Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
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Die Autoren danken für ihre Unterstützung bei der Genotypisierung und imaging der oca2 mutierte Fische in Abbildung 2dargestellten Sunishka Thakur. Diese Arbeit wurde durch die National Science Foundation (NSF) 1656574, A.C.K, NSF Award 1754321, j.k. und A.C.K, und National Institute of Health (NIH) Award R21NS105071 A.C.K und E.R.D. unterstützt.

1. Morpholino Oligo design
Hinweis: Sequenzen für A. Mexicanus sind durch National Center of Biotechnology Information (NCBI) gen und NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), sowie aus dem Ensembl Genome Browser (https://www.ensembl.org) erhältlich. Wenn Sie eine Morpholino für den Einsatz in beiden Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen zu entwerfen, ist es wichtig, identifizieren genetische Abweichungen zwischen dem Morphs in diesem Stadium, so dass diese genetische Regionen als...

Hier haben wir eine Methodik für die Manipulation der Genfunktion mit Morpholinos, CRISPR/Cas9 gen bearbeiten und Transgenese Methodik. Der Reichtum der Gentechnologie und der Optimierung dieser Systeme im Zebrafisch ermöglicht es wahrscheinlich für die Übertragung dieser Werkzeuge in A. Mexicanus mit Leichtigkeit52. Neueste Erkenntnisse haben diese Ansätze in A. Mexicanusverwendet, aber sie bleiben nicht ausgelastete bei der Untersuchung der vielfältigen morphologischen, E...

