Name: manipulation of gene function in mexican cavefish
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

लेखक sunishka ठाकुर जीनोटाइपिंग और इमेजिंग oca2 उत्परिवर्ती मछली में उसकी सहायता के लिए धंयवाद चित्रा 2में चित्रित । इस काम के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) पुरस्कार १६५६५७४ से A.C.K., जे और A.C.K. को NSF पुरस्कार १७५४३२१, और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) पुरस्कार R21NS105071 A.C.K. और E.R.D. के लिए समर्थन किया था

1. morpholino oligo डिजाइन
नोट: ए mexicanus के लिए दृश्यों जैव प्रौद्योगिकी सूचना के राष्ट्रीय केंद्र (Ncbi) जीन और NCBI एसआरए (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) के माध्यम से उपलब्ध हैं, साथ ही साथ Ensembl जीनोम ब्राउज़र (https://www.ensembl.org) से । दोनों स...

यहाँ, हम morpholinos का उपयोग कर जीन समारोह में हेरफेर के लिए एक पद्धति प्रदान की, CRISPR/Cas9 जीन संपादन, और transgenesis पद्धति. आनुवंशिक प्रौद्योगिकी के धन और zebrafish में इन पद्धतियों के अनुकूलन की संभावना को कम५२के सा?...

1 प्रजातियों के डार्विन मूलके बाद से, वैज्ञानिकों में गहन अंतर्दृष्टि प्राप्त की है कि कैसे लक्षण विकास परिभाषित पर्यावरण और पारिस्थितिक दबाव, गुफा जीवों2के लिए धंयवाद के रूप में आकार रहे हैं । मैक्सिकन tetra, ए mexicanus, है ' पैतृक ' सतह आबादी है कि मेक्सिको और दक्षिणी टेक्सास भर में नदियों निवास और कम से दूर 29 व्युत्पंन गुफा morphs की भौगोलिक दृष्टि से अलग आबादी के होते है सिएरा डेल abra inhabiting और पूर्वोत्तर मेक्सिको3के अंय क्षेत्रों । एक कई गुफा से जुड़े लक्षण एक. mexicanusमें, बदल ऑक्सीजन की खपत, depigmentation, आंखों की हानि, और बदल खिला और foraging व्यवहार सहित की पहचान की गई है4,5,6, 7,8,9. ए mexicanus एक अच्छी तरह से परिभाषित विकासवादी इतिहास, पारिस्थितिक पर्यावरण के एक विस्तृत लक्षण वर्णन के कारण अभिसरण विकास के तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रस्तुत करता है, और स्वतंत्र रूप से विकसित गुफा की उपस्थिति आबादी10,11। गुफा के कई लक्षण है कि cavefish में मौजूद हैं, आंख की हानि, नींद की कमी, वृद्धि खिला, स्कूली शिक्षा के नुकसान, कम आक्रामकता, और कम तनाव की प्रतिक्रियाएं शामिल हैं, स्वतंत्र मूल के माध्यम से कई बार विकसित किया है, अक्सर उपयोग गुफा8,12,13,14,15के बीच विभिन्न आनुवंशिक रास्ते । यह दोहराया विकास ए mexicanus प्रणाली का एक शक्तिशाली पहलू है और कैसे आनुवंशिक प्रणाली के लिए समान phenotypes उत्पंन क्षुब्ध हो सकता है के अधिक सामांय प्रश्न में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।
जबकि जीन समारोह की यंत्रवादी जांच के लिए आनुवंशिक प्रौद्योगिकी के आवेदन कई मछली प्रजातियों में सीमित किया गया है ( ए mexicanusसहित), zebrafish में हाल ही में अग्रिमों मछली में आनुवंशिक प्रौद्योगिकी के विकास के लिए एक आधार प्रदान 16,17,18,19,20। कई उपकरण व्यापक रूप से जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए zebrafish में इस्तेमाल कर रहे हैं, और इन प्रक्रियाओं के कार्यांवयन के लंबे समय मानकीकृत किया गया है । उदाहरण के लिए, एक कोशिका चरण चुनिंदा ब्लॉकों आरएनए पर morpholino oligos (MOs) के इंजेक्शन और विकास के दौरान एक संक्षिप्त अस्थाई खिड़की के लिए अनुवाद से बचाता है21,22। इसके अलावा, जीन संपादन दृष्टिकोण, जैसे संकुल नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (CRISPR)/CRISPR-associated प्रोटीन 9 (Cas9) और ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक जैसे effector न्यूक्लेज (TALEN), परिभाषित विलोपन की पीढ़ी के लिए अनुमति या, कुछ मामलों में,19,20,23,24जीनोम में एक पुनर्संयोजन के माध्यम से निवेशन । पारजनन का उपयोग कोशिका-प्रकार विशिष्ट तरीके से स्थिर जीन व्यंजक या फलन में हेरफेर करने के लिए किया जाता है । Tol2 प्रणाली का प्रयोग ट्रांसजेनिक जानवरों को एक Tol2 डीएनए प्लाज्मिड जिसमें ट्रांसजीन25,26शामिल है Tol2 प्रणाली medaka के Tol2 transposase का इस्तेमाल करने के लिए ट्रांसजेनिक construct17 के स्थिर कोशिका जो जर्मलाइन निवेशन उत्पंन करते हैं । Tol2 पराजीनी एक प्लाज्मिड Tol2 एकीकरण साइटों और Tol2 transposase17के लिए mrna द्वारा flanked युक्त coinjecting शामिल है । इस प्रणाली के लिए zebrafish में ट्रांसजेनिक लाइनों की एक सरणी उत्पंन इस्तेमाल किया गया है और इसके उपयोग हाल ही में अतिरिक्त आपात मॉडल सिस्टम को विस्तारित, सहित चिचिल्ड, killifish, stickleback, और, और हाल ही में, मैक्सिकन cavefish27, 28,29,30।
जबकि cavefish विशेषता विकास के तंत्र elucidating के लिए एक आकर्षक जैविक प्रणाली है, एक विकासवादी मॉडल के रूप में अपनी पूरी क्षमता पूरी तरह से इस्तेमाल नहीं किया गया है । यह आंशिक रूप से एक आनुवंशिक और सेलुलर समारोह सीधे हेरफेर करने में असमर्थता के कारण किया गया है31। उम्मीदवार जीन को विनियमित जटिल लक्षण मात्रात्मक विशेषता loci (qtl) अध्ययन का उपयोग कर की पहचान की गई है, लेकिन इन उंमीदवार जीन के सत्यापन मुश्किल गया है३२,३३,३४। हाल ही में, क्षणिक पछाड़ना morpholinos का उपयोग कर, जीन संपादन crispr और talen सिस्टम का उपयोग कर, और Tol2-mediated transgenesis के उपयोग के लिए आनुवंशिक लक्षण की संख्या में अंतर्निहित आधार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है३५,३६,३७ ,३८. कार्यांवयन और इन तकनीकों के मानकीकरण के जोड़तोड़ कि आणविक और जैविक लक्षण के तंत्रिका मद जीन समारोह के हेरफेर, परिभाषित सेल आबादी के लेबल सहित, पूछताछ के लिए अनुमति देगा और फंक्शनल रिपोर्टर्स की अभिव्यक्ति । जबकि जीन या सेलुलर समारोह में हेरफेर करने के लिए इन आनुवंशिक उपकरणों के सफल कार्यांवयन आपात मॉडल प्रणालियों में प्रदर्शन किया गया है, विस्तृत प्रोटोकॉल अभी भी एक. mexicanusमें कमी कर रहे हैं ।
ए मेक्सिकैनस एक बदलते वातावरण के जवाब में विकास के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते है और उपंयास विविध लक्षण विनियमन जीन की पहचान करने का अवसर प्रस्तुत करते हैं । कई कारकों का सुझाव है कि एक. mexicanus स्थापित जीनोमिक उपकरण स्थापित आनुवंशिक मॉडल में वर्तमान में उपलब्ध है, आसानी से प्रयोगशालाओं में मछली को बनाए रखने की क्षमता सहित लागू करने के लिए एक बहुत ही सुविधाजनक मॉडल है, बड़े चिंता आकार, पारदर्शिता, एक sequenced जीनोम, और परिभाषित व्यवहार३९assays हैं । यहां, हम morpholinos के उपयोग के लिए एक पद्धति का वर्णन, transgenesis, और सतह और एक. mexicanusकी गुफा आबादी में जीन संपादन । एक. mexicanus में इन उपकरणों के व्यापक आवेदन विकास, शारीरिक, और cavefish और सतह मछली के बीच व्यवहार के अंतर के विकास के अंतर्निहित आणविक प्रक्रियाओं में एक यंत्रवादी जांच के लिए अनुमति देगा ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish breeding &#38; egg supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine mesh fish net</td>
			<td style="width:196px;">Penn Plax</td>
			<td style="width:191px;">BN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fish tank heater</td>
			<td style="width:196px;">Aqueon</td>
			<td style="width:191px;">100106108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg traps</td>
			<td style="width:196px;">Custom made</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td>Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette bulbs</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">03-448-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Egg molds</td>
			<td style="width:196px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:191px;">TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Morpholino supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">Standard control olio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Morpholino</td>
			<td style="width:196px;">Gene Tools, LLC</td>
			<td style="width:191px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:196px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPR supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Plasmid</td>
			<td style="width:196px;">AddGene</td>
			<td style="width:191px;">46757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:196px;">Promega</td>
			<td style="width:191px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KOD Hot Start Taq</td>
			<td style="width:196px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:191px;">71-842-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:196px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:191px;">Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T7 Megascript Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine T3 kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tol2 transgenesis supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCS-zT2TP plasmid</td>
			<td style="width:196px;">Kawakami et al., 2004</td>
			<td style="width:191px;">Request from senior author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td style="width:196px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR purification Kit</td>
			<td style="width:196px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP6 mMessenger Kit</td>
			<td style="width:196px;">Ambion/Thermofisher</td>
			<td style="width:191px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">BF100-58-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette puller</td>
			<td style="width:196px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:191px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Picoinjector</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:191px;">PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator Stand</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micmanipulator Base</td>
			<td style="width:196px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:191px;">Steel Plate Base, 10 lbs</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of gene function in mexican cavefish

गुफा जानवरों के विकासवादी तंत्र और आनुवंशिकी आंख अध: पतन, albinism, नींद की कमी, hyperphagia, और संवेदी प्रसंस्करण सहित कई जटिल लक्षण में परिवर्तन अंतर्निहित अड्डों की जांच के लिए एक संमोहक प्रणाली प्रदान करते हैं । दुनिया भर से cavefish की प्रजातियों रूपात्मक और व्यवहार अलग गुफा प्रणालियों के बीच साझा पर्यावरण के दबाव के कारण लक्षण के अभिसरण विकास प्रदर्शित करते हैं । प्रयोगशाला की स्थापना में विविध गुफा प्रजातियों का अध्ययन किया गया है । देखा और अंधा रूपों के साथ मैक्सिकन टेट्रा, Astyanax mexicanus, जैविक और आणविक जटिल लक्षण के विकास अंतर्निहित प्रक्रियाओं में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है और अच्छी तरह से एक उभरते मॉडल प्रणाली के रूप में तैयार है । हालांकि विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के विकास को विनियमित करने वाले उम्मीदवार जीन की पहचान मेक्सिकैनस में की गई है, लेकिन व्यक्तिगत जीन के लिए एक भूमिका को मान्य करने की क्षमता सीमित कर दी गई है । Transgenesis और जीन संपादन प्रौद्योगिकी के आवेदन के लिए इस महत्वपूर्ण बाधा को दूर करने और जटिल लक्षण के विकास के अंतर्निहित तंत्र की जांच करने की क्षमता है । यहां, हम एक. mexicanusमें जीन अभिव्यक्ति हेरफेर के लिए एक अलग पद्धति का वर्णन । दृष्टिकोण morpholinos का उपयोग, Tol2 transgenesis, और जीन संपादन प्रणाली, सामांयतः zebrafish और अंय मछली के मॉडल में इस्तेमाल किया, एक. mexicanusमें जीन समारोह में हेरफेर शामिल हैं । इन प्रोटोकॉल समय पर प्रजनन प्रक्रियाओं के विस्तृत विवरण शामिल हैं, निषेचित अंडे का संग्रह, इंजेक्शन, और आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं के चयन । इन methodological दृष्टिकोण आनुवंशिक और तंत्रिका एक. mexicanusमें विविध लक्षण के विकास के अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए अनुमति देगा ।

गुफा में रहने वाले एक से अधिक आबादी एक मेक्सिकानस कम नींद और वृद्धि हुई जागना/गतिविधि उनके सतह पर रहने वाले conबारीकियों के सापेक्ष14। Hypocretin/orexin (hcrt) एक अत्यधिक संरक्षित neuropeptide है, जो जागृत करने के ल?...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish at JoVE.com

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

हम विकासवादी मॉडल प्रणाली Astyanax mexicanusमें जीन के हेरफेर के लिए दृष्टिकोण का वर्णन । तीन विभिंन तकनीकों का वर्णन कर रहे हैं: Tol2-mediated transgenesis, जीनोम के लक्षित हेरफेर CRISPR का उपयोग कर/ इन उपकरणों से सतह और गुफा में रहने वाले रूपों के बीच अंतर के अंतर्निहित जीन की प्रत्यक्ष जांच की सुविधा होनी चाहिए ।

मैक्सिकन Cavefish में जीन समारोह के हेरफेर

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

गुफा जानवर विविध रूपात्मक, विकासात्मक और व्यवहार लक्षणों की जांच के लिए एक सम्मोहक प्रणाली प्रदान करते हैं। लेकिन इस मॉडल प्रणाली की स्थापना में सीमित कारकों में से एक आनुवंशिक उपकरणों की कमी है कि हमें जीन समारोह में हेरफेर करने की अनुमति होगी । यहां हम मैक्सिकन गुफा मछली, Astyanax मैक्सिकनस में जीन समारोह में हेरफेर करने के लिए तीन अलग-अलग दृष्टिकोणों का प्रदर्शन करते हैं।इन उपकरणों से सतह मछली और गुफा मछली के बीच प्राकृतिक विविधताओं में अंतर्निहित जीन की जांच और वे फेनोटाइप से कैसे संबंधित होंगे । बैकसे Stahl, मेरी प्रयोगशाला में एक प्रतिभाशाली पोस्टडॉक इस प्रक्रिया को प्रदर्शित करेगा । प्रक्रिया शुरू करने से पहले, गर्म 3% के साथ एक 100 मिलीलीटर पेट्री डिश भरें मछली प्रणाली के पानी में भंग हो गए और मोल्ड के नीचे हवा फंसाने से बचने के लिए धीरे-धीरे एगर उठी में एक अंडा इंजेक्शन मोल्ड रखें।जब agarose जम गया है, ध्यान से मोल्ड हटा तो एक सप्ताह तक के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर थाली की दुकान । फिर निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं और एक इलेक्ट्रोड सुई खींचने से सुई खींचें। इंजेक्शन के दिन, इंजेक्शन प्लेट में एकल सेल अंडे स्थानांतरित करने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें, इंजेक्शन प्लेट की पांच पंक्तियों को 30 से 40 अंडे प्रति पंक्ति के साथ भरें।अंडे को थोड़ी मात्रा में फिश सिस्टम के पानी से हाइड्रेटेड रखें। बर्फ पर गल Morpholino और इंजेक्शन समाधान तैयार इतना है कि Morpholino के ४०० पिकोग्राम एक लंबे माइक्रोलोडर पिपेट टिप का उपयोग करके या अंत करने के लिए एक दो से चार माइक्रोलीटर बोलस जोड़ने के द्वारा प्रति अंडे इंजेक्शन है । जब सभी सुइयों को लोड किया गया है, तो इंजेक्शन सुई युक्तियों से अतिरिक्त लंबाई को ट्रिम करने के लिए संदंश का उपयोग करें और पहली सुई को एक पिकालिएटर माइक्रोइंजेक्टर से जुड़े माइक्रोमैनीपुलेटर में माउंट करें।फिर, इंजेक्शन डिश को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और मॉर्फोलिनो इंजेक्शन समाधान के एक नैनोलीटर को सीधे जर्दी में इंजेक्शन लगाने से पहले सुई के साथ प्रत्येक अंडे को प्रवेश करने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करें। CRISPR इंजेक्शन के लिए, CRISPR से जुड़े प्रोटीन 9 मैसेंजर आरएनए के 300 पिकोग्राम के साथ गाइड आरएनए के 25 पिकोग्राम मिलाएं और प्रत्येक भ्रूण में परिणामी आरएनए समाधान के दो नैनोलीटर इंजेक्ट करें जैसा कि प्रदर्शन किया गया है। Tol2 ट्रांसपोसेस और टोल2 फ्लैंक्ड प्लाज्मिड इंजेक्शन के लिए, टोल2 मैसेंजर आरएनए के 25 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर के साथ 25 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर जोड़ें, जो टोल2 प्लाज्मिड निर्माण के माइक्रोलीटर और आरएनएनई-मुक्त पानी में फिनॉल लाल हैं।फिर प्रत्येक भ्रूण में समाधान के एक नैनोलीटर इंजेक्ट के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया । चार दिनों के बाद इंजेक्शन पर Morpholino इंजेक्शन जानवरों स्क्रीन करने के लिए, ब्याज के जीन के आधार पर, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत मछली लार्वा कल्पना करने के लिए इंजेक्शन जानवरों या वीडियो रिकॉर्ड के फेनोटाइप का पालन करने के लिए व्यवहार को मापने के लिए । CRISPR indels के लिए स्क्रीन करने के लिए, CRISPR-इंजेक्शन भ्रूण पीसीआर ट्यूबों में स्थानांतरित करने और बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया या पीसीआर विश्लेषण के लिए मानक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए निकालने ।म्यूटेनेसिस के लिए आकलन करने के लिए, पीसीआर उत्पाद के पांच माइक्रोलीटर को तीन घंटे के लिए 70 वोल्ट पर 3% एगरेज जेल पर चलाएं। जंगली प्रकार, गैर-उत्परिवर्तनीय डीएनए के परिणामस्वरूप एक अलग बैंड होगा, जबकि उत्परिवर्ती डीएनए का परिणाम एक धब्बा बैंड होगा। गुफा एक नियंत्रण मॉर्फोलिनो के साथ इंजेक्शन एक मैक्सिकनस काफी अधिक लोकोमोटर गतिविधि और एक 24 घंटे की अवधि में कम नींद प्रदर्शित करता है, सतह मछली की तुलना में एक तले हुए Morpholino के साथ इंजेक्शन ।हाइपोक्रेटिन ओरेक्सिन मॉर्फोलिनो के इंजेक्शन का नियंत्रण-इंजेक्शन मछली की तुलना में सतह मछली में नींद पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है। इसके विपरीत, मॉर्फोलिनो इंजेक्शन के माध्यम से हाइपोक्रेटिन ओरेक्सिन नॉकडाउन का गुफा में रहने वाली मछली में नींद पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, जो हाइपोक्रेटिन ओरेक्सिन अभिव्यक्ति और नींद की हानि के बीच सीधा संबंध प्रदान करता है। सतह मछली में एल्बिनिज्म जीन OCA2 के CRPSR-मध्यस्थता म्यूटेनेसिस के परिणामस्वरूप कुछ व्यक्तियों में जंगली प्रकार OCA2 सकारात्मक एलील के लिए होमोज़िगस होता है, और पिगमेंटेशन को शरण देने से जुड़ा होता है, जबकि जिन व्यक्तियों में CRISPR-उत्परिवर्तित OCA2 नकारात्मक एलील की दो प्रतियां होती हैं, वे एल्बिनो हैं, जो मछली में उत्परिवर्ती OCA2 जीन और एल्बिनिज्म के बीच सीधा संबंध प्रदान करते हैं।Tol2 प्रेषित ट्रांसजीन के लिए F0 के सकारात्मक का चयन करें जंगली प्रकार के लिए वापस पार करने के लिए स्थिर F1 लाइनों उत्पंन करने के लिए । यह न्यूरोनल गतिविधि में अंतर को उजागर करने, गुफा के वातावरण में व्यवहार परिवर्तनों में मध्यस्थता करने, मैक्सिकनस में जीन फ़ंक्शन की विशेषता और हेरफेर करने के लिए कई अतिरिक्त ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति के लिए आधार बिछाने के लिए लाइव कैल्शियम इमेजिंग को सक्षम बनाता है। याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण चीजें अंडे को प्लेट पर कसकर लोड करना, सुई को ठीक से ट्रिम करना और माइक्रोइंजेक्शन को अनुकूलित करना है।एक सफल आनुवंशिक नॉकडाउन, ट्रांसजीन एकीकरण, या CRISPR-मध्यस्थता जीन संपादन के बाद, इन मछलियों का उपयोग विकास, व्यवहार और मस्तिष्क गतिविधि विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

manipulation-of-gene-function-in-mexican-cavefish

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

संयंत्र पैथोजन की आनुवंशिक हेरफेर<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; फफूंद जीवविज्ञान और संयंत्र सूक्ष्म जीव बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

मानव प्राथमिक सेल संस्कृतियों में circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन के स्राव के समानांतर मापन

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

पालन ​​और मिटायें बीटल में डबल असहाय शाही सेना की मध्यस्थता जीन पछाड़ना,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

एक मानक पद्धति पर जांच करने के लिए साइट Mutagenicity के एक समारोह के रूप में बिंदु उत्परिवर्तन मरंमत Catalyzed द्वारा CRISPR/Cas9 और SsODN मानव कोशिकाओं में

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

जीन क्लोनिंग के बिना एक जीन-बाधित स्ट्रेप्टोकोकस mutans तनाव की पीढ़ी

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Caenorhabditis एलिगेंस में Ploidy का हेरफेर

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान मानव जीन समारोह का आकलन करने के लिए माउस अंडाणुओं का प्रयोग I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

संवर्धन और हेरफेर के O9-1 तंत्रिका शिखा कोशिकाओं

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

पोस्ट-लार्वा Phenotypes और पूरे-माउंट Immunohistochemistry के विश्लेषण के लिए मैक्सिकन टेट्रा Astyanax mexicanus स्थापना

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo आवेदन में

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...