Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

نشكر واضعي ثاكور سونيشكا لمساعدتها في التنميط والتصوير oca2 الأسماك المسخ هو مبين في الشكل 2. وأيده هذا العمل جائزة مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) 1656574 للكلية، وجبهة الخلاص الوطني جائزة 1754321 جي والكلية، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) جائزة R21NS105071 للكلية و E.R.D.

1-Morpholino اليغو التصميم
ملاحظة: تسلسل مكسيكي (أ) متوفرة من خلال "المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية" (نكبي) الجينات ونكبي SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)، وكذلك من مستعرض الجينوم انسيمبل (https://www.ensembl.org). عند تصميم morpholino للاستخدام في كل أشكال السطح والكهوف السكنية، من المهم تحديد ...

وهنا، قدمنا منهجية للتلاعب بالجينات دالة باستخدام مورفولينوس، وجين كريسبر/Cas9 التحرير، ومنهجية ترانسجينيسيس. يرجح أن ثروة التكنولوجيا الوراثية وتعظيم الاستفادة من هذه النظم في الزرد سيسمح بنقل هذه الأدوات إلى ألف مكسيكي مع سهولة52. النتائج الأخيرة استخدمت هذه النهج في <e...

منذ داروين أصل الأنواع1، اكتسبت العلماء رؤى عميقة في كيف تتشكل السمات تقحم في الاستجابة للضغوط البيئية والإيكولوجية المحددة، وبفضل الكهف الكائنات الحية2. تترا المكسيكية، ألف مكسيكي، يتكون من العينين السكان 'السطحية' الأسلاف التي تسكن الأنهار في جميع أنحاء المكسيك وتكساس الجنوبية والسكان معزولة جغرافيا على الأقل 29 نقراً الكهف المشتقة التي تسكن العبرة ديل سييرا و مناطق أخرى من شمال شرق المكسيك3. قد حددت عددا من الصفات المرتبطة بكهف في مكسيكي (أ)، بما في ذلك استهلاك الأوكسجين غيرت، تصبغ، وفقدان للعيون، وغيرت تغذية وتستخدم علفاً للسلوك4،،من56، 7،،من89. ألف مكسيكي ويعرض نموذج قوي للتحقيق بشكل مستقل في آليات التطور متقاربة بسبب تاريخ تطورية محددة تحديداً جيدا، ووصف مفصل للبيئة الإيكولوجية، والوجود تطور الكهف السكان10،11. العديد من الصفات المشتقة من الكهوف التي موجودة في كافيفيش، بما في ذلك فقدان العين، النوم فقدان، زيادة التغذية وفقدان التعليم المدرسي، وخفض العدوان، وخفض الإجهاد الاستجابات، تطورت عدة مرات من خلال أصول مستقلة، وكثيراً ما تستخدم مسارات مختلفة الوراثية بين الكهوف8،،من1213،،من1415. وكرر هذا تطور جانبا قوية لنظام مكسيكي (أ) ويمكن أن توفر قد قلق أعمق لمسألة أعم من النظم الوراثية كيف لتوليد تعمل مماثلة.
في حين اقتصر تطبيق التكنولوجيا الوراثية للتحقيق آليا في وظيفة الجينات في العديد من أنواع الأسماك (بما في ذلك (أ) مكسيكي)، التقدم الذي أحرز مؤخرا في الزرد توفر أساسا لتطوير التكنولوجيا الوراثية في الأسماك 16،17،18،19،20. العديد من أدوات تستخدم على نطاق واسع في الزرد للتلاعب بالجينات، وقد تم توحيد تنفيذ هذه الإجراءات منذ فترة طويلة. على سبيل المثال، حقن morpholino أوليجوس (MOs) في مرحلة وحيدة الخلية بشكل انتقائي كتل الجيش الملكي النيبالي ويمنع الترجمة لنافذة زمنية قصيرة خلال التنمية21،22. وبالإضافة إلى ذلك، نهج تحرير الجينات، مثل تجمع بانتظام إينتيرسباسيد يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)/المرتبطة كريسبر البروتين 9 (Cas9) والنسخ الشبيهة بالمنشط المستجيب نوكلاس (TALEN)، التي تسمح لتوليد المعرفة الحذف أو، في بعض الحالات، عمليات الإدراج عن طريق جزئ في جينومات19،20،،من2324. يتم استخدام ترانسجينيسيس التعامل مع التعبير الجيني مستقرة أو الدالة بطريقة محددة من نوع خلية. ويستخدم النظام Tol2 فعالة لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا عن طريق كوينجيكتينج ترانسبوساسي مرناً مع بلازميد الحمض النووي Tol2 التي تحتوي على25،التحوير26. ويستخدم نظام Tol2 ترانسبوساسي Tol2 من الميداكا لتوليد الملاحق germline مستقرة من construct17 المعدلة وراثيا. ينطوي على توليد الوراثي Tol2 كوينجيكتينج بلازميد يحتوي على التحوير محاط بمواقع التكامل Tol2 ومرناً ل Tol2 ترانسبوساسي17. وقد استخدم هذا النظام لإنشاء صفيف خطوط معدلة وراثيا في الزرد واستعماله اتسع مؤخرا لنظم نموذجية طارئة إضافية، بما في ذلك cichlids، killifish، ستيكليباك، وفي الآونة الأخيرة، كافيفيش المكسيكية27، 28,29,30.
في حين كافيفيش نظام بيولوجي رائعة لتوضيح آليات التطور سمة، قد لا تم تسخير قدرتها الكاملة كنموذج تطوري تماما. لقد كان هذا جزئيا بسبب عدم قدرة على التعامل مع الوراثية والخلوية تعمل مباشرة31. تم التعرف على الجينات مرشح تنظيم السمات المعقدة باستخدام السمات الكمية المكاني (QTL) دراسات، ولكن تم التحقق من هذه الجينات المرشحة صعبة32،33،34. في الآونة الأخيرة، ضربة قاضية عابر باستخدام مورفولينوس، الجينات تحرير باستخدام نظم كريسبر و TALEN، واستخدام Tol2-ترانسجينيسيس الوساطة قد استخدمت للتحقيق أساسا الوراثية الكامنة وراء عدد من الصفات35،36،37 ،38. تنفيذ وتوحيد هذه التقنيات تسمح بالتلاعب باستجواب الأسس الجزيئية والعصبية للصفات البيولوجية، بما في ذلك التلاعب بوظيفة الجينات، ووسم السكان خلية محددة، و التعبير عن الصحفيين الوظيفية. بينما قد ثبت التنفيذ الناجح لهذه الأدوات الجينية للتلاعب بالجينات أو وظيفة الخلوية في نظم نموذجية ناشئة، يزال يفتقر إلى بروتوكولات مفصلة في ألف مكسيكي.
ألف مكسيكي التبصير الحرجة على آليات التطور في الاستجابة لبيئة متغيرة ويقدم الفرصة لتحديد الجينات الجديدة التي تنظم مختلف الصفات. هناك عدد من العوامل تشير إلى أن ألف مكسيكي نموذجا بالغ المرونة لتطبيق المنشأة الجينوم الأدوات المتاحة حاليا في النماذج الوراثية المتبعة، بما في ذلك القدرة على بسهولة الحفاظ على الأسماك في المختبرات، كبيرة الحجم الحضنة، الشفافية وتسلسل الجينوم، وفحوصات سلوكية محددة39. وهنا يصف لنا منهجية لاستخدام مورفولينوس، ترانسجينيسيس، وتحرير الجينات في سكان سطح، وكهف مكسيكي (أ). التطبيق الأوسع نطاقا لهذه الأدوات في مكسيكي (أ) سيسمح بإجراء تحقيق آليا في العمليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الفوارق التنموية والفسيولوجية والسلوكية بين كافيفيش والأسماك السطحية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

الحيوانات كهف توفير نظام مقنعة للتحقيق في آليات تطورية والأسس الوراثية الكامنة وراء التغييرات في العديد من الصفات المعقدة، بما في ذلك ضمور العين، المهق، وفقدان النوم، هايبرفاجيا، وتجهيز الحسية. عرض الأنواع من كافيفيش من جميع أنحاء العالم بتطور متقاربة من الصفات المورفولوجية والسلوكية بسبب الضغوط البيئية المشتركة بين النظم المختلفة كهف. وقد درست الأنواع المتنوعة من كهف في إعداد مختبر. تترا المكسيكية، أستياناكس مكسيكي، مع أشكال المبصرين والمكفوفين، وقدمت أفكاراً فريدة من نوعها في العمليات البيولوجية والجزيئية الكامنة وراء تطور السمات المعقدة ويستعد جيدا كنظام نموذجي ناشئة. بينما تم تحديد الجينات مرشح تنظيم تطور العمليات البيولوجية المتنوعة في ألف مكسيكي، القدرة على التحقق من صحة للجينات الفردية دوراً محدودا. تطبيق ترانسجينيسيس وتكنولوجيا الجينات تحرير لديه القدرة للتغلب على هذا العائق الكبير والتحقيق الآليات الكامنة وراء تطور السمات المعقدة. وهنا يصف لنا منهجية مختلفة للتلاعب بالجينات في ألف مكسيكي. تشمل نهج استخدام مورفولينوس، ترانسجينيسيس Tol2 ، ونماذج نظم تحرير الجينات والزرد المستخدمة عادة في الأسماك الأخرى، التعامل مع وظيفة الجينات في ألف مكسيكي. تتضمن هذه البروتوكولات وصفاً مفصلاً لتربية توقيت الإجراءات، وجمع البويضات المخصبة، والحقن، واختيار الحيوانات المحورة وراثيا. سوف تسمح هذه الأساليب المنهجية لتحقيق الآليات العصبية والوراثية الكامنة وراء تطور الصفات المتنوعة في ألف مكسيكي.

إظهار عدة السكان تعيش في كهف مكسيكي (أ) انخفاض النوم واليقظة/النشاط المتزايد بالنسبة إلى على سطح منزل conspecifics14. هيبوكريتين/اوركسين (هكرت) هو neuropeptide مصانة عالية، مما يعمل على زيادة اليقظة، وتسبب الانحرافات في مسار هكرت الخدار في البشر وغيرها من الثدييات48<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

يمكننا وصف النهج للتلاعب بالجينات في النظام النموذجي التطوري مكسيكي أستياناكس. ويرد وصف ثلاث تقنيات مختلفة: ترانسجينيسيس Tol2 بوساطة، وتستهدف التلاعب جينوم استخدام كريسبر/Cas9، وضربه قاضية للتعبير باستخدام مورفولينوس. وينبغي تيسير هذه الأدوات التحقيق المباشر للجينات الكامنة وراء الاختلاف بين أشكال السطح والكهوف السكنية.

التلاعب بالجينات الدالة في كافيفيش المكسيكي

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

توفر الكهف نظامًا مقنعًا للتحقيق في الصفات المورفولوجية والتنموية والسلوكية المتنوعة. ولكن أحد العوامل المقيدة في إنشاء هذا النظام النموذجي هو نقص الأدوات الوراثية التي من شأنها أن تسمح لنا بالتلاعب بوظيفة الجينات. هنا نبرهن على ثلاثة نهج مختلفة للتلاعب في وظيفة الجينات في أسماك الكهوف المكسيكية، Astyanax mexicanus.وستمكن هذه الأدوات من دراسة الجينات الكامنة في الاختلافات الطبيعية بين الأسماك السطحية وسمك الكهوف وكيفية ارتباطها بالنمط الظاهري. بيثاني ستال، موهوبة في مختبري ستوضح هذا الإجراء. قبل البدء في الإجراء، وملء طبق بيتري 100 ملليلتر مع دافئ 3٪ agarose حل في مياه نظام الأسماك ووضع بعناية قالب حقن البيض في agarose في زاوية 45 درجة، قبل خفض ببطء القالب في agarose لتجنب محاصرة الهواء تحت القالب.عندما تتوطد agarose، قم بإزالة القالب بعناية ثم تخزين اللوحة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. ثم سحب الإبر من البورسليكات الشعرية الزجاجية وسحب إبرة القطب وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة. في يوم الحقن، استخدم ماصة زجاجية لنقل بيض خلية واحدة إلى لوحة الحقن، وملء ما يصل إلى خمسة صفوف من لوحة الحقن مع 30 إلى 40 بيضة في الصف الواحد.الحفاظ على البيض رطب مع كمية صغيرة من المياه نظام الأسماك. ذوبان Morpholino على الجليد وإعداد محلول الحقن بحيث يتم حقن 400 بيكوغرام من مورفولينو لكل بيضة باستخدام طرف ماصة مايكرولودر طويلة أو إضافة اثنين إلى أربعة مصغرة bolus إلى النهاية. عندما تم تحميل كل من الإبر، واستخدام ملقط لتقليم طول الزائد من نصائح حقن إبرة وجبل الإبرة الأولى في micromanipulator متصلة حاقن دقيق picoliter.ثم، ضع طبق الحقن تحت مجهر تشريح واستخدام micromanipulator لاختراق كل بيضة مع الإبرة قبل حقن نانولتر واحد من محلول حقن مورفولينو مباشرة في صفار. لحقن CRISPR، مزيج 25 picograms من الجيش الملكي النيبالي دليل مع 300 picograms من البروتين كريسبر المرتبطة 9 RNA رسول وحقن اثنين من nanoliters من محلول الحمض النووي الريبي الناتجة في كل جنين كما هو موضح. ل Tol2 transposase و Tol2 يحيط حقن البلازميد، والجمع بين 25 نانوغرام لكل ميكرولتر من TOL2 رسول الجيش الملكي النيبالي مع 25 نانوغرام لكل ميكرولتر من بناء Tol2 plasmid والفينول الأحمر في المياه الخالية من RNase.ثم حقن نانولتر واحد من الحل في كل جنين كما أظهرت للتو. لفحص الحيوانات التي حقنها مورفولينو في حقن بعد أربعة أيام ، اعتمادا على جينة من الفائدة ، تصور يرقات الأسماك تحت مجهر ستيريو لمراقبة النمط الظاهري للحيوانات المحقونة أو سجل الفيديو لقياس السلوك. لفحص لـ CRISPR indels، نقل الأجنة التي حقنها CRISPR في أنابيب PCR واستخراج الحمض النووي وفقا لبروتوكولات استخراج الحمض النووي القياسية لتفاعل سلسلة البوليميراز أو تحليل PCR.لتقييم الطفرات، تشغيل خمسة ميكرولترات من المنتج PCR على جل agarose 3٪ في 70 فولت لمدة ثلاث ساعات. سوف البرية من النوع، والحمض النووي غير المطفرة يؤدي إلى الفرقة متميزة، في حين أن الحمض النووي متحولة سيؤدي إلى عصابة تشويه. كهف مكسيكي حقنت مع مراقبة مورفولينو معارض أكثر بكثير النشاط الحركي وانخفاض النوم على مدى 24 ساعة، مقارنة مع الأسماك السطحية حقنت مع مورفولينو مخفوق.حقن أوريكسين أوريكسين مورفولينو له تأثير ضئيل على النوم في الأسماك السطحية مقارنة بالأسماك التي يتم حقنها بالتحكم. وعلى النقيض من ذلك، فإن نقص السكر أو الاكسين عن طريق حقن مورفولينو له تأثير كبير على النوم في الأسماك التي تعيش في الكهوف، مما يوفر صلة مباشرة بين تعبير أوريكسين أو ما هو المهووس. CRPSR بوساطة mutagenesis من الجين المهق OCA2 في نتائج الأسماك السطحية في بعض الأفراد homozygous لaoca2 البرية من النوع الأليل إيجابية، ويرتبط مع إيواء التصبغ، في حين أن الأفراد الذين لديهم نسختين من الأليل OCA2 OCA2 متحور كريسبر هي المهق، وتوفير صلة مباشرة بين الجين OCA2 متحولة والمهق في أسماك الكهف.حدد F0 'sالجابية لTransgene Tol2 المنقولة إلى الوراء عبر إلى نوع البرية لتوليد خطوط F1 مستقرة. وهذا يتيح حية تصوير الكالسيوم للكشف عن الاختلافات في نشاط الخلايا العصبية، والتوسط التغيرات السلوكية في بيئة الكهف، ووضع الأساس للتعبير عن العديد من transgenes إضافية لتوصيف والتلاعب وظيفة الجينات في المكسيكية. أهم الأشياء التي يجب تذكرها هي تحميل البيض بإحكام على اللوحة ، وتقليم الإبرة بشكل صحيح ، وتحسين الحقن المجهري.بعد نجاح الضربة القاضية الجينية، والتكامل transgene، أو تحرير الجينات كريسبر بوساطة، يمكن استخدام هذه الأسماك لتحليلات النمو والسلوكي ونشاط الدماغ.

manipulation-of-gene-function-in-mexican-cavefish

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

جيل تعطيل الجينات العقدية mutans سلالة دون الجيني الاستنساخ

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

التلاعب في بلويدي في ايليجانس كاينورهابديتيس

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

استزراع والتلاعب بالخلايا Crest العصبي O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

رفع "تترا المكسيكي" مكسيكي أستياناكس لتحليل تعمل بوستلارفال والجامعة-جبل إيمونوهيستوتشيميستري

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

في تطبيق نظام التحكم عن بعد "التلاعب بالتعبير الجيني الذاتية" فيفو

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...