Seit Darwins Origin of Species1haben Wissenschaftler gewonnen tiefe Einblicke in wie Züge als Reaktion auf definierte Umwelt- und ökologischen Druck dank Höhle Organismen2evolutionär geprägt sind. Die mexikanische Tetra, A. Mexicanus, besteht aus Augen Vorfahren "Oberfläche" Populationen, die bewohnen Flüsse in ganz Mexiko und Süd-Texas und mindestens 29 geografisch isolierten Populationen von abgeleiteten Höhle Morphs bewohnen die Sierra del Abra und andere Bereiche des nordöstlichen Mexiko3. In A. Mexicanus, einschließlich der veränderten Sauerstoffverbrauch, Depigmentierung, Verlust der Augen und veränderte Ernährung und Nahrungssuche Verhalten4,5,6wurde eine Reihe von Höhle-assoziierten Eigenschaften ermittelt, 7,8,9. A. Mexicanus präsentiert ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung von Mechanismen der konvergente Entwicklung durch eine klar definierte Evolutionsgeschichte, eine detaillierte Charakterisierung der ökologischen Umwelt und das Vorhandensein von unabhängig Höhle entwickelt Bevölkerung10,11. Viele der Höhle-abgeleitete Merkmale, die in Cavefish, einschließlich Auge Verlust vorliegen, schlafen Verlust, erhöht, Fütterung, Verlust des Schulens, Aggression, reduziert und verringert Stressreaktionen, entstanden mehrere Male durch unabhängige Ursprünge, oft unter Verwendung verschiedenen genetischen Wege zwischen Höhlen8,12,13,14,15. Dies wiederholt Evolution ist ein starker Aspekt des A. Mexicanus Systems und bieten Einblick in die allgemeinere Frage wie genetische Systeme gestört werden kann, um ähnliche Phänotypen zu generieren.
Während die Anwendung der Gentechnik für die mechanistische Untersuchung der Genfunktion in vielen Fischarten (einschließlich A. Mexicanus) begrenzt worden, bilden die jüngsten Fortschritte in der Zebrabärbling eine Grundlage für genetische Technologieentwicklung in Fisch 16,17,18,19,20. Zahlreiche Werkzeuge sind weit verbreitet im Zebrafisch, um Genexpression zu manipulieren, und die Durchführung dieser Verfahren lange standardisiert wurden. Z. B. die Injektion von Morpholino Oligos (MOs) im Einzel-Zell-Stadium selektiv RNA blockiert und verhindert Übersetzung für einen kurzen zeitlichen Fenster während Entwicklung21,22. Darüber hinaus bearbeiten von gen Ansätze, wie z. B. regelmäßig gruppierten dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9) und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nuklease (TALEN), ermöglichen die Erzeugung von definierten Löschungen oder, in einigen Fällen Einfügungen durch Rekombination in Genome19,20,23,24. Transgenese wird verwendet, um stabile Genexpression oder Funktion in einem Zelltyp spezifische Weise zu manipulieren. Das Tol2 System wird effektiv verwendet, um transgene Tiere zu erzeugen, indem coinjecting Transposase mRNA mit einem Tol2 DNA Plasmid enthält ein Transgen25,26. Das Tol2 -System nutzt die Tol2 Transposase von Medaka, stabile Keimbahn Einfügungen von transgenen construct17 zu generieren. Generierung von Tol2 transgene beinhaltet ein Plasmid enthält ein Transgen, flankiert von Tol2 Integration Websites und mRNA für Tol2 Transposase17coinjecting. Dieses System wurde verwendet, um ein Array von transgenen Linien im Zebrafisch generieren und seine Verwendung hat vor kurzem erweitert, um zusätzliche emergent Modellsysteme, einschließlich Cichliden, Killifische, der Stichling und, in jüngerer Zeit, die mexikanische Cavefish27, 28,29,30.
Während die Cavefish eine faszinierende biologische System für erhellendes Mechanismen der Eigenschaft Evolution, hat seine volle Fähigkeit als ein evolutionäres Modell nicht voll genutzt. Dies wurde teilweise aufgrund einer Unfähigkeit, genetische Manipulation und zelluläre Funktion direkt31. Kandidaten-Gene regulieren komplexe Merkmale mit quantitative Trait Loci (QTL) Studien identifiziert worden, aber die Validierung dieser Kandidatengene wurde schwer32,33,34. Vor kurzem, transiente Zuschlag mit Morpholinos, Bearbeitung mit CRISPR und TALEN Systemen und die Verwendung von Tol2gen-vermittelten Transgenese wurden verwendet, um die genetische Basis zugrunde liegt eine Reihe von Eigenschaften35,36, 37untersuchen ,38. Die Implementierung und Standardisierung dieser Techniken erlaubt für Manipulationen, die molekularen und neuronalen Grundlagen biologischer Merkmale, einschließlich der Manipulation der Genfunktion, die Kennzeichnung der definierten Zellpopulationen zu verhören und der Ausdruck des funktionalen Reporter. Während die erfolgreiche Umsetzung dieser genetischen Werkzeuge zu manipulieren-gen oder zelluläre Funktion bei emergent Modellsysteme nachgewiesen wurde, fehlen detaillierte Protokolle noch in A. Mexicanus.
A. Mexicanus kritischen Einblick in die Mechanismen der Evolution als Reaktion auf ein verändertes Umfeld und präsentieren die Möglichkeit, neuartige Gene regulieren vielfältige Merkmale zu identifizieren. Eine Reihe von Faktoren legen nahe, dass A. Mexicanus ein äußerst gefügig Modell ist für die Anwendung von etablierten genomische derzeit verfügbaren Tools in etablierten genetischen Modellen, einschließlich der Möglichkeit, Fisch in den Labors Brut Größe einfach zu pflegen, Transparenz, eine sequenzierte Genom und definierten Verhaltensstörungen Assays39. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Nutzung der Morpholinos, Transgenese und gen bearbeiten in Oberfläche und Höhle Populationen von A. Mexicanus. Die breitere Anwendung dieser Werkzeuge in A. Mexicanus ermöglicht eine mechanistische Untersuchung der molekularen Prozesse zugrunde liegen die Entwicklung von Entwicklungsstörungen, physiologischen und verhaltensbezogenen Unterschiede zwischen Cavefish und Oberfläche Fischen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

Höhle Tiere liefern ein überzeugendes System zur Erforschung der Evolutionsmechanismen und genetischen Grundlagen zugrunde liegenden Veränderungen in zahlreichen komplexen Eigenschaften, einschließlich Auge Degeneration, Albinismus, Schlafmangel, Hyperphagie und sensorischen Verarbeitung. Arten von Cavefish aus der ganzen Welt zeigen eine konvergente Entwicklung der morphologischen und verhaltensbezogene Merkmale aufgrund gemeinsamer Umweltbelastungen zwischen verschiedenen Höhlensysteme. Diverse Höhle Arten wurden in der Laborumgebung untersucht. Die mexikanische Tetra, Astyanax Mexicanus, mit sehenden und blinden Formen, einzigartige Einblicke in biologischen und molekularen Prozesse, die die Entwicklung von komplexen Eigenschaften zugrunde liegen und wird gut balanciert, als eine aufstrebende Modellsystem. Während Kandidatengene reguliert die Entwicklung der vielfältigen biologischen Prozessen in A. Mexicanus identifiziert wurden, wurde die Möglichkeit zur Validierung für einzelne Gene einer Rolle beschränkt. Die Anwendung der Transgenese und Bearbeitung von Gen-Technologie hat das Potenzial, diese erhebliche Behinderung zu überwinden und die Mechanismen der Evolution komplexe Merkmale zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine andere Methode zur Bearbeitung von Genexpression in A. Mexicanus. Ansätze umfassen die Verwendung von Morpholinos, Tol2 Transgenese und gen-editing-Systeme, häufig verwendete im Zebrafisch und andere Fische Modelle Genfunktion in A. Mexicanuszu manipulieren. Diese Protokolle enthalten detaillierte Beschreibungen der zeitgesteuerten Zucht Verfahren, die Sammlung von befruchteten Eiern, Injektionen und die Auswahl von gentechnisch veränderten Tieren. Diese methodische Ansätze ermöglicht die Untersuchung der genetischen und neuronalen Mechanismen der Evolution der vielfältigen Eigenschaften in A. Mexicanus.

Mehrere Populationen von höhlenbewohnenden A. Mexicanus zeigen weniger Schlaf und Wachsein/Überaktivität im Verhältnis zu ihrer Oberfläche lebende Artgenossen14. Hypocretin/Orexin (HCRT) ist eine hoch konservierte Neuropeptid, die wirkt, um Wachsamkeit zu erhöhen, und Fehlentwicklungen im HCRT Weg führen Narkolepsie bei Menschen und anderen Säugetieren47,48. Wir haben bereits bewiesen, der Höhle A. Mexicanus gest...

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Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Höhlentiere bieten ein überzeugendes System zur Untersuchung verschiedener morphologischer, entwicklungs- und verhaltensauffälliger Merkmale. Aber einer der begrenzenden Faktoren bei der Etablierung dieses Modellsystems ist der Mangel an genetischen Werkzeugen, die es uns ermöglichen würden, die Genfunktion zu manipulieren. Hier zeigen wir drei verschiedene Ansätze zur Manipulation der Genfunktion im mexikanischen Höhlenfisch Astyanax mexicanus.Diese Werkzeuge werden die Untersuchung der Gene ermöglichen, die natürlichen Variationen zwischen Oberflächenfischen und Höhlenfischen zugrunde liegen, und wie sie sich auf Phänotypen beziehen. Bethany Stahl, eine talentierte Postdoc in meinem Labor wird dieses Verfahren demonstrieren. Vor Beginn des Verfahrens eine 100 Milliliter Petrischale mit warmen 3%Agarose in Fischsystemwasser gelöst füllen und sorgfältig eine Eispritzform in die Agarose in einem 45-Grad-Winkel legen, bevor sie langsam die Form in die Agarose senken, um zu vermeiden, dass Luft unter der Form gefangen wird.Wenn die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie vorsichtig die Form und lagern Sie die Platte dann bei vier Grad Celsius für bis zu einer Woche. Ziehen Sie dann Nadeln aus Borosilikatglaskapillaren und einem Elektrodennadelzieher nach den Richtlinien des Herstellers. Verwenden Sie am Tag der Injektion eine Glaspipette, um einzellige Eier in die Injektionsplatte zu geben und bis zu fünf Reihen der Injektionsplatte mit 30 bis 40 Eiern pro Reihe zu füllen.Halten Sie die Eier hydratisiert mit einer kleinen Menge Fischsystem Wasser. Morpholino auf Eis auftauen und die Injektionslösung so vorbereiten, dass 400 Piktogrammmorpholino pro Ei mit einer langen Microloader-Pipettespitze injiziert oder am Ende einen zwei bis vier Mikroliter Bolus hinzugefügt wird. Wenn alle Nadeln geladen sind, verwenden Sie Zangen, um die überschüssige Länge von den Injektionsnadelspitzen zu trimmen und die erste Nadel in einen Mikromanipulator zu montieren, der mit einem Picoliter-Mikroinjektor verbunden ist.Legen Sie dann die Injektionsschale unter ein Sezierendes Mikroskop und verwenden Sie den Mikromanipulator, um jedes Ei mit der Nadel zu durchdringen, bevor Sie einen Nanoliter Morpholino-Injektionslösung direkt in das Eigelb injizieren. Mischen Sie für die CRISPR-Injektion 25 Piktogramme Guide-RNA mit 300 Piktogrammen CRISPR-assoziierter Protein-9-Boten-RNA und injizieren Sie zwei Nanoliter der resultierenden RNA-Lösung in jeden Embryo, wie gezeigt. Für Tol2-Transposase und Tol2-flankierte Plasmid-Injektion, kombinieren Sie 25 Nanogramm pro Mikroliter Tol2 Boten-RNA mit 25 Nanogramm pro Mikroliter Tol2-Plasmid-Konstrukt und Phenolrot in RNase-freiem Wasser.Dann injizieren Sie einen Nanoliter Lösung in jeden Embryo, wie gerade gezeigt. Um die Morpholino-injizierten Tiere an vier Tagen nach der Injektion zu untersuchen, je nach dem Gen von Interesse, visualisieren Sie die Fischlarven unter einem Stereomikroskop, um den Phänotyp der injizierten Tiere oder Videoaufzeichnungen zu beobachten, um das Verhalten zu messen. Um CRISPR-Indels zu prüfen, übertragen Sie CRISPR-injizierte Embryonen in PCR-Röhren und extrahieren Sie die DNA gemäß den Standard-DNA-Extraktionsprotokollen für Polymerase-Kettenreaktion oder PCR-Analyse.Um die Mutagenese zu bewerten, führen Sie fünf Mikroliter des PCR-Produkts drei Stunden lang auf einem 3%agarose Gel bei 70 Volt aus. Wilde, nicht-mutagenisierte DNA führt zu einem eindeutigen Band, während mutierte DNA zu einem schmierigen Band führt. Höhle Ein Mexicanus, der mit einer Kontrolle injiziert wird, weist eine deutlich mehr bewegungsmotorische Aktivität auf und reduziert den Schlaf über einen Zeitraum von 24 Stunden im Vergleich zu Oberflächenfischen, die mit einem Rührmorpholino injiziert werden.Die Injektion des Hypocretin-Orexins Morpholino hat im Vergleich zu kontrolliert injizierten Fischen wenig Einfluss auf den Schlaf in Oberflächenfischen. Im Gegensatz dazu, Hypocretin Orexin Knockdown über Morpholino Injektion hat eine signifikante Wirkung auf den Schlaf in Höhlen-Wohnung Fisch, bietet einen direkten Zusammenhang zwischen Hypocretin Orexin Ausdruck und Schlafverlust. CRPSR-vermittelte Mutagenese des Albinismus-Gens OCA2 in Oberflächenfischen führt zu einigen Individuen homozygot für den Wildtyp OCA2-Positivallel und ist mit der Pigmentierung verbunden, während Personen, die zwei Kopien des CRISPR-mutierten OCA2-Negativalleels haben, Albino sind, was eine direkte Verbindung zwischen dem mutierten OCA2-Gen und dem Albinismus in der Fischhöhle bietet.Wählen Sie F0 s positiv für die Tol2 übertragentransgene zurück zum Wild-Typ, um stabile F1-Linien zu generieren. Dies ermöglicht lebende Kalzium-Bildgebung zur Aufdeckung von Unterschieden in der neuronalen Aktivität, die Vermittlung von Verhaltensänderungen in der Höhlenumgebung und die Schaffung der Grundlage für die Expression vieler zusätzlicher Transgene zur Charakterisierung und Manipulation der Genfunktion in A mexicanus. Die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, sind, die Eier fest auf den Teller zu laden, die Nadel richtig zu trimmen und die Mikroinjektion zu optimieren.Nach einem erfolgreichen genetischen Knockdown, Transgenintegration oder CRISPR-vermittelter Genbearbeitung können diese Fische für Entwicklungs-, Verhaltens- und Hirnaktivitätsanalysen verwendet werden.

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Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Forschung

Genetik

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipulation der Diploidie in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

Kultivierung und Manipulation von Zellen der Neuralleiste O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...