Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

De auteurs bedanken Sunishka Thakur voor haar hulp bij genotypering en beeldvorming van de oca2 mutant vis afgebeeld in Figuur 2. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (NSF) award 1656574 naar A.C.K., NSF award, 1754321, J.K. en A.C.K. en National Institutes of Health (NIH) award R21NS105071 A.C.K. en E.R.D.

1. morfolino oligo ontwerp
Opmerking: A. mexicanus reeksen zijn beschikbaar via het nationale centrum van Biotechnology Information (NCBI) gen en NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), alsook vanuit de Ensembl genoom browser (https://www.ensembl.org). Bij het ontwerpen van een morfolino voor gebruik in beide vormen van oppervlakte - en grot-woning, is het cruciaal voor het identificeren van een genetische variatie tussen de morphs in dit stadium, zodat deze genetische gebieden kunnen ...

Hier, verstrekt wij een methodologie voor het manipuleren van de genfunctie met morpholinos, CRISPR/Cas9 gene bewerken en Transgenese methodologie. De rijkdom van de genetische technologie en het optimaliseren van deze systemen in zebrafish zal waarschijnlijk zorgen voor de overdracht van deze tools in A. mexicanus met gemak52. Recente bevindingen hebben gebruikt deze benaderingen in A. mexicanus, maar ze blijven onderbenutte in het onderzoek van verschillende morfologische, ontw...

Sinds Darwins Origin of Species1, hebben de wetenschappers diepgaande inzichten in hoe eigenschappen evolutionair worden gevormd in reactie op bepaalde milieu- en ecologische druk, dankzij grot organismen2opgedaan. De Mexicaanse tetra, A. mexicanus, bestaat uit eyed voorouderlijke 'oppervlak' populaties die bewonen rivieren in Mexico en Zuid-Texas en van ten minste 29 geografisch geïsoleerde populaties van afgeleide grot morphs bevolken de Sierra del Abra en andere gebieden van Noordoost Mexico3. Een aantal grot-geassocieerde kenmerken zijn geïdentificeerd in A. mexicanus, waaronder veranderde zuurstofverbruik depigmentatie, verlies van ogen en voeding en gedrag4,5,6, foerageren veranderd 7,8,9. A. mexicanus presenteert een krachtig model voor het onderzoek naar mechanismen van convergente evolutie als gevolg van een welomschreven evolutionaire geschiedenis, een gedetailleerde karakterisering van de ecologische omgeving en de aanwezigheid van onafhankelijk geëvolueerd grot populaties10,11. Veel van de grot-afgeleide eigenschappen die aanwezig zijn in cavefish, met inbegrip van verlies van het oog verlies slapen, verhoogde voederen, verlies van scholing, agressie, verminderd en verminderd stress reacties, geëvolueerd zijn meerdere malen door onafhankelijke oorsprong, vaak met behulp van verschillende genetische routes tussen grotten8,12,13,14,15. Dit herhaald evolution is een krachtige aspect van het systeem van A. mexicanus en bieden inzicht in de meer algemene kwestie van hoe genetische systemen voor het genereren van soortgelijke fenotypen kan worden verstoord.
Terwijl de toepassing van genetische technologie voor het mechanistisch onderzoek van de genfunctie heeft is beperkt in vele vissoorten (met inbegrip van A. mexicanus), vormen recente vooruitgang in de zebravis een basis voor de ontwikkeling van de genetische technologie in vis 16,17,18,19,20. Tal van hulpmiddelen worden veel gebruikt in zebrafish te manipuleren van genexpressie en de uitvoering van deze procedures lang zijn gestandaardiseerd. Bijvoorbeeld, de injectie van morfolino oligos (MOs) stadium de eencellige selectief blokkeert RNA en voorkomt de vertaling voor een korte tijd venster tijdens ontwikkeling21,22. Bovendien, bewerken van gene benaderingen, zoals geclusterd regelmatig korte palindromische herhaalt (CRISPR) interspaced / CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) en transcriptie activator-achtige effector nuclease (TALEN), toestaan voor de generatie van gedefinieerde verwijderingen of, in sommige gevallen, invoegingen door middel van een recombinatie in genomes19,,20,,23,24. Transgenese wordt gebruikt voor het manipuleren van stabiele genexpressie of functie in een celtype specifieke wijze. Het Tol2 systeem effectief wordt gebruikt voor het genereren van transgene dieren door coinjecting transposase mRNA met een Tol2 DNA plasmide met een transgenic25,26. Het Tol2 -systeem maakt gebruik van de Tol2 transposase van medaka voor het genereren van stabiele germline inlassingen uit transgene construct17. Genereren van Tol2 transgenics houdt een plasmide met een transgenic geflankeerd door Tol2 integratie sites en mRNA voor Tol2 transposase17coinjecting. Dit systeem is gebruikt voor het genereren van een matrix van transgene lijnen in de zebravis en het gebruik ervan heeft onlangs uitgebreid tot extra opkomende modelsystemen, waaronder cichliden killifish, de stekelbaars, en, meer recentelijk, de Mexicaanse cavefish27, 28,29,30.
Terwijl de cavefish een fascinerende biologische systeem voor informatief mechanismen van trait evolutie is, heeft zijn volledige vermogen als een evolutionaire model niet zijn volledig benut. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een onvermogen om te manipuleren genetische en cellulaire functie direct31. Kandidaat-genen regulering van complexe eigenschappen zijn geïdentificeerd met behulp van kwantitatieve trait loci (QTL) studies, maar de validatie van deze kandidaat-genen is moeilijk32,33,34. Onlangs, voorbijgaande knockdown met behulp van morpholinos, gene bewerken met behulp van systemen voor CRISPR en TALEN en het gebruik van Tol2-gemedieerde Transgenese zijn gebruikt voor het onderzoeken van de genetische basis ten grondslag liggen aan een aantal eigenschappen35,36,37 ,38. De uitvoering en de standaardisatie van deze technieken zal toestaan voor manipulaties die ondervragen van de moleculaire en neurale basis van biologische eigenschappen, met inbegrip van de manipulatie van de genfunctie, de etikettering van gedefinieerde cel populaties, en de expressie van functionele verslaggevers. Overwegende dat de succesvolle tenuitvoerlegging van deze genetische hulpprogramma's voor het manipuleren van genen of cellulaire functie is aangetoond in opkomende modelsystemen, zijn gedetailleerde protocollen nog steeds ontbreekt in A. mexicanus.
A. mexicanus kritisch inzicht geven in de mechanismen van de evolutie in antwoord op een veranderende omgeving en presenteren van de mogelijkheid om nieuwe genen regulering van diverse eigenschappen te identificeren. Een aantal factoren suggereren dat A. mexicanus een uiterst hanteerbare model is voor de toepassing van gevestigde genomic instrumentarium momenteel in gevestigde genetische modellen, inclusief de mogelijkheid om de vis in de laboratoria, groot brood formaat, gemakkelijk te onderhouden transparantie, een gesequenceerd genoom en gedefinieerde gedrags assays39. Hier beschrijven we een methodologie voor het gebruik van morpholinos, Transgenese en gene bewerken in oppervlakte en grot populaties van A. mexicanus. De bredere toepassing van deze instrumenten in A. mexicanus zal zorgen voor een mechanistisch onderzoek naar de moleculaire processen die ten grondslag liggen aan de evolutie van ontwikkelingsstoornissen, fysiologische en gedragsmatige verschillen tussen cavefish en oppervlakte vissen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

Grot dieren vormen een dwingende systeem voor onderzoek naar de evolutionaire mechanismen en genetische basis ten grondslag liggen aan veranderingen in talrijke complexe eigenschappen, met inbegrip van oog degeneratie, albinisme slaap verlies, hyperphagia en zintuiglijke verwerking. Soorten cavefish van over de hele wereld weergeven een convergente evolutie van morfologische en gedrags eigenschappen als gevolg van gedeelde belasting van het milieu tussen verschillende grot systemen Divers grot soorten hebben onderzocht in het laboratorium-omgeving. De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus, met slechtzienden en blinden vormen, heeft unieke inzicht in biologische en moleculaire processen die ten grondslag liggen aan de evolutie van complexe eigenschappen en is goed klaar als een opkomende modelsysteem. Terwijl in A. mexicanus kandidaat-genen regulering van de evolutie van de verschillende biologische processen zijn vastgesteld, is de mogelijkheid voor het valideren van een rol voor afzonderlijke genen beperkt gebleven. De toepassingvan Transgenese en bewerken van gen technologie heeft het potentieel om te overwinnen deze aanzienlijke belemmering en te onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de evolutie van complexe eigenschappen. Hier beschrijven we een andere methode voor het manipuleren van genexpressie in A. mexicanus. Benaderingen omvatten het gebruik van morpholinos, Tol2 Transgenese, en gen-editing systemen, gebruikte in zebrafish en andere vissen huizen modellen, te manipuleren van de genfunctie in A. mexicanus. Deze protocollen bevatten gedetailleerde beschrijvingen van getimede fokken procedures, de collectie van bevruchte eieren, injecties en de selectie van genetisch gemodificeerde dieren. Voor het onderzoek naar de genetische en neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de evolutie van de diverse eigenschappen in A. mexicanustoestaat deze methodologische benaderingen.

Meerdere populaties van grot-woning A. mexicanus Toon verminderde slaap en verhoogde wakkerheid/activiteit ten opzichte van hun oppervlakte-woning soortgenoten14. Hypocretin/orexine (HCRT) is een zeer geconserveerde neuropeptide, die fungeert toe wakker, en afwijkingen in de HCRT-pathway narcolepsie veroorzaken bij mensen en andere zoogdieren47,48. Wij hebben eerder aangetoond dat grot A. mexicanus gestegen expressie van ...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

We beschrijven benaderingen voor het manipuleren van genen in het evolutionair modelsysteem Astyanax mexicanus. Drie verschillende technieken worden beschreven: Tol2-gemedieerde Transgenese, gerichte manipulatie van het genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en knockdown van meningsuiting met behulp van morpholinos. Deze hulpmiddelen moeten vergemakkelijken het directe onderzoek van genen die ten grondslag liggen aan de variatie tussen oppervlak - en grot-woning vormen.

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Grotdieren bieden een overtuigend systeem voor het onderzoeken van diverse morfologische, ontwikkelings- en gedragskenmerken. Maar een van de beperkende factoren bij het opzetten van dit modelsysteem is een gebrek aan genetische hulpmiddelen die ons in staat zouden stellen om de genfunctie te manipuleren. Hier tonen we drie verschillende benaderingen om de genfunctie te manipuleren in de Mexicaanse grotvis, Astyanax mexicanus.Deze instrumenten zullen het onderzoek mogelijk maken van de genen die ten grondslag liggen aan natuurlijke variaties tussen oppervlaktevissen en grotvissen en hoe ze zich verhouden tot fenotypes. Bethany Stahl, een getalenteerde postdoc in mijn laboratorium zal deze procedure aantonen. Voordat u met de procedure begint, vult u een petrischaaltje van 100 milliliter met warme 3%-agarose die is opgelost in het water van het vissysteem en plaats u voorzichtig een eispuitvormer in de agarose in een hoek van 45 graden, voordat u de mal langzaam in de agarose verlaagt om te voorkomen dat er lucht onder de mal wordt gevangen.Wanneer de agarose is gestold, verwijder voorzichtig de mal dan bewaar de plaat op vier graden Celsius voor maximaal een week. Trek vervolgens naalden uit borosilicaat glas haarvaten en een elektrode naald trekker volgens de richtlijnen van de fabrikant. Gebruik op de dag van de injectie een glazen pipet om eencellige eieren in de injectieplaat over te brengen en tot vijf rijen van de injectieplaat te vullen met 30 tot 40 eieren per rij.Houd de eieren gehydrateerd met een kleine hoeveelheid vissysteem water. Ontdooi Morpholino op ijs en bereid de injectieoplossing voor zodat 400 picogrammen Morpholino per ei worden geïnjecteerd met behulp van een lange Microloader pipetpunt of het toevoegen van een twee tot vier microliter bolus aan het einde. Wanneer alle naalden zijn geladen, gebruik tangen om de overtollige lengte van de injectie naald tips trimmen en monteer de eerste naald in een micromanipulator aangesloten op een picoliter microinjector.Plaats vervolgens de injectieschotel onder een ontledende microscoop en gebruik de micromanipulator om elk ei met de naald binnen te dringen voordat u een nanoliter Morpholino-injectieoplossing rechtstreeks in de dooier injecteert. Voor CRISPR-injectie meng je 25 picogrammen van gidsRNA met 300 picogrammen van CRISPR-geassocieerd eiwit 9 messenger RNA en injecteer je twee nanoliters van de resulterende RNA-oplossing in elk embryo, zoals aangetoond. Voor Tol2 transposase en Tol2 geflankeerde plasmide injectie, combineren 25 nanogram per microliter van Tol2 messenger RNA met 25 nanogram per microliter van Tol2 plasmid construeren en fenol rood in RNase-vrij water.Injecteer dan een nanoliter oplossing in elk embryo zoals net aangetoond. Om de door Morpholino geïnjecteerde dieren te screenen op vier dagen na injectie, afhankelijk van het gen van belang, visualiseren de vislarven onder een stereomicroscoop om het fenotype van de geïnjecteerde dieren of video-record te observeren om gedrag te meten. Om te screenen op CRISPR-indels, breng je CRISPR-geïnjecteerde embryo's over in PCR-buizen en haal je het DNA eruit volgens de standaard DNA-extractieprotocollen voor polymerasekettingreactie of PCR-analyse.Om te beoordelen op mutagenesis, draaien vijf microliters van het PCR-product op een 3%agarose gel op 70 volt gedurende drie uur. Wild-type, niet-mutagenized DNA zal resulteren in een aparte band, terwijl mutant DNA zal resulteren in een smeary band. Grot Een mexicanus geïnjecteerd met een controle Morpholino vertoont aanzienlijk meer bewegingsactiviteit en verminderde slaap gedurende een periode van 24 uur, in vergelijking met oppervlaktevissen geïnjecteerd met een roerei Morpholino.De injectie van de hypocretine orexin Morpholino heeft weinig effect op de slaap in oppervlaktevissen in vergelijking met controle-geïnjecteerde vissen. Hypocretine ofexine-knockdown via Morpholino-injectie heeft daarentegen een significant effect op de slaap in grotvissen, waardoor een direct verband wordt gelegd tussen hypocretine ofexinexpressie en slaapverlies. CRPSR-gemedieerde mutagenese van het albinismegen OCA2 in oppervlaktevissen resulteert in sommige individuen homozygoot voor het wilde OCA2-positieve allel, en wordt geassocieerd met het herbergen van pigmentatie, terwijl individuen die twee kopieën van het CRISPR-gemuteerde OCA2-negatieve allel hebben albino zijn, wat een direct verband legt tussen het gemuteerde OCA2-gen en albinisme in grotvissen.Selecteer F0's positief voor de Tol2 verzonden transgene terug kruis naar het wilde type om stabiele F1 lijnen te genereren. Dit maakt levende calcium beeldvorming voor het blootleggen van verschillen in neuronale activiteit, bemiddelen gedragsveranderingen in de grot omgeving, het leggen van de basis voor de expressie van vele extra transgenes te karakteriseren en te manipuleren genfunctie in A mexicanus. De belangrijkste dingen om te onthouden zijn om de eieren goed te laden op de plaat, om de naald goed te trimmen, en om de microinjectie te optimaliseren.Na een succesvolle genetische knockdown, transgene integratie, of CRISPR-gemedieerde genbewerking, kunnen deze vissen worden gebruikt voor ontwikkelings-, gedrags- en hersenactiviteitsanalyses.

manipulation-of-gene-function-in-mexican-cavefish

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipulatie van ploïdie in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

Kweken en manipulatie van O9-1 neurale kamcellen

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

De Mexicaanse Tetra Astyanax mexicanus in te zamelen voor de analyse van de fenotypen van de Post-larval en geheel-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...