Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

המחברים מודים Sunishka טהאקור על לה סיוע genotyping והדמיה הדג מוטציה oca2 מתואר באיור2. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית (NSF) פרס 1656574 A.C.K. פרס ה-NSF 1754321 J.K., A.C.K., פרס לאומי מכונים לבריאות (NIH) R21NS105071 A.C.K., E.R.D.

1. מורפולינו oligo עיצוב
הערה: רצפי mexicanus א זמינים דרך המרכז הלאומי של מידע ביוטכנולוגיה (NCBI) ג'ין NCBI ההזמנות (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), כמו גם מהדפדפן הגנום Ensembl (https://www.ensembl.org). בעת עיצוב של מורפולינו לשימוש בשתי צורות השטח - ואת מערת המגורים, חיוני כדי לזהות כל וריאציה גנטית בין morphs בש?...

כאן, אנחנו מסופקים מתודולוגיה מניפולציה ג'ין פונקציה באמצעות morpholinos, CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה מתודולוגיה transgenesis. העושר של טכנולוגיה גנטית ואופטימיזציה של מערכות אלה דג זברה סביר יאפשר העברת מכלים אלה לתוך mexicanus א עם נוחות52. הממצאים האחרונים השתמשו גישות אלה ב- mexicanus א, אך הם נ...

מאז מוצא המיניםשל דרווין1, מדענים זכו תובנות עמוקות כמה תכונות הם בצורת אבולוציונית בתגובה מוגדר לחצים סביבתית ואקולוגית, בזכות מערת אורגניזמים2. טטרה מקסיקנית, mexicanus א, מורכב של אוכלוסיות 'משטח' אב קדמון eyed המאכלסים נהרות ברחבי מקסיקו בדרום טקסס ושל אוכלוסיות מבודדת מבחינה גיאוגרפית לפחות 29 של מערת נגזר morphs המאכלסים את אברה דל סיירה, באזורים אחרים של צפון-מזרח מקסיקו3. מספר תכונות הקשורות מערת זוהו mexicanus א, כולל צריכת החמצן מסולף, depigmentation, אובדן של העיניים, ושינינו האכלה, שיחור מזון התנהגות4,5,6, 7,8,9. מתנות mexicanus א במודל רב עוצמה עבור חוקרים מנגנונים של אבולוציה מתכנסת היסטוריה אבולוציונית מוגדרים היטב, אפיון מפורט של הסביבה האקולוגית וכתוצאה הנוכחות באופן עצמאי התפתחו המערה אוכלוסיות10,11. רבים מן התכונות הנגזרות למערה נמצאים ב- cavefish, כולל אובדן עינו, לישון אובדן, גדל האכלה, אובדן של בתי הספר, להפחית תוקפנות, ו מופחתת תגובות הלחץ, התפתחו מספר פעמים דרך מקורות עצמאיים, לעיתים קרובות ניצול מסלולים גנטיים שונים בין מערות8,12,13,14,15. זה חוזר על עצמו האבולוציה הוא היבט רב עוצמה של מערכת mexicanus א , מספקים תובנה השאלה כללית יותר של מערכות איך גנטי עשוי להיות מוטרד כדי להפיק דומה פנוטיפים.
בעת היישום של טכנולוגיה גנטיים מכניסטית חקירת פונקציה ג'ין הגביל ב מיני דגים רבים (כולל mexicanus א), התפתחויות אחרונות דג זברה לספק בסיס לפיתוח טכנולוגיה גנטיות דגים 16,17,18,19,20. כלים רבים נמצאים בשימוש נרחב דג זברה לתמרן ביטוי גנים, היישום של נהלים אלה זמן סטנדרטית. לדוגמה, ההזרקה של מורפולינו oligos (MOs) בשלב תא בודד באופן סלקטיבי חוסם RNA ומונעת תרגום עבור חלון זמן קצר במהלך פיתוח21,22. בנוסף, עריכת ג'ין גישות, כגון מקובצים באופן קבוע interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR) / CRISPR-הקשורים חלבון 9 (Cas9) ותמלול activator דמוי אפקטור נוקלאז (TALEN), לאפשר לדור של מחיקות מוגדר או, במקרים מסוימים, הוספות דרך רקומבינציה הגנום19,20,23,24. Transgenesis משמש כדי לתפעל ביטוי גנים יציב או הפונקציה באופן ספציפי סוג התא. מערכת Tol2 משמש ביעילות כדי ליצור חיות הטרנסגניים מאת coinjecting transposase mRNA עם פלסמיד ה-DNA Tol2 המכילה25,transgene26. מערכת Tol2 מנצל את transposase Tol2 של medaka כדי להפיק germline יציב הוספות של construct17 הטרנסגניים. יצירת Tol2 transgenics כרוך coinjecting של פלסמיד המכיל transgene ולצדו Tol2 ואתרי אינטגרציה mRNA Tol2 transposase17. מערכת זו שימש לייצר מגוון של קווים הטרנסגניים דג זברה ואת השימוש בה התרחב לאחרונה מערכות מודל מתהווים נוספים, כולל cichlids, דגים גמבוזיים, את stickleback, ו, לאחרונה, cavefish מקסיקני27, 28,29,30.
ואילו cavefish היא מערכת ביולוגית מרתק שחקרתי מנגנוני האבולוציה תכונה, יכולת מלאה שלה כמודל אבולוציונית לא היה מלא רתם. זה כבר חלקית בשל חוסר יכולת לתמרן גנטי, הסלולר יפעלו ישירות31. גנים המועמד ויסות תכונות מורכבות זוהו באמצעות תכונה כמותית אתרים כמותיים מחקרים, אך האימות של גנים אלו המועמד היה קשה32,33,34. לאחרונה, נוקאאוט ארעי באמצעות morpholinos, ג'ין עריכה באמצעות מערכות CRISPR ו- TALEN, ואת השימוש Tol2-transgenesis בתיווך שימשו כדי לחקור את הבסיס הגנטי שבבסיס מספר תכונות35,36,37 ,38. יישום והטמעה סטנדרטיזציה של טכניקות אלה יאפשר מניפולציות זה לחקור את הפסיכולוגי עצבית המולקולריים של תכונות ביולוגיות, כולל המניפולציה של תפקוד הגן, תיוג של אוכלוסיות תאים מוגדרים, ו הביטוי של עיתונאים פונקציונלי. ואילו יישום מוצלח של כלים גנטיים אלה לתמרן גן או תפקוד התאים הוכח במערכות דגם מתהווה, פרוטוקולים מפורט עדיין חסרים mexicanus א.
Mexicanus א לספק תובנות מנגנוני האבולוציה בתגובה לסביבה המשתנה הקריטי ולהציג את ההזדמנות כדי לזהות גנים הרומן ויסות תכונות מגוונות. מספר גורמים מראים כי mexicanus א הוא מודל מאוד צייתן להחלת הוקמה גנומית כלי זמין כרגע ויצר מודלים גנטי, כולל את היכולת בקלות לשמור על הדגים במעבדות, גודל שבוחרים גדול, שקיפות, הגנום ברצף וכן מבחני התנהגות מוגדרים39. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לשימוש של morpholinos, transgenesis, ג'ין ועריכה של אוכלוסיית השטח ומערת של mexicanus א. היישום רחבה יותר של כלים אלה ב- mexicanus א יאפשר חקירה מכניסטית התהליכים המולקולרי שבבסיס האבולוציה של הבדלים התפתחותיים, פיזיולוגיים והתנהגותיים בין cavefish לבין משטח דגים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

מערת חיות מספקים מערכת משכנעת על חקירת מנגנונים אבולוציונים ובסיסים הגנטי שבבסיס לשינויים רבים תכונות מורכבות, לרבות ניוון העין, לבקנות, אובדן שינה, hyperphagia, והעיבוד החושי. מינים של cavefish מ ברחבי העולם להציג של אבולוציה מתכנסת של מאפיינים מורפולוגיים והתנהגותיים עקב לחצים סביבתיים משותפים בין מערכות שונות מערה. מערת מגוונת מיני נחקרו בהגדרת מעבדה. טטרה מקסיקנית, Astyanax mexicanus, עם צורות רואי ועיוורת, סיפקה ייחודי תובנות ותהליכי הביולוגי המולקולרי שבבסיס האבולוציה של תכונות מורכבות, שאיזו היטב כמערכת מודל המתעוררים. בעוד גנים המועמד ויסות ההתפתחות של תהליכים ביולוגיים שונים זוהו mexicanus א, היכולת לאמת תפקיד עבור גנים יחידניים הוגבלה. היישום של transgenesis וטכנולוגיה לעריכת ג'ין יש פוטנציאל כדי להתגבר על מכשול משמעותי הזה וכדי לחקור את המנגנונים האבולוציה של תכונות מורכבות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה שונים מניפולציות ביטוי גנים ב- mexicanus א. גישות כוללים את השימוש morpholinos, Tol2 transgenesis, מערכות עריכה-ג'ין, בדרך כלל בשימוש דג זברה ודגים אחרים מודלים, לתמרן פונקצית ג'ין mexicanus א. פרוטוקולים אלה כוללים תיאורים מפורטים של תהליכי הרבייה מתוזמן, איסוף הביצים, זריקות, הבחירה של בעלי חיים מהונדסים. אלה גישות מתודולוגיים יאפשר לחקירת גנטי והעצבים המנגנונים האבולוציה של תכונות מגוונות ב- mexicanus א.

מספר אוכלוסיות של שוכני המערה mexicanus א מראים שינה מופחתת ערות/פעילות מוגברת יחסית שלהם בני מינו של השטח-דיור14. Hypocretin/orexin (HCRT) neuropeptide שנשמרת מאוד, אשר פועל להגברת ערנות, שיבושים HCRT בשביל לגרום narcolepsy בני אדם אחרים47,יונקים48. בעבר הראו המערה mexic...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח - ואת מערת המגורים טפסים.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

חיות מערות מספקות מערכת משכנעת לחקירת תכונות מורפולוגיות, התפתחותיות והתנהגותיות מגוונות. אבל אחד הגורמים המגבילים בהקמת מערכת מודל זו הוא מחסור בכלים גנטיים שיאפשרו לנו לתפעל את תפקוד הגנים. כאן אנו מדגימים שלוש גישות שונות כדי לתפעל את תפקוד הגנים דג המערה המקסיקני, Astyanax מקסיקניוס.כלים אלה יאפשרו את חקירת הגנים שבבסיס הווריאציות הטבעיות בין דגי פני השטח לבין דגי המערה וכיצד הם מתייחסים לפנוטיפים. בת'אני סטול, פוסט-דוק מוכשר במעבדה שלי ידגים את ההליך הזה. לפני תחילת ההליך, למלא צלחת פטרי 100 מיליליטר עם חם 3% agarose מומס במים מערכת הדגים בזהירות למקם עובש הזרקת ביצה לתוך אגרוז בזווית של 45 מעלות, לפני לאט להוריד את התבנית לתוך התעוררות כדי למנוע לכידת אוויר מתחת לתבנית.כאשר התעוררות התגבשה, להסיר בזהירות את התבנית ולאחר מכן לאחסן את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. לאחר מכן למשוך מחטים נימי זכוכית borosilicate ו מושך מחט אלקטרודה על פי הנחיות היצרן. ביום ההזרקה, השתמש פיפטה זכוכית להעביר ביצים תא יחיד לתוך צלחת ההזרקה, מילוי עד חמש שורות של צלחת ההזרקה עם 30 עד 40 ביצים לכל שורה.שמור את הביצים hydrated עם כמות קטנה של מים מערכת דגים. להפשיר מורפולינו על קרח ולהכין את פתרון ההזרקה כך 400 picograms של מורפולינו מוזרק לכל ביצה באמצעות קצה פיפטה Microloader ארוך או הוספת בולוס שניים עד ארבעה מיקרוליטר עד הסוף. כאשר כל המחטים נטענו, השתמש בממטרים כדי לקצץ את האורך העודף מקצות מחט ההזרקה ולהרים את המחט הראשונה לתוך מיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מינג'קטור פיקוליטר.לאחר מכן, מניחים את צלחת ההזרקה תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהשתמש micromanipulator לחדור כל ביצה עם המחט לפני הזרקת ננוליטר אחד של פתרון הזרקת מורפולינו ישירות לתוך החלמון. להזרקת CRISPR, יש לערבב 25 פיקוגרמות של RNA מנחה עם 300 פיקוגרמות של חלבון 9 שליח RNA הקשור ל-CRISPR ולהזריק שני ננוליטרים של תותר ה-RNA שנוצר לכל עובר כפי שהוכח. עבור טול2 טרנספוזאז ו Tol2 אגף הזרקת פלסמיד, לשלב 25 ננוגרם לכל microliter של RNA שליח Tol2 עם 25 ננוגרם לכל microliter של Tol2 מבנה פלסמיד ו פנול אדום במים נטולי RNase.ואז להזריק ננוליטר אחד של פתרון לתוך כל עובר כפי שהוכח רק. כדי לסנן את בעלי החיים שהוזרקו למורפולינו בארבעה ימים לאחר הזרקתם, בהתאם לגן המעניין, דמיינו את זחלי הדגים תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לבחון את הפנוטיפ של בעלי החיים המוזרקים או את הקלטת הווידאו כדי למדוד התנהגות. כדי לסנן עבור אינדלי CRISPR, להעביר עוברים מוזרקים CRISPR לתוך צינורות PCR ולחלץ את ה-DNA על פי פרוטוקולי מיצוי DNA סטנדרטיים לתגובת שרשרת פולימראז או ניתוח PCR.כדי להעריך עבור mutagenesis, להפעיל חמישה microliters של המוצר PCR על ג'ל 3%agarose ב 70 וולט במשך שלוש שעות. דנ"א פראי ולא מוטגני יגרום ללהקה מובחנת, בעוד שדנ"א מוטנטי יגרום לרצועה מרוחה. מערה מקסיקניוס מוזרק עם מורפולינו שליטה מציג באופן משמעותי יותר פעילות לוקומוטורית ושינה מופחתת על פני תקופה של 24 שעות, לעומת דגים פני השטח מוזרק עם מורפולינו מקושקשות.הזרקת hypocretin orexin Morpholino יש השפעה מועטה על שינה בדגים פני השטח לעומת דגים מוזרק שליטה. לעומת זאת, היפוקרטין orexin נוקאאוט באמצעות הזרקת מורפולינו יש השפעה משמעותית על שינה בדגים שוכני מערה, מתן קשר ישיר בין ביטוי hypocretin orexin ואובדן שינה. מוטציה מתווכה CRPSR של הגן לבקנות OCA2 בדגים פני השטח תוצאות אנשים מסוימים homozygous עבור סוג הבר OCA2 אלל חיובי, והוא קשור מחסה פיגמנטציה, ואילו אנשים שיש להם שני עותקים של אלל OCA2 מוטציה CRISPR הם לבקן, מתן קשר ישיר בין הגן OCA2 מוטציה לבקנות בדגים מערה.בחר חיובי של F0 עבור הטרנסג'נדר המשודר Tol2 כדי לחצות בחזרה לסוג הפראי כדי ליצור קווי F1 יציבים. זה מאפשר הדמיה סידן חי לחשיפת הבדלים בפעילות העצבית, תיווך שינויים התנהגותיים בסביבת המערה, הנחת היסודות לביטוי של מהומשים רבים נוספים כדי לאפיין ולתפעל תפקוד גנים במקסיקו. הדברים החשובים ביותר לזכור הם לטעון את הביצים בחוזקה על הצלחת, לקצץ את המחט כראוי, כדי לייעל את microinjection.לאחר הפלה גנטית מוצלחת, אינטגרציה טרנסג'נדרית או עריכת גנים בתווך CRISPR, ניתן להשתמש בדגים אלה לניתוחים התפתחותיים, התנהגותיים ופעילות מוחית.

manipulation-of-gene-function-in-mexican-cavefish

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

Culturing ומניפולציה של תאי הרכס העצבי O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

גידול של טטרה מקסיקנית Astyanax mexicanus עבור ניתוח של Post-larval פנוטיפים ואת כולה-הר אימונוהיסטוכימיה

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...