Name: alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice at JoVE.com

Bu eser grant R01HL116826 için X. Zhao tarafından desteklenmektedir.

Bu iletişim kuralı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Doğu Virginia Tıp Fakültesi kuralları izler.
1. floresan boncuk fagositoz
<ol><li>Fare ötenazi (C57BL/6J, 6 hafta yaşlı, kadın) hayvanların IACUC iletişim kuralları etik ötenazi için göre CO2 boğulma tarafından.</li>
	<li>Kağıt havlu ile kaplı bir diseksiyon tahta üzerinde fareyi atmasından yatıyordu. Onun pençeleri ile onun bacaklarda spread-eagle pin ve böylece geri nefes borusunu ...

<ol>
	<li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages:+plasticity+in+a+tissue-specific+context.">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li><li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease.">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li><li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia:+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival.">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li><li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia.">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li><li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury.">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation.">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li><li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation.">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li><li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo.">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li><li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells.">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc&#947;+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages.">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fc&#947; Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2011).</li><li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation.">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li><li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung.">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester.">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages.">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li><li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression.">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li><li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li></ol>

Gaz değişimi işlevi yerine getirirken, akciğer ısrarla yabancı parçacıklar, patojenler ve alerjenleri yüzleşir. AMs onların ana işlevi, yani fagositoz gereğince savunma ilk satırı sağlar. AMs da diğer bağışıklık hücreleri patojenleri yok ve inflamasyon çözünürlük ile koordine. Burada, biz yöntemleri özellikle fare akciğer izole AMs tarafından fagositoz değerlendirmek için nitelendirdi. Bu el yazması sunulan Protokolü makrofaj işlevi ve diğer organlarında bakteri izni çalışmaya da...

AMs büyük ikamet fagositler alveoller içinde dinlenme sahne ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanıma yoluyla büyük oyuncular ve inhale patojenler ve yabancı parçacıklar1,2içselleştirilmesi vardır. Bu yüzden AM fagositoz bir eksikliği genellikle solunum içinde sonuçları AMs P. aeruginosa ve Klebsiella zatürre3,4gibi birçok akciğer patojenlerin hızlı geçiş izni için gerekli olan bildirilmiştir yüksek mortalite ve morbidite oranları neden enfeksiyonlar, akut pnömoni gibi.
AMs Ayrıca akciğer doğuştan gelen inflamatuar yanıt sitokinler ve TNF-α ve IL-1β, hangi crosstalk kemokinler üretmek ve inflamatuar nötrofil, monosit, askere alveoler çevrenin diğer hücrelerle gibi kemokinler üreterek başlatmak ve edinilmiş bağışıklık hücreleri akciğer5. Örneğin, IL-1β AMs tarafından üretilen nötrofil Kemokin CXCL8 yayın epitel hücreleri6hazırlamak için yardımcı olur. Ayrıca, hücre içi enzimler sürekli kaçağı neden PMNs gelen başarısızlık çevreleyen doku, doku hasarı sonucu ve uzun süreli iltihap fagositoz apoptotik polimorfonükleer lökositlerin (PMNs), AMs katkıda 7 , 8 , 9.
AMs tarafından fagositoz yanında kalıplarının patojen ilişkili moleküler patojen yüzeyi AMs desen tanıma reseptörleri (PRRs) veya opsonized patojenler bağlama AMs bağışıklık efektör reseptörleri ile doğrudan bir Tanıma aracılık ettiği 10. için ikinci, AMs immünglobulin (IgG) ile opsonized hedefleri onların Fcγ reseptörleri (FcγR) algılayabilir veya patojenler (CR)11tamamlayıcı parçaları, C3b ve C3bi, onların tamamlayıcı reseptörleri ile kaplanmış. Kompleman reseptörü arasında immünglobulin süper (CRIg) CR doku makrofajlar12' seçmeli olarak ifade edilir ve son bulma AM fagositoz bağlamında P. aeruginosa pnömoni, CRIg rolü vurgulanacak 13.
Birçok özgün çalışma yöntemleri makrofaj işlevi14,15moleküler mekanizmaları açıklamak için makrofaj fagositoz değerlendirmek için kullanın. Ancak, içinde vivo fagositoz gibi yöntemler fagositoz kesin bir miktar gerektirir. Burada, tüp bebek ve içinde vivo fagositoz floresein isothiocyanate (FITC) kullanarak için detaylı bir metodoloji özetlemek-cam boncuk ve P. aeruginosa yeşil flüoresan protein (GFP), anılan sıraya göre. Ayrıca, biz PRR, CR ve FcγR-aracılı fagositoz arasında differentiating yöntemi açıklar. Son olarak, bakteriyel temizleme Mouse P. aeruginosa pnömoni ile ilgili olarak niteleyen bir yöntemi bildirin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:809px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">18-G Needle</td>
			<td style="width:179px;">Nipro Medical&#160;</td>
			<td style="width:143px;">CI+1832-2C</td>
			<td style="width:272px;">Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,7-diaminofluorene (DAF)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D17106</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;">Decon Labs Inc.</td>
			<td style="width:143px;">18C27B</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well plate</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">3603</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">A10492</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">Z23373</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C5 deficient serum&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">C1163</td>
			<td>Biochemical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Labnet International</td>
			<td style="width:143px;">C0160-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300101 Issue 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Cell Culture Media</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">11995-065</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:179px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:143px;">S11550</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">FACSCalibur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow Jo Software</td>
			<td style="width:179px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:179px;">Dumont</td>
			<td style="width:143px;">0508-SS/45-PS-1</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-carboxylated latex beads</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4530</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP-P. aeruginosa</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td>101045GFP</td>
			<td>Suitable for&#160; cell infection assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass bottom dish</td>
			<td style="width:179px;">MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High-Pressure Syringe</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td>FMJ-250</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:179px;">Omni International</td>
			<td>TH-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">H1009</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Olympus</td>
			<td style="width:143px;">IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine Hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Hospira</td>
			<td style="width:143px;">CA-2904</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shandon Kwik-Diff Stains</td>
			<td style="width:179px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">9990700</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Agar</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1425</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP1427</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MicroSprayer Aerosolizer</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">IA-1C</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P6148</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">20012-027</td>
			<td>Cell Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgG&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55806</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-SRBC-IgM&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Cedarline Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">CL9000-M</td>
			<td>Suitable for immuno-assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td style="width:179px;">Miltex</td>
			<td style="width:143px;">5-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Animal Laryngoscope</td>
			<td style="width:179px;">Penn-Century</td>
			<td style="width:143px;">LS-2</td>
			<td>Suitable for laboratory animal use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:179px;">BioRad</td>
			<td style="width:143px;">1610301</td>
			<td>Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Med)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">15012-12</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors (Small)</td>
			<td style="width:179px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">91500-09</td>
			<td>Suitable for laboratory animal dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sheep red blood cells (SRBCs)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:143px;">55876</td>
			<td>Washed, preserved SRBCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">U5378</td>
			<td>Molecular Biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Akorn Animal Health</td>
			<td style="width:143px;">59399-110-20</td>
			<td>Pharmaceutical grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alveolar macrophage phagocytosis and bacteria clearance in mice

Alveoler makrofajlar (AMs) akciğer alveoler alan koru. Fagositoz AMs tarafından istila karşı patojenler, ölü hücreleri veya yabancı parçacıklar kaldırılmasını savunmak için kritik bir rol oynamaktadır ve inflamatuar yanıt ve doku remodeling çözünürlüğünde, işler bu tarafından çeşitli yüzey reseptörlerinin aracılı AMs. Burada, desen tanıma reseptör-, Kompleman reseptör- ve Fc gama reseptör aracılı arasında ayırt etmek için tüp bebek ve içinde vivo deneyleri ve deneysel stratejiler kullanarak AMs fagositik fonksiyonu analizi için yöntemler raporu fagositoz. Son olarak, biz bir yöntem oluşturmak ve P. aeruginosa pnömoni manken bakteriyel yetkisi içinde vivo değerlendirmek farelerde karakterize tartışıyorlar. Bu deneyleri AM işlevleri değerlendirmek için en yaygın yöntemleri temsil ve makrofaj işlevi ve diğer organlarda bakteriyel Temizleme çalışması için de kullanılabilir.

Fagositoz fare tarafından analiz için deney yapılan ilk birincil AMs. Tüm analizleri AMs WT ve TRIM72KO fareler izole karşılaştırıldığında. Şekil 1içindeAgösterildiği gibi Floresans mikroskobu o fagositoz FITC-cam boncuk birincil AMs oluşur kuluçka 1 h sonra fare tarafından saptandı. Resim 1 B Akış Sitometresi tarafından fagositoz analizini gösterir. Mikroskopi ...

Watch this Scientific Journal Video about Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice at JoVE.com

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

Burada fare alveoler makrofajlar ve akciğer üzerinden bakteriyel Temizleme fagositik işlevi analiz etmek için ortak yöntemleri raporu. Bu yöntemler floresein isothiocyanate boncuk tüp bebek fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa yeşil flüoresan protein içinde vivo fagositoz çalışma. Biz de P. aeruginosa farelerde temizlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Pseudomonas aeruginosa Bir BSL-2 düzeyi patojendir. Bu organizmayı kullanırken tüm BSL-2 düzeyinde güvenlik uygulamalarını takip etmeyi unutmayın. Burada farelerde primer hücre izolasyonu, in vitro fagositoz, fagositik yol analizi, in vivo fagositoz ve bakteriyel klirens değerlendirmesi göstereceğiz.Başarılı intratrakeal doğum master uygulama gerektirir. Mikrosprayer düzgün yüklü olduğundan emin olun, iğne iki ses kıvrımları arasında, ve piston hızı düzgün kontrol edilir. Kağıt havlularla kaplı bir diseksiyon tahtasına yayılmış uzuvları ile supine pozisyonda fareyi güvence altına alarak başlayın ve ön dişlerin altında bir ip bağlayarak başın altına çekerek trakeadüz ve düz bir konuma getirin.Fareyi %70 etanol ile dezenfekte edin ve vücudun orta hattındaki deriyi yukarı çekmek için düzenli çerkedikler kullanın. Karından boğazın üst kısmına kadar cildi kesmek için cerrahi makas kullanın. Dikkatle boğaz kas ve bağ dokuları incelemek için standart cerrahi makas künt ucunu kullanın.Göğüs kafesinin altındaki karın duvarını aç. Diyaframı kesin ve göğüs kafesinin alt kısmını kesilerek akciğerleri kısmen açığa çıkar. Trakea ortaya çıkarmak için bahar makası kullanın ve bir kıkırdak halkası kavramak için çiflik kullanın.Dikkatle trakea ventral yüzünde yaklaşık 1,5 milimetrelik bir kesi yapmak için mikro makas kullanın. Trakeanın altına kısa bir dikiş ipliği uzunluğunu dikkatlice dizin ve trakeaya 18 gauge kanül yerleştirin. Kanül yerinde olduğunda, yavaşça yıkama başına taze PBS bir mililitre ile akciğer üç kez lavaj, yavaşça tekrar akciğer içine üç kez arka arkaya geri dizginlemeden önce şırınga içine sıvı çekilmesi.Her lavajdan sonra, toplanan bronkoalveoler lavaj sıvısını veya BALF'ı toplam hasat edilen sıvının santrifüjü için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. İkinci bir santrifüj için taze PBS bir mililitre pelet resuspend ve Dulbecco's Modifiye Eagles Orta veya DMEM iki mililitre içine yıkanmış alveoler makrofajlar resuspend 10% ısı-inaktive olmayan fetal sığır serum uymaktadır. Daha sonra birincil alveoler makrofajları bir hücre kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede iki günlük kültürleri için cam dipli Petri kabına aktarın.48 saat sonra, kültürü iki mililitre taze orta ile beslemeden önce bir mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra, bir hücre kuluçka 37 santigrat derece bir saatlik kuluçka için kültüre hücre başına 50 iki mikrometre çapında karboksinize lateks FITC konjuge boncuk ekleyin. Kuluçka sonunda, ekstrasellüler boncukları çıkarmak için tabağı yıkama başına bir mililitre taze PBS ile beş kez kapsamlı bir şekilde yıkayın ve hücre içi boncukları içeren hücreleri saymak için rastgele 100 hücreyi görüntüleyin.Bir opsonizasyon tahlili için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tavşan anti-SRBC immünglobulin M veya IgM 50 mikrolitre ile sekizinci koyun kırmızı kan hücreleri veya SRBCs iki kez 10 kuluçka. Daha sonra, IgM kaplı SRBC'lerde C3b ve C3b inhibitörü kompleman parçalarını onarmak için 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede 50 mikrolitre C5 eksikliği olan insan serumu ile opsonize Edilmiş SRBC'leri kuluçkaya yatırın. Daha sonra, medya aspire ve bir kez 10 mikrolitre ekleyin yedi opsonized SRBCs orta mililitre başına bir 96-iyi plaka her kuyuya bir kez 10 içeren dördüncü gecede kültürlü ürinen makrofajlar başına.SRBC fare makrofaj coculture bir saat için 37 santigrat derece ve sonra bir dakika için amonyum klorür potasyum lisis tampon 100 mikrolitre ile yıkayarak bağlanmamış SRBCs kaldırın. Bağlanmamış SRBC'ler çıkarıldıktan sonra, 100 mikrolitre ortamla durulanın. Kalan hücreleri %0.1 sodyum dodecyl sülfat ile inceleyin ve lysatları %3 hidrojen peroksit ve altı molar üre ile takviye edilmiş 50 mikrolitre 2, 7-diaminoflorene ile tedavi edin.Daha sonra 620 nanometre de bir spektrofotometre üzerinde hemoglobin katalize flormavi oluşumunun absorbe ölçmek. Fagosirize opsonized SRBCs sayısını belirlemek için SRBCs bilinen sayıda 620 nanometre absorbans değerleri standart bir eğri kullanın. Desen tanıma reseptör aracılı fagositoz değerlendirmek için, PBS bir mililitre ile iki günlük kültürlü fare birincil alveoler makrofajlar yıkayın ve 100 Alexa flor-488 konjuge Zymosan-A-biyotaneleri içeren taze orta 500 mikrolitre ile hücreleri tedavi.37 santigrat derecede bir saat sonra, 500 mikrolitre buz gibi PBS ile fagositozun durulayın ve hücreleri yıkama başına bir mililitre PBS ile beş kez kapsamlı bir şekilde yıkayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile hücreleri düzeltmek ve gösterildiği gibi hücreleri beş kez daha yıkayın. Son yıkamadan sonra, zymosan-A-biyopartikül içeren alveoler makrofajların sayısını ölçmek için 488 nanometredidiferdiyal girişim kontrastı ve floresan kanal altında görüntüleme için 500 mikrolitre taze PBS ile hücreleri kaplayın.In vivo alveolar makrofaj fagositoz değerlendirmesi için, anestezili bir farede parmak kıskacına yanıt eksikliği ile sedasyon uygun düzeyde onaylamak ve üst kesici dişleraltında plastik bir tel ile düz bir tahta üzerinde fare yerleştirin. Fareyi 45 derecelik bir pozisyonda, ventral yüzey yukarı bakacak şekilde yarı recumbent bir bükükle yerleştirin ve dili çıkarmak ve bastırmak için kavisli forceps kullanın. Daha sonra ses kıvrımları arasında bir mikrosprayer yerleştirin intratrakeal beş kez 50 mikrolitre yönetmek için 10 anestezi lihayvanın akciğerlerine P.aeruginosa GFP altı koloni oluşturan birimleri.Mikrosprayer iğne trakea olduğunu doğrulamak için, yavaşça şırınga hareket ve iğnenin her iki tarafında ses kıvrımları gözlemlemek. Enfeksiyondan bir saat sonra lavaj sıvısını az önce gösterildiği gibi toplayın ve alveoler makrofajları santrifüj le peletleyin. Bir cam slayt üzerine sitosantrifüj için taze PBS 100 mikrolitre üçüncü hücrelere bir kez 10 resuspend.Sonra farklı alveoler makrofajlar, nötrofiller ve lenfositler için sitospun slaytlar leke, standart histokimyasal protokollere göre. Rastgele 100 alveoler makrofajlar seçin bu fagositoz bakterilerin hücrelerin yüzdesini ölçmek için. In vivo bakteri temizleme denemesinde, intratülal olarak yaklaşık 2,5 ila beş kez bir sublethal dozu enjekte 10 P.aeruginosa mililitre başına beşinci koloni oluşturan birimleri anestezi vahşi tip ve mutant fareler içine ve altı gün boyunca her hayvanın vücut ağırlığını ölçmek.İkinci denemede, p.aeruginosa mililitre doz başına yedi koloni oluşturan birimleri ölümcül üç kez 10 ile yabani tip ve mutant fareler yeni bir dizi enjekte ve bir enjeksiyon iki gün içinde mortalite kaydetmek, ölüm sırasında veya iki gün en yüksek enfeksiyon akciğer bakteriyel yükünün sayısallaştırılması için enjeksiyondan sonra tüm akciğer dokusu toplama. Akciğerleri hasat ettikten sonra, akciğer örneklerini buz üzerinde küçük parçalara ayırın ve ayarlanmış bir elektrikli homogenizer ayarı kullanarak akciğer parçalarını homojenize edin. Sonra 10 kat seri seyreltmeler pseudomonas izolasyon agar plakaları üzerine homojen homojen 100 mikrolitre plaka.Floresan mikroskopisi, FITC lateks boncuklarının fare primer alveoler makrofaj fagositozunun bir saatlik kuluçkadan sonra ortaya çıktığını ve TRIM72 nakavt makrofajlarının önemli ölçüde daha yüksek fagositik yeteneği gösterdiğini ortaya koymaktadır. Tersine, murine makrofaj hücrelerinde işlevi bilinmeyen bir protein olan TRIM72'nin aşırı ekspresyonu, kompleman fagositizinde beş kattan fazla azalmaya neden olur. Alexa flor-488 konjuge Zymosan-A parçacıkları, ancak, birincil alveoler makrofajlar ya vahşi tip veya nakavt fareler izole tarafından eşit miktarda yutuldu.Yabani tip ve nakavt hayvanlardan elde edilen BALF'nin diferansiyel boyaması benzer sayıda makrofaj ı, nakavt farelerden toplanan makrofajlar için daha yüksek fagositik yeteneği ortaya koymaktadır. Ayrıca, TRIM72 nakavt fareler vücut ağırlıkları daha hızlı bir iyileşme göstermek, onların hayatta kalma korumak, ve intratrakeal P.aeruginosa uygulama dan sonra vahşi tip hayvanlara göre daha düşük bir bakteriyel yük sergilemek. Bu teknik kullanılarak, nötrofil fagosititaz gibi pnömoni için önemli olan diğer fagositik süreçler ve bakteri temizliğinde diğer fagositlerin göreceli katkısı analiz edilebilir.Farmakolojik inhibitörleri ile birlikte, adaptif transfer, ve transgenik hayvanlar, bu teknik araştırmacılar ilgi fagositler için fagositoz belirli tip moleküler bileşeni keşfetmek için yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi<em&gt; Drosophila</emEmbriyolar

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi