולימפוציטים, על פי הפרוטוקולים ההיסטוכימיים הסטנדרטיים. בחר באופן אקראי 100 מקרופאגים מכתרים כדי לכמת את אחוז התאים כי phagocytosed חיידקים. בניסוי הראשון בסיווג חיידקים vivo, להזריק תוך רחף מנה sublethal של כ 2.5 עד חמש פעמים 10 יחידות המושבה החמישית להרכיב למיליליטר של P.aeruginosa לתוך סוג הבר מורדם עכברים מוטנטים ולמדוד את משקל הגוף של כל חיה כל יום במשך שישה ימים.בניסוי השני, להזריק קבוצה חדשה של סוג פראי ועכברים מוטנטים עם קטלני שלוש פעמים 10 לשבע יחידות יוצרות המושבה למנה מיליליטר של P.aeruginosa ולתזמן את התמותה בתוך יומיים של זריקה, איסוף רקמת הריאה כולה בזמן המוות או יומיים לאחר הזריקה לכמת את נטל חיידקי הריאות בשיא הזיהום. לאחר קצירת הריאות, חותכים את דגימות הריאה לחתיכות קטנות על הקרח ומהומוגנים את שברי הריאה באמצעות הגדרת הומוגניזציה חשמלית מותאמת. ואז צלחת 100 microliters של הומוגונט על פסאודומונס בידוד אגר צלחות בדילול סדרתי 10-פי.מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מגלה כי מקרופאגוזיס מכתש ראשי של העכבר של חרוזי לטקס FITC מתרחשת לאחר שעה אחת של דגירה, עם מקרופאגים נוקאאוט TRIM72 המדגימים יכולת phagocytic גבוהה משמעותית. לעומת זאת, לחץ יתר של TRIM72, חלבון עם פונקציה לא ידועה בתאי מקרופאג מורין, גורם לירידה של יותר מחמישה פי חמישה בפאגוציטוזיס המשלים. אלקסה פלואור-488 יציבה חלקיקי Zymosan-A, עם זאת, הם לבלוע בכמות שווה על ידי מקרופאגים מכתליים ראשוניים מבודדים מסוג פראי או עכברי נוקאאוט.כתמים דיפרנציאליים של BALF שנקטפו מבעלי חיים פראיים ונוקאאוט חושפים מספר דומה של מקרופאגים אך יכולת phagocytic גבוהה יותר עבור המקרופאגים שנקטפו מעכברי נוקאאוט. יתר על כן, עכברי נוקאאוט TRIM72 להפגין התאוששות מהירה יותר של משקולות הגוף שלהם, לשמור על הישרדותם, ולהפגין נטל חיידקי נמוך יותר מאשר בעלי חיים מסוג בר לאחר ניהול P.aeruginosa תוך-חוץ-תאי. באמצעות טכניקה זו, תהליכים phagocytic אחרים החשובים לדלקת ריאות כגון נויטרופילים phagocytosis ואת התרומה היחסית של phagocytes אחרים סיווג חיידקים ניתן לנתח.בשילוב עם מעכבי פרמקולוגיים, העברה אדפטיבית ובעלי חיים מהועברים, טכניקה זו יכולה לעזור לחוקרים לחקור את המרכיב המולקולרי של סוג מסוים של phagocytosis עבור phagocytes של עניין.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Bone Marrow-derived Macrophage Production

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia Coli כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment