Name: behavioral approaches to studying innate stress in zebrafish
Uploaded: 2019-05-01T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti della Jupiter Life Science Initiative alla Florida Atlantic University fino a ERD e ACK. Quest'opera è stata sostenuta anche da sovvenzioni R21NS105071 (assegnate a ACK e ERD) e R15MH118625 (assegnate a ERD) presso gli istituti nazionali di sanità.

Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura degli animali e l'uso Committeeat Florida Atlantic University.
1. la preparazione
<ol><li>Designare una stanza isolata per eseguire studi comportamentali o chiudere una sezione di una stanza in modo che sia isolata. Nota: la stanza dovrebbe essere indisturbata e avere un basso traffico per evitare di disturbare il comportamento normale del pesce.</li>
	<li>Spostare i seguenti materiali e attrezzature nella stanza comp...

Zebrafish Mostra una solida risposta allo stress in un nuovo carro armato Qui, descriviamo un approccio comportamentale semplice per esaminare le risposte di stress nel pesce zebra adulto, e convalidare l'approccio come una semplice misura di stress utilizzando farmacologia.
Il nuovo test del carro armato è un test ampiamente usato per esaminare lo stress innato nel pesce zebra e in altre specie di pesci12,14,<s...

Le risposte allo stress sono alterate comportamentali e gli stati fisiologici risultanti da stimoli potenzialmente dannosi o avsivi. Le risposte allo stress sono conservate in tutto il Regno animale e sono fondamentali per la sopravvivenza di un organismo1. Decenni di ricerca hanno notevolmente ampliato la nostra conoscenza di alcuni dei meccanismi genetici e neuronali alla base degli Stati di stress. Oggi, aree del cervello come l'amigdala e lo striato2, e fattori genetici come l' ormone rilasciante corticotropina (CRH), e i recettori glucocorticoidi (gr) e mineralocorticoidi ( Mr) sono stati studiati ampiamente3,4,5,6. Nonostante questi risultati critici, molto rimane sconosciuto sulla regolazione genetica e neuronale dello stress. Come tale, molti disturbi legati allo stress soffrono di una mancanza di terapie.
Organismi modello geneticamente emendabili forniscono uno strumento utile nello studio del controllo genetico e neuronale del comportamento. I modelli di pesce, in particolare, sono estremamente potenti: sono piccoli organismi con tempi di breve generazione, il loro uso in un ambiente di laboratorio è facile, i loro geniti sono facilmente modificati e, come un vertebrato, condividono non solo genetica, ma anche neuroanatomica omologia con le loro controparti di mammiferi7,8. I saggi standard per la misurazione dello stress possono essere abbinati a linee pesce zebra che ospitano mutazioni genetiche, o quelle in cui è possibile la manipolazione di precisi sottogruppi neuronali, e gli effetti di singoli geni o neuroni definiti possono essere valutati rapidamente ed efficientemente.
Comportamentoralmente, le risposte allo stress possono essere caratterizzate nel pesce come periodi di iper-attività o periodi prolungati di inattività (simile al "congelamento")9, ridotta esplorazione10, respirazione rapida, riduzione dell'assunzione di cibo11, e un posto-preferenza per il fondo di un serbatoio12. Ad esempio, se collocati in un serbatoio sconosciuto, i pesci zebra adulti e altri piccoli modelli di pesce mostrano una preferenza iniziale per la metà inferiore del serbatoio, eppure, nel corso del tempo, i pesci iniziano a esplorare le metà superiore e inferiore con una frequenza quasi uguale a12. Trattamento di adulti con farmaci noti per ridurre l'ansia causano pesci di esplorare immediatamente la metà superiore10,13. Al contrario, farmaci che aumentano l'ansia causano pesci a mostrare forte preferenza per la metà inferiore del serbatoio12,14,15. Così, ridotta esplorazione e preferenza per la metà inferiore del serbatoio sono indicatori semplici e affidabili di stress.
Come la maggior parte dei vertebrati, le risposte allo stress nei pesci sono guidate dall'attivazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-Inter-renale (HPI; analogo all'asse ipotalamo-pituitario-surrenale [hPa] nei mammiferi)14,16. Neuroni ipotalamici che esprimono l'ormone corticotropin-releasing hormone (CRH) segnale per l'ipofisi, che a sua volta rilascia adrenocorticotropico rilascio dell'ormone (ACTH). ACTH poi segnala alla ghiandola Inter-renale per produrre e secernere cortisolo, che ha un numero di bersagli a valle16, uno dei quali è il feedback negativo dei neuroni ipotalamici che producono CRH3,17, 18,19.
Qui descriviamo un metodo per valutare le misure comportamentali dello stress innato. Per il comportamento, abbiamo dettagliato i protocolli utilizzando il romanzo Tank Diving test12,14. Abbiamo poi dimostrare, ad esempio, che un farmaco ansiolitico noto, Buspirone, riduce le misure comportamentali dello stress.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1043px;" width="1042">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Camera</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Infrared filter</td>
			<td style="width:264px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Video Acquisition Program</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Infrared LED lights</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Assay tank</td>
			<td style="width:264px;">Aquaneering</td>
			<td style="width:181px;">Part number ZT180</td>
			<td style="width:380px;">Size: M3 1.8 liter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stand and clamp, or standard tripod for camera</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">250mL beaker</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Tracking software</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Buspirone chloride</td>
			<td style="width:264px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">B7148</td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Randomized trial generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral approaches to studying innate stress in zebrafish

Rispondere in modo appropriato agli stimoli stressanti è essenziale per la sopravvivenza di un organismo. Una vasta ricerca è stata fatta su un ampio spettro di malattie legate allo stress e disturbi psichiatrici, eppure ulteriori studi sulla regolazione genetica e neuronale dello stress sono ancora necessari per sviluppare terapie migliori. Il pesce zebra fornisce un potente modello genetico per indagare le basi neurali dello stress, in quanto esiste una vasta collezione di linee mutanti e transgeniche. Inoltre, la farmacologia può essere facilmente applicata al pesce zebra, poiché la maggior parte dei farmaci può essere aggiunta direttamente all'acqua. Descriviamo qui l'uso del ' romanzo Tank test ' come metodo per studiare le risposte di stress innata nel pesce zebra e dimostrare come i potenziali farmaci ansiolitici possono essere convalidati utilizzando il saggio. Il metodo può essere facilmente accoppiato con linee pesce zebra che ospitano mutazioni genetiche, o quelle in cui vengono utilizzati approcci transgenici per manipolare precisi circuiti neurali. Il saggio può essere utilizzato anche in altri modelli di pesce. Insieme, il protocollo descritto dovrebbe facilitare l'adozione di questo semplice saggio ad altri laboratori.

Esaminare lo stress nel pesce zebra Per esaminare il comportamento dello stress nel tempo in zebra di tipo selvaggio, abbiamo testato il pesce adulto dal ceppo24 AB nel nuovo test del serbatoio. Gli adulti AB sono stati sottoposti al protocollo come descritto sopra. Brevemente, il pesce è stato dato un periodo di acclimatazione 1-h in un serbatoio nella stanza comportamento. Un individuo è stato collocato in un bicchiere per 10 minuti, e poi collocato...

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Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare la sollecitazione comportamentale in un pesce zebra adulto. L'approccio sfrutta la tendenza innata che il pesce zebra preferisce la metà inferiore di un serbatoio quando è in uno stato stressante. Descriviamo anche i metodi per accoppiare il saggio con la farmacologia.

Approcci comportamentali allo studio dello stress innato nel zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

Il nuovo saggio del serbatoio si combinerà con potenti strumenti genetici in Zebrafish offre un metodo per sezionare come il cervello modula lo stress e come i circuiti neurali possono essere disregolati. Le vie di segnalazione genetica e neuronale sono altamente conservate tra Zebrafish e mammiferi e questa tecnica può aiutare a promuovere la nostra comprensione dei meccanismi alla base della risposta allo stress. Il metodo non è specifico di Zebrafish ed è stato utilizzato con il pesce grotta cieco messicano e quindi può potenzialmente essere esteso ad altre specie ittiche.Una prova può essere utile per determinare un'illuminazione corretta e il contrasto dell'animale su uno sfondo per ottenere un tracciamento riuscito. Il saggio viene usato raramente, ma può essere un processo coinvolto. La visualizzazione dei passaggi aiuterà altri ricercatori a eseguire correttamente la procedura.Jacqueline Chin, un post-doc in laboratorio, e Lydia Albert, una studentessa universitaria, presenteranno questa procedura. Inizia riempiendo un becher da 250 millilitri e almeno due serbatoi di detenzione con acqua del sistema di pesci. La mattina del test, trasferire almeno 10 Zebrafish adulti per ogni condizione sperimentale in singoli serbatoi di detenzione prima di trasferire tutto il pesce nella Behavior Room per l'acclimatazione per almeno un'ora.Etichettare i serbatoi in modo che la condizione o il genotipo degli animali sia cieco allo sperimentatore e utilizzare una rete per posizionare delicatamente un singolo adulto nel becher preriempato. Lasciare che il pesce adulto si acclimati nel becher per 10 minuti prima di versare delicatamente l'acqua e il pesce dal becher nel nuovo serbatoio sperimentale. Non appena il pesce è nel serbatoio, inizia la registrazione della fotocamera e allontanati dalla configurazione per evitare ulteriori disagi al pesce.Al termine della registrazione, rimuovere l'individuo dal nuovo serbatoio e posizionare il pesce in un nuovo serbatoio di attesa. Per valutare gli effetti di specifici farmaci di interesse, diluire il farmaco a una concentrazione di lavoro in becher da 250 millilitri di acqua di sistema. Utilizzo di un becher con acqua di sistema solo come controllo.Mascherare l'identità del farmaco e controllare i becher per garantire che il tester sia cieco alle condizioni di trattamento fino a dopo l'analisi ed eseguire un nuovo test del serbatoio come dimostrato per ottenere una risposta allo stress comportamentale di base. Al termine della registrazione di base, utilizzare una rete per trasferire immediatamente il pesce in uno dei becher di prova per 10 minuti prima di trasferire il pesce in un bicchiere di lavaggio contenente solo acqua dolce del sistema. È importante utilizzare reti separate designate per ogni becher di trattamento per prevenire il dosamento accidentale del pesce di controllo, specialmente quando sono coinvolti diversi trattamenti farmacologici.Dopo 10 minuti, metti il pesce in un nuovo serbatoio per un secondo nuovo test del serbatoio. Al termine del test trasferire il zebrafish adulto in un nuovo serbatoio di detenzione e sostituire l'acqua del sistema nel secondo nuovo serbatoio con acqua di sistema fresca per il passaggio successivo per prevenire la contaminazione incrociata del farmaco sperimentale. Alla fine di tutte le prove, riportare gli individui alla struttura ittico.Qui viene mostrata l'attività locomotoria di un singolo Zebrafish durante il primo e l'ultimo minuto di una nuova prova del serbatoio di 10 minuti. Quando viene introdotto per la prima volta nel serbatoio, il pesce in genere trascorre la maggior parte del tempo nel fondo del nuovo serbatoio. Nel corso del tempo, tuttavia, i pesci adulti dimostrano un graduale aumento della quantità di tempo trascorso nella parte superiore del serbatoio.In effetti, il tempo totale trascorso nella parte superiore del serbatoio durante il primo minuto è significativamente più breve rispetto all'ultimo minuto del nuovo test del serbatoio. Al contrario, la distanza totale percorsa tra il primo e l'ultimo minuto non rivela differenze significative. In questo esperimento rappresentativo, l'analisi dei percorsi locomotori zebrafish adulti ha rivelato poca differenza tra l'attività di nuoto Zebrafish prima e dopo il trattamento per gruppi di adulti esposti al solo veicolo.Al contrario, gli adulti esposti a un farmaco ansiolitico hanno trascorso una grande quantità di tempo nella parte superiore del serbatoio rispetto ai percorsi locomotori dello stesso pesce prima dell'esposizione al farmaco. Queste differenze non erano dovute a una minore locomozione in generale, in quanto non sono state misurate differenze significative nella distanza percorsa per nessuno dei gruppi. Poiché i ritmi comportamentali sono influenzati dai processi circadiani, assicurati di eseguire repliche sperimentali eseguite in giorni diversi durante la stessa ora del giorno per ogni esperimento.Ulteriori test comportamentali, come il test sul campo aperto o altre misurazioni fisiologiche dello stress, possono essere eseguiti per convalidare ulteriormente i risultati ottenuti dal nuovo test di immersione in vasca. Questo metodo può essere utilizzato un saggio ad alta produttività per affrontare le domande relative allo stress, alla paura e all'ansia.

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