Name: alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00
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이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 동부 버지니아 의과대학의의 지침을 따릅니다.
1. 형광 구슬 먹어서
<ol><li>안락사는 마우스 (C57BL/6J, 6 주 오래 된, 여성) 동물의 윤리 안락사에 대 한 IACUC 프로토콜에 의하여 CO2 질에 의해.</li>
	<li>종이 수건으로 커버 해 부 보드에 아랫 배 위로 마우스를 놓는다. Spread-eagle 그것의 사지와 그것의 발을 파악 하 고 그것...

<ol>
	<li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages:+plasticity+in+a+tissue-specific+context.">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li><li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease.">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li><li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia:+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival.">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li><li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia.">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li><li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury.">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation.">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li><li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation.">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li><li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo.">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li><li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells.">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc&#947;+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages.">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fc&#947; Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2011).</li><li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation.">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li><li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung.">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester.">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages.">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li><li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression.">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li><li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li></ol>

가스 교환 기능을 수행 하는 동안 폐 지속적으로 외국 입자, 병원 체, 및 알레르기 증상을 직면 한다. AMs는 그들의 주요 기능, 즉 먹어서 덕택으로 방어의 첫 번째 줄을 제공합니다. AMs는 또한 다른 면역 세포는 병원 체를 파괴와 염증의 해상도 함께 조정. 여기, 우리가 구체적으로 AMs 마우스 폐에서 분리 하 여 식 균 작용을 평가 하기 위한 방법을 설명 합니다. 이 원고에 프로토콜 먹어서 vivo에서 그...

AMs는 휴식 단계와 중 인정을 통해 타고 난 면역 반응의 주요 선수와 흡입된 병원 체와 외국 입자1,2의 국제화에는 폐 포에서 주요 거주 식 세포. 그것은 알려졌다 그래서 오전 먹어서 결핍 호흡에 종종 결과 AMs P. 녹 농 균 및 Klebsiella 폐 렴3,4, 등 많은 폐 병원 균의 급속 한 정리를 위한 필수적입니다. 감염, 급성 폐 렴과 같은 더 높은 사망률과 병 적 속도 일으킬.
AMs는 또한 cytokines 및 발산 TNF-α, IL 1β, 생산 발산 하 여 염증 성 호 중구, monocytes, 모집 치경 환경의 다른 세포와는 누화 등을 생산 하 여 폐에 타고 난 선 동적인 응답을 시작 하 고 적응 면역 세포 폐5에. 예를 들어 IL 1β AMs 제작한6상피 세포 호 중구 chemokine CXCL8의 릴리스를 도움이 됩니다. 또한, AMs apoptotic polymorphonuclear 백혈구 (PMNs)의 먹어서 주변 조직, 조직 손상의 결과로, 장기 염증 PMNs에서 세포내 효소의 지속적인된 유출에는 리드의 실패에 기여 7 , 8 , 9.
AMs에 의해 식 균 작용은 AMs의 패턴 인식 수용 체 (호흡기)에 의해 또는 AMs의 수용 체 면역 이펙터와 opsonized 병원 체의 바인딩에 의해 병원 체 표면에 병원 체 관련 된 분자 패턴의 직접 인식 하 여 중재 10. 후자의 경우, AMs 그들의 Fcγ 수용 체 (FcγR)를 통해 면역 글로불린 (IgG)와 opsonized 목표를 인식할 수 또는 병원 체 코팅 보수 조각, C3b 및 C3bi, 그들의 보완의 수용 체를 통해 (CR)11. 보충 수용 체 중 면역 글로불린의 superfamily (CRIg)의 CR은 선택적으로 조직 세포12, 나타나며 최근 발견에 피 녹 농 균 폐 렴의 맥락에서 오전 먹어서 CRIg의 역할 강조 13.
많은 원래 연구 메서드를 사용 하 여 대 식 세포 기능14,15의 분자 메커니즘을 설명 하기 위해 대 식 세포 식 균 작용을 평가. 그러나, vivo에서 먹어서 같은 방법 식 균 작용의 정확한 정량화를 해야합니다. 여기, 우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 먹어서 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용 하 여에 대 한 상세한 방법론 요약-유리 구슬과 피 농 균 녹색 형광 단백질 (GFP), 각각. 또한, 우리 PRR, CR 및 FcγR 중재 먹어서 가운데 차별화 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 피 농 균 폐 렴에 대해 마우스에 세균 정리 하는 방법을 보고 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:809px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">18-G Needle</td>
			<td style="width:179px;">Nipro Medical&#160;</td>
			<td style="width:143px;">CI+1832-2C</td>
			<td style="width:272px;">Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,7-diaminofluorene (DAF)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D17106</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;">Decon Labs Inc.</td>
			<td style="width:143px;">18C27B</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well plate</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">3603</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">A10492</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">Z23373</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C5 deficient serum&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">C1163</td>
			<td>Biochemical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Labnet International</td>
			<td style="width:143px;">C0160-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300101 Issue 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Cell Culture Media</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">11995-065</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:179px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:143px;">S11550</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Jo Software</td>
			<td style="width:179px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:179px;">Dumont</td>
			<td style="width:143px;">0508-SS/45-PS-1</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-carboxylated latex beads</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4530</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP-P. aeruginosa</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td>101045GFP</td>
			<td>Suitable for&#160; cell infection assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass bottom dish</td>
			<td style="width:179px;">MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-Pressure Syringe</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td>FMJ-250</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:179px;">Omni International</td>
			<td>TH-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">H1009</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Olympus</td>
			<td style="width:143px;">IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine Hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Hospira</td>
			<td style="width:143px;">CA-2904</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shandon Kwik-Diff Stains</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">9990700</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Agar</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1425</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1427</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MicroSprayer Aerosolizer</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">IA-1C</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P6148</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">20012-027</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgG&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55806</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgM&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Cedarline Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">CL9000-M</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td style="width:179px;">Miltex</td>
			<td style="width:143px;">5-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Animal Laryngoscope</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">LS-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:179px;">BioRad</td>
			<td style="width:143px;">1610301</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Med)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">15012-12</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Small)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">91500-09</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sheep red blood cells (SRBCs)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55876</td>
			<td>Washed, preserved SRBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">U5378</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Akorn Animal Health</td>
			<td style="width:143px;">59399-110-20</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice

치경 세포 (AMs)는 폐의 폐 포 공간 경비. AMs에 의해 먹어서 침입 병원 체, 죽은 세포 또는 외국 입자의 제거에 대 한 방어에 중요 한 역할을 한다 그리고 염증 반응과 조직 리 모델링의 해상도, 처리의 다양 한 표면 수용 체에 의해 중재 AMs입니다. 여기, 우리는 패턴 인식 수용 체-, 보완 수용 체 및 Fc 감마 수용 체-중재를 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험 및 실험적인 전략을 사용 하 여 AMs의 phagocytic 기능 분석에 대 한 방법을 보고합니다 식 균 작용입니다. 마지막으로, 설정 하 고 세균성 클리어런스 vivo에서 평가 하기 위해 쥐에 피 녹 농 균 폐 렴 모델을 특성화 하는 방법을 다루겠습니다. 이 분석 실험 오전 기능을 평가 하는 가장 일반적인 방법을 대표 하 고 또한 대 식 세포 기능 및 다른 기관에서 세균 정리를 공부 하는 데 사용 수 있습니다.

우리는 먼저 마우스에 의해 식 균 작용을 분석 하는 실험을 수행 기본 AMs. 모든 분석을 통해 우리는 AMs WT 및 TRIM72코 쥐에서 고립 된 비교. 그림 1A같이 형광 현미경 검사 법 기본 AMs 외피의 1 시간 후 발생 하는 마우스를 먹어서 FITC 유리 구슬의 공개. 그림 1 B cytometry에 의해 식 균 작용의 분석을 ?...

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Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

여기 우리 보고 murine 치경 대 식 세포와 폐에서 세균성 클리어런스 phagocytic 기능을 분석 하는 일반적인 방법. 이러한 방법을 연구 fluorescein isothiocyanate 구슬의 생체 외에서 먹어서 및 녹 농 균 녹색 형광 단백질의 vivo에서 먹어서. 우리는 또한 쥐에 피 녹 농 균 을 삭제 하는 방법을 설명 합니다.

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

슈도모나스 아에루기노사는 BSL-2 레벨 병원균이다. 이 유기체를 취급할 때 모든 BSL-2 수준의 안전 관행을 따르는 것을 기억하십시오. 여기에서 우리는 1 차세포 격리, 체외 phagocytosis 및 phagocytic 통로 분석, 그리고 생쥐에 있는 생체 교피토증 및 세균성 통관 평가를 보여줄 것입니다.성공적인 장내 전달에는 마스터하는 연습이 필요합니다. 마이크로스프레이가 제대로 로드되고 바늘이 두 개의 보컬 접기 사이에 있고 플런저 속도가 제대로 제어되는지 확인하십시오. 종이 타월로 덮인 해부 보드에 팔다리가 퍼지는 척추 위치에 마우스를 고정하고 앞니 아래에 끈을 연결하여 기관을 직선과 레벨로 배치할 수 있도록 하십시오.70%에탄올로 마우스를 소독하고 일반 집게를 사용하여 신체의 중심선에서 피부를 당깁니다. 외과 가위를 사용하여 복부에서 목구멍 의 상단까지 피부를 자른다. 표준 수술 가위의 무딘 끝을 사용하여 목 근육과 결합 조직을 조심스럽게 해부하십시오.흉곽 아래 복벽을 엽니다. 다이어프램을 자르고 흉곽의 하부부분을 잘라 폐를 부분적으로 노출시합니다. 스프링 가위를 사용하여 기관지를 노출하고 집게를 사용하여 연골 링을 잡습니다.마이크로 가위를 사용하여 기관지의 복부 면에 약 1.5 밀리미터 절개를 조심스럽게 만듭니다. 기관 아래에 짧은 봉합사 스레드를 조심스럽게 묶고 기관지에 18 게이지 캐뉼라를 삽입합니다. 캐뉼라가 제자리에 있을 때, 세척당 신선한 PBS 1밀리리터로 폐를 세 번 부드럽게 씻어내고, 액체를 주사기로 부드럽게 인출한 후 3회 연속 폐로 되돌려 놓습니다.각 라베이지 후, 수집된 기관지알베올라 라베이지 유체 또는 BALF를 15밀리리터 원추형 튜브로 이송하여 총 수확된 유체의 원심분리를 한다. 두 번째 원심 분리를 위해 신선한 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세척 된 폐포 대식세포를 덜베코의 수정 된 독수리 매체 또는 DMEM의 2 밀리리터로 10 % 불열 불활성 태아 소 혈청으로 보충합니다. 그런 다음 1 차 폐포 대식세포를 세포 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2 일 간의 문화를 위해 유리 바닥 페트리 접시에 옮습니다.48 시간 후, 신선한 매체의 두 밀리리터와 문화를 공급하기 전에 PBS의 1 밀리리터로 문화를 씻어. 다음으로, 세포당 50마이크로미터 직경의 카박스형 라텍스 FITC-컨쥬게이트 구슬을 세포 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1시간 배양배기에 첨가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 세포 외 구슬을 제거하고 무작위로 세포 내 구슬을 포함하는 세포를 계산하기 위해 세척 당 신선한 PBS의 1 밀리리터와 함께 플레이트를 광범위하게 5 번 세척.편협 분석의 경우, 토끼 항 SRBC 면역글로불린 M 또는 IgM의 50 마이크로리터를 실온에서 30분 동안 50마이크로리터로 8번째 양 적혈구 또는 SRBC에 2회 배양한다. 그런 다음 Opsonized SRBC를 C5 결핍 인간 혈청 50 마이크로리터로 30분 동안 섭씨 37도에서 배양하여 IgM 코팅 SRBC의 C3b 및 C3b 억제제 보완 조각을 수정합니다. 다음으로, 매체를 흡권하고 100마이크로리터를 중간 밀리리터당 7개의 공손화된 SRBC에 100마이크로리터를 첨가하여 10배를 함유한 96웰 플레이트의 각 웰에 10~4박 배양된 뮤린 대식파지당.SRBC 마우스 대식세포 공동배양은 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한 다음, 염화칼륨 용해 완충제 100마이크로리터로 세척하여 불바운드 SRBC를 제거합니다. 언바운드 SRBC가 제거된 후 100마이크로리터의 미디어로 헹구는 것입니다. 남은 세포를 0.1%의 도데딜 황산나트륨으로 리세우하고 과산화수소 3%와 6개의 어금니를 보충한 2, 7-이미노플루오렌의 50마이크로리터로 리자츠를 치료한다.그런 다음 620 나노미터에서 분광계에서 헤모글로빈 촉매 형광청 형성의 흡광도를 측정합니다. 알려진 수의 SRBC를 가진 620 나노미터 흡광도 값의 표준 곡선을 사용하여 phagocytized 되는 불투명한 SRBC의 수를 결정합니다. 패턴 인식 수용체 매개 phagocytosis를 평가하기 위하여는, PBS의 1밀리리터로 2 일 배양마우스 1 차용성 대식세포를 세척하고 100 알렉사 플루올러-488를 포함하는 신선한 매체의 500 마이크로리터로 세포를 취급합니다 Zymosan-A-bioparticles.섭씨 37도에서 1시간 후, 500마이크로리터의 얼음차가운 PBS로 식세포증을 체포하고 세척당 PBS 1밀리리터로 셀을 5회 광범위하게 세척합니다. 마지막 세척 후, 실온에서 10 분 동안 4 %의 파라 포름 알데히드로 세포를 수정하고 입증 된 대로 세포를 5 번 더 씻으시다. 마지막 세척 후, 488 나노미터에서 차동 간섭 대조 및 형광 채널에서 이미징을 위한 신선한 PBS의 500 마이크로리터로 세포를 커버하여 Zymosan-A-생체입자 함유 폐포 대식세포의 수를 정량화한다.생체 내 폐포 대식세포 증시 평가의 경우, 마취된 마우스에 발가락 꼬집어 에 대한 반응 부족으로 적절한 수준의 체증을 확인하고 상부 절개 아래에 플라스틱 와이어가 있는 플랫 보드에 마우스를 놓습니다. 마우스를 45도 위치에 반억지로 놓고 복부 표면을 위쪽으로 향하고 곡선 포셉을 사용하여 혀를 꺼내억제합니다. 그런 다음 발성 접기 사이에 마이크로스프레이를 삽입하여 마취된 동물의 폐에 P.aeruginosa GFP의 6개 식민지 형성 유닛에 5회 10번의 50마이크로리터를 내체 투여한다.마이크로스프레이 바늘이 기관체에 있는지 확인하기 위해 주사기를 부드럽게 움직이고 바늘양쪽의 보컬 주름을 관찰한다. 감염 후 1시간 후, 방금 시연된 대로 용액을 수집하고 원심분리에 의해 폐포 대식세포를 펠릿합니다. 유리 슬라이드에 사이토 센심 분리기를 위한 신선한 PBS의 100 마이크로리터에서 세 번째 세포에 10번 을 다시 중단합니다.그런 다음 표준 조직화학 프로토콜에 따라 폐포 대식세포, 호중구 및 림프구용 사이토스펀 슬라이드를 분분적으로 얼룩지게 합니다. 무작위로 선택 100 폐포 대식세포는 phagocytos박테리아 세포의 비율을 정량화. 생체 내 세균 통관 시험에서, 내체는 약 2.5~ 5배 10배의 치사 주사용량을 P.aeruginosa의 밀리리터당 5번째 콜로니 형성 단위를 마취 야생 형 및 돌연변이 마우스로 주입하고 6 일 동안 매일 각 동물의 체중을 측정합니다.두 번째 시험에서는, 치명적인 3회 10을 가진 새로운 야생형 및 돌연변이 마우스를 P.aeruginosa의 밀리리터 투여량당 7개의 콜로니 형성 단위로 주입하고 주사 후 2일 이내에 사망률을 기록하고, 사망 시 또는 이틀 후에 폐 조직 전체를 수집하여 폐 세균성 부담을 피크 감염시 정량화한다. 폐를 수확한 후, 폐 샘플을 얼음의 작은 조각으로 자르고 조정된 전기 균질화 설정을 사용하여 폐 조각을 균질화합니다. 그런 다음 10배 의 연속 희석으로 슈도모나스 절연 한천 판에 호모게네이트 100 마이크로리터를 플레이트합니다.형광 현미경 검사법은 FITC 라텍스 구슬의 마우스 1 차대 폐포 대식세포가 잠복한 1 시간 후에 발생한다는 것을 밝힙니다. 반대로, 뮤린 대식세포에서 알 수 없는 기능을 가진 단백질인 TRIM72의 과발현은 식세포증을 5배 이상 감소시합니다. 그러나 알렉사 플루오-488은 야생형 또는 녹아웃 마우스로부터 분리된 1차 폐포 대식세포에 의해 동일한 양으로 섭취된다.야생 유형과 녹아웃 동물에서 수확 한 BALF의 차동 얼룩은 유사한 수의 대식세포이지만 녹아웃 마우스에서 수확 한 대식세포에 대한 더 높은 식세포 능력을 보여줍니다. 또한, TRIM72 녹아웃 마우스는 체중의 빠른 회복을 입증하고, 생존을 유지하고, 내내 막피 투여 후 야생형 동물보다 세균성 부담을 낮춥다. 이 기술을 이용하여, 호중구 식세포증과 같은 폐렴에 중요한 다른 식세포 과정과 박테리아 클리어런스에 있는 그밖 phagocytes의 상대적인 기여는 분석될 수 있습니다.약리학적 억제제, 적응형 전이 및 형질전환 동물과 함께 이 기술은 연구원이 관심 있는 phagocytosis의 특정 유형의 분자 성분을 탐구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Bone Marrow-derived Macrophage Production

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment