Name: alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00
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このプロトコルの制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 東バージニア医学校のガイドラインに従います。
1. 蛍光ビーズ貪食
<ol><li>マウスを安楽死させる (c57bl/6 j、6 週齢、女性) 動物の倫理的な安楽死のため IACUC プロトコルに従って CO2窒息により。</li>
	<li>ペーパー タオルで覆われて解剖基板上腹のマウスを置きます。その手足をイナバウアーで前足をダウ?...

<ol>
	<li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages:+plasticity+in+a+tissue-specific+context.">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li><li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease.">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li><li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia:+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival.">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li><li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia.">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li><li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury.">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation.">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li><li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation.">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li><li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo.">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li><li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells.">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc&#947;+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages.">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fc&#947; Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2011).</li><li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation.">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li><li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung.">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester.">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages.">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li><li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression.">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li><li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li></ol>

ガス交換機能を実行している間肺永続的異物、病原体、およびアレルゲンを直面しています。AMs は、主な機能、すなわち貪食のおかげで防衛の最初の行を提供します。AMs はまた他の免疫細胞が病原体を破壊して炎症の解像度を調整します。ここでは、具体的にはマウス肺から分離された AMs によって貪食能を評価する方法について述べる。本稿で提示されたプロトコルは、マクロファージの...

AMs は、休止期、1 つ認識を介して免疫反応の主要なプレーヤーと吸入の病原体や異物1,2の内面化、肺胞で主要な居住者食です。午前貪食の欠乏はしばしば呼吸の結果、AMs が膿やクレブシエラ肺炎3,4など多くの肺病原体の迅速なクリアランスに欠かせないことが報告されています。などの感染症、急性肺炎死亡率と罹患率を引き起こす。
AMs は、サイトカインやケモカイン TNF α、il-1、ケモカインを生成し、炎症性好中球、単球を集める歯槽の環境の他の細胞のクロストークなどを生産することによって肺で生得的な炎症反応を開始するも、肺5適応免疫細胞。たとえば、AMs によって生成される il-1 は主要な上皮細胞6から好中球ケモカイン CXCL8 のリリースに役立ちます。また、AMs はアポトーシス多形核白血球 (Pmn) の貪食能、周囲の組織、組織の損傷の結果、長期の炎症細胞内酵素の持続的な漏出につながる Pmn からの失敗に貢献します。7,8,9。
AMs が貪食は、AMs のパターン認識受容器 (PRRs)、オプソニン病原体の AMs の免疫エフェクター受容体との結合による病原体の表面に病原体関連分子パターンの直接認識によって媒介されます。10します。 後者の AMs は、Fcγ 受容体 (FcγR) で免疫グロブリン (IgG) とオプソニン ターゲットを認識できるまたは補体の断片、C3b と発見及び C3bi、補体受容体を介して病原体被覆 (CR)11。補体受容体の中で免疫グロブリン スーパーファミリー (CRIg) の CR は組織マクロファージ12で選択的に発現し、最近の知見膿肺炎のコンテキストで午前食から CRIg の役割を強調表示13。
元の多くの研究は、マクロファージ機能14,15の分子メカニズムを記述するのにマクロファージ貪食能を評価するのにメソッドを使用します。しかし、生体内で貪食能のようなメソッドは、貪食の正確な定量を必要です。ここで、かに (FITC) を使用して生体外でそして生体内で貪食能の詳細な方法については要約-ガラス ビーズと膿緑色蛍光タンパク質 (GFP)、それぞれ。さらに、PRR、CR、および FcγR を介した細胞貪食の間で区別する方法をについて説明します。最後に、P.緑膿菌肺炎に関してマウスにおける細菌クリアランスをキャラクタライズ手法を報告する.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:809px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">18-G Needle</td>
			<td style="width:179px;">Nipro Medical&#160;</td>
			<td style="width:143px;">CI+1832-2C</td>
			<td style="width:272px;">Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,7-diaminofluorene (DAF)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D17106</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;">Decon Labs Inc.</td>
			<td style="width:143px;">18C27B</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well plate</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">3603</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">A10492</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">Z23373</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C5 deficient serum&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">C1163</td>
			<td>Biochemical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Labnet International</td>
			<td style="width:143px;">C0160-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300101 Issue 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Cell Culture Media</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">11995-065</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:179px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:143px;">S11550</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Jo Software</td>
			<td style="width:179px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:179px;">Dumont</td>
			<td style="width:143px;">0508-SS/45-PS-1</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-carboxylated latex beads</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4530</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP-P. aeruginosa</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td>101045GFP</td>
			<td>Suitable for&#160; cell infection assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass bottom dish</td>
			<td style="width:179px;">MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-Pressure Syringe</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td>FMJ-250</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:179px;">Omni International</td>
			<td>TH-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">H1009</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Olympus</td>
			<td style="width:143px;">IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine Hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Hospira</td>
			<td style="width:143px;">CA-2904</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shandon Kwik-Diff Stains</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">9990700</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Agar</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1425</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1427</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MicroSprayer Aerosolizer</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">IA-1C</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P6148</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">20012-027</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgG&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55806</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgM&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Cedarline Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">CL9000-M</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td style="width:179px;">Miltex</td>
			<td style="width:143px;">5-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Animal Laryngoscope</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">LS-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:179px;">BioRad</td>
			<td style="width:143px;">1610301</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Med)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">15012-12</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Small)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">91500-09</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sheep red blood cells (SRBCs)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55876</td>
			<td>Washed, preserved SRBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">U5378</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Akorn Animal Health</td>
			<td style="width:143px;">59399-110-20</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice

肺胞マクロファージ (AMs) は、肺の肺胞腔をガードします。AMs によって貪食病原体、死んだ細胞や異物の除去に侵入戦防衛で重要な役割を果たしている、炎症反応、組織改造の解像度では、処理の様々 な表面の受容器によって仲介されます。AMs。ここで、in vitro および in vivo アッセイおよび実験的戦略を使用してパターン認識受容体-、補体受容体 - と受容体を介した Fc ガンマを区別する AMs の貪食能の分析方法を報告します。貪食。最後に、我々 は確立し体内細菌クリアランスを評価するためにマウスで膿性肺炎モデルを特徴付ける方法をについて説明します。これらの試金は午前の機能を評価する最も一般的な方法を表し、マクロファージの機能と他の臓器に細菌クリアランスの勉強にも使えます。

まずマウスで貪食能を分析する実験を行った主な AMs。すべての解析を通して WT ・ TRIM72KOマウスから分離した AMs を比較しました。図 1Aのように、蛍光顕微鏡プライマリ AMs 発生 1 時間後のマウスで FITC ガラスビーズの貪食能を明らかにしました。図 1Bは、フローサイトメトリーによる貪食?...

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Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

肺胞マクロファージの貧食能およびマウスにおける細菌クリアランス

ここでマウス肺胞マクロファージおよび肺から細菌クリアランスの貪食能を分析するための一般的な方法を報告します。これらのメソッドは、フルオレセイン イソチオ シアン酸ビーズの貪食および緑膿菌緑色蛍光タンパク質の生体内で貪食能を検討します。マウスで膿をクリアするための方法について述べる。

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

緑膿菌はBSL-2レベルの病原体である。この生物を取り扱うときに、BSL-2レベルの安全慣行に従うことを忘れないでください。ここでは、初代細胞単離、生体内食作用、貪食経路解析、およびマウスにおける生体内食細胞化および細菌クリアランス評価について説明する。成功した気管内出産は、習得する練習を必要とします。マイクロスプレイヤーが適切にロードされていること、針が2つのボーカルフォールドの間にあり、プランジャー速度が適切に制御されていることを確認してください。まず、ペーパータオルで覆われた解剖板に手足を広げて、マウスを上手にして、前歯の下にひもを引っ掛けて頭を引っ込め、気管がまっすぐで高く配置されるようにします。70%エタノールでマウスを消毒し、通常の鉗子を使用して身体の中心線で皮膚を引き上げます。外科的はさみを使用して腹部から喉の上まで皮膚を切り取ります。慎重に喉の筋肉や結合組織を解剖するために標準的な外科用ハサミの鈍い端を使用してください。胸部の下の腹壁を開きます。横隔膜を切り、胸部の下部を切り取って肺を部分的に露出する。スプリングハサミを使用して気管を露出させ、鉗子を使用して軟骨リングをつかみる。マイクロハサミを使用して、気管の腹側面に約1.5ミリメートルの切開を慎重に行います。気管の下に縫合糸の短い長さを注意深くひもでつなぎ、気管に18ゲージのカニューレを挿入します。カニューレが所定の位置にある場合は、1回の洗浄につき1ミリリットルの新鮮なPBSで肺を3回軽く洗い流し、液を注射器にそっと引き出してから3回連続して肺に再注入します。各洗浄の後、収集した気管支肺胞洗浄液またはBALFを15ミリリットルの円錐管に移し、全収穫された流体の遠心分離を行う。2回目の遠心分離のために新鮮なPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、洗浄された肺胞マクロファージを10%非熱不活化ウシ胎児血清を補充したダルベックコの修正イーグルス培地またはDMEMの2ミリリットルに再中断します。その後、細胞インキュベーターで摂氏37度で2日間培養するために、一次肺胞マクロファージをガラス底ペトリ皿に移します。48時間後、培養液を1ミリリットルのPBSで洗浄してから、2ミリリットルの新鮮な培地で培養を供給する。次に、直径50マイクロメートルのカルボキシラスラテックスFITC共役ビーズを培養液に加え、セルインキュベーターで摂氏37度で1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、洗浄ごとに新鮮なPBSを1ミリリットルで5回広範囲に洗浄し、細胞外ビーズを取り除き、細胞内ビーズを含む細胞を数える100細胞を無作為に画像化する。オプゾニンゼーションアッセイの場合、ウサギの抗SRBC免疫グロブリンMまたはIgMの50マイクロリットルを室温で30分間、8番目の羊の赤血球またはSRBCに2回10回インキュベートします。その後、50マイクロリットルのC5欠乏したヒト血清を30分間摂氏37度でインキュベートし、IgMコーティングされたSRBC上のC3bおよびC3b阻害剤補体断片を固定します。次に、培地を吸引し、10マイクロリットルを10回加え、培地1ミリリットル当たり7マイクロソナイズSRBCsを、1回10回含有する96ウェルプレートの各ウェルに10回から4回目の一晩培養マウスマクロファージを1回含む。SRBCマウスマクロファージの共培養を摂氏37度で1時間インキュベートし、100マイクロリットルの塩化アンモニウムカリウムリシスバッファーで1分間洗浄して、アンバウンドSRBCを取り除きます。非結合SRBCを取り除いた後、100マイクロリットルの媒体ですすいでください。残りの細胞を0.1%のドデシル硫酸ナトリウムでライセし、50マイクロリットルの2、7-ジアミノフルオリン、3%過酸化水素および6モル尿素で補った分解液を処理します。次に、620ナノメートルの分光光度計でヘモグロビン触媒フルオレンブルー形成の吸光度を測定します。既知の数のSRBCsを持つ620ナノメートルの吸光度値の標準曲線を使用して、貪食化されたオプゾナイズされたSRBCの数を決定します。パターン認識受容体媒介性食細胞症を評価するには、2日間培養したマウス一次肺胞マクロファージを1ミリリットルのPBSで洗浄し、100個のアレクサフルオール-488を結合したZymosan-A-バイオ粒子を含む新鮮な培地500マイクロリットルで細胞を治療する。摂氏37度で1時間後、500マイクロリットルの氷冷PBSで貪食症を逮捕し、1回の洗浄につき1ミリリットルのPBSで細胞を5回広範囲に洗浄する。最後の洗浄後、4%パラホルムアルデヒドを室温で10分間固定し、実証したように細胞をさらに5回洗浄します。最後の洗浄後、488ナノメートルの差動干渉コントラストと蛍光チャネルでイメージングするための新鮮なPBSの500マイクロリットルで細胞を覆い、Zymosan-A-bioparticle含有肺胞マクロファージの数を定量化します。in vivo肺胞マクロサイトーシス評価では、麻酔マウスのつまみつまみへの応答が不足し、上部切歯の下にプラスチックワイヤーを付けた平らな板にマウスを置くことによって、適切なレベルの沈液を確認します。腹側表面を上向きにして45度の位置に半リカンベントロストラムにマウスを置き、湾曲した鉗子を使用して舌を引き出して抑制します。次に、声帯の間にマイクロスプレーを挿入して、麻酔下で50マイクロリットルの10マイクロリットルを麻酔動物の肺にP.aeruginosa GFPの6つのコロニー形成単位に投与する。マイクロ噴霧器の針が気管内にあることを確認するには、注射器をそっと動かし、針の両側の声のひだを観察します。感染の1時間後、ちょうど実証したように洗浄液を採取し、遠心分離によって肺胞マクロファージをペレットする。細胞遠心分離のために新鮮なPBSの100マイクロリットルの3番目の細胞に10回10回再懸濁し、ガラススライドに上に置き直します。次に、標準的な細胞化学的プロトコルに従って、肺胞マクロファージ、好中球、リンパ球の細胞紡ぎスライドを差し出して染色する。無作為に100の肺胞マクロファージを選び、細菌を貪食した細胞の割合を定量化する。初めての生体内細菌クリアランス試験では、P.aeruginosaのミリリットル当たり約2.5〜5倍の致死量量を麻酔野生型および変異マウスに注入し、毎日6日間各動物の体重を測定する。2回目の試験では、P.aeruginosaのミリリットル用量当たり7回のコロニー形成単位に致死的な10倍の野生型および変異マウスの新しいセットを注入し、注射後2日以内に死亡を記録し、死亡時または注射後2日後に肺組織全体を採取して、ピーク感染時の肺細菌負担を定量化する。肺を収穫した後、肺サンプルを氷の上の小片に切り、調整された電気ホモジナイザー設定を使用して肺断片を均質化する。その後、10倍の連続希釈液でシュードモナス分離寒天プレートにホモゲネートの100マイクロリットルをプレートします。蛍光顕微鏡検査では、FITCラテックスビーズのマウス初代肺胞マクロサイトーシスが1時間のインキュベーションの後に発生し、TRIM72ノックアウトマクロファージが著しく高い貪食能力を示すことを明らかにした。逆に、マウスマクロファージ細胞において未知の機能を有するタンパク質TRIM72の過剰発現は、補体食作用の5倍以上の減少をもたらす。しかし、アレクサフルオール-488コンジュゲートZymosan-A粒子は、野生のタイプまたはノックアウトマウスから分離された原発性肺胞マクロファージによって同じ量で摂取される。野生型およびノックアウト動物から採取されたBALFの差動染色は、同様の数のマクロファージを明らかにするが、ノックアウトマウスから収穫されたマクロファージに対する貪食能力が高い。また、TRIM72ノックアウトマウスは、体重の回復が早く、生存を維持し、気管内P.aeruginosa投与後の野生型動物よりも細菌の負担が低いことを示す。この技術を用いて、好中球食細胞症などの肺炎にとって重要な他の貪食過程および細菌クリアランスにおける他の食細胞の相対的寄与を分析することができる。薬理学的阻害剤、適応性移動、およびトランスジェニック動物と組み合わせて、この技術は、研究者が関心のある食作用細胞に対する特定のタイプの食作用の分子成分を探求するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Bone Marrow-derived Macrophage Production

骨髄由来マクロファージの生産

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

アポトーシス細胞の食作用アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